目的建立一种高效、精准的DNA条形码技术准确快速鉴定鱼胶物种。方法以细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,COI)基因为靶标,筛选并优化DNA条形码引物,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和Sanger测...目的建立一种高效、精准的DNA条形码技术准确快速鉴定鱼胶物种。方法以细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,COI)基因为靶标,筛选并优化DNA条形码引物,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和Sanger测序评估其鉴定效果。对市售鱼胶样品进行特异性扩增,结合生命条形码数据系统(barcode of life data systems,BOLD)和美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)数据库进行物种比对,并采用邻接法(neighbor-joining,NJ)和系统发育树分析验证鉴定结果。结果通过筛选8对COI基因微型DNA条形码引物,最终确定了一组扩增目标片段约190 bp的引物组合,其PCR测序成功率达100%,物种鉴定准确率达98.15%。基于该引物对16份鱼胶样品的鉴定结果显示,仅56.25%的样本与标注物种一致,其中不符样品主要是鳘鱼胶和白花胶,鉴定阈值设为95%。进一步通过NJ分析和系统发育树构建,证实鱼胶样品的系统发育关系与BOLD/NCBI数据库比对结果高度一致,验证了鉴定结果的可靠性。结论本研究成功筛选出适用于鱼胶微型DNA条形码鉴定的引物,为鱼胶产品的真伪鉴别和质量控制提供了高效、可靠的技术手段。展开更多
常用的基因治疗表达载体有病毒表达载体和质粒表达载体,这两类传统基因治疗载体含有大量病毒或细菌DNA序列,会引发人体较严重的免疫反应、细胞炎症、细胞毒性副作用、以及基因表达沉默化,是基因治疗应用于人类疾病治疗的一大障碍。项目...常用的基因治疗表达载体有病毒表达载体和质粒表达载体,这两类传统基因治疗载体含有大量病毒或细菌DNA序列,会引发人体较严重的免疫反应、细胞炎症、细胞毒性副作用、以及基因表达沉默化,是基因治疗应用于人类疾病治疗的一大障碍。项目构建了一种新型的、基于腺相关病毒(AAV)倒置末端重复序列(ITR)的基因表达单链微载体(AAV-ITR mini vector),并用GFP基因作为报告基因。通过热变性的方法制备单链DNA,然后将带有GFP的质粒、双链DNA载体、AAV-ITR基因表达微载体转入真核表达细胞,采用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测等较为简单的方法来检测其表达效率。实验结果显示,AAV-ITR基因表达微载体在293T细胞中具有较高的转染、表达效率,并且具有类似AAV病毒载体的特性。该研究结果将有助于进一步研发类似于AAV病毒载体的安全、无免疫原性的人造基因治疗载体。展开更多
目的:研究在非小细胞肺癌及癌旁组织中ceacam1通过选择性拼接而产生的两种转录产物的调控机制。方法:将用PCR方法获得ceacam1基因中从内含子5至外显子8长1 606 bp DNA片段插入到真核表达载体pCMV中,构建成ceacam1迷你基因模型并与ptb基...目的:研究在非小细胞肺癌及癌旁组织中ceacam1通过选择性拼接而产生的两种转录产物的调控机制。方法:将用PCR方法获得ceacam1基因中从内含子5至外显子8长1 606 bp DNA片段插入到真核表达载体pCMV中,构建成ceacam1迷你基因模型并与ptb基因共转染,用PCR法鉴定转染后的产物变化;根据外显子7序列设计的探针GAE(16-nt)及ACE(8-nt)进行凝胶阻滞分析实验。分离与探针结合的蛋白并进行质谱分析。结果:ptb3种cDNA与ceacam1迷你基因共转染后,CEACAM lL表达水平下降,其中ptb4对迷你基因的表达产物影响最大。仅转染迷你基因的细胞中ceacam1L在两条带中所占比例为76.7%,而与ptb3种重组质粒共转染后,比例分别下降至58.3%、64.8%和54.0%。凝胶阻滞实验表明,探针GAE能与核蛋白结合,而ACE基本不能与核蛋白结合,与GAE结合的蛋白经质谱分析为PTB。结论:PTB过表达与ceacam1低表达有明显的相关性,拼接因子PTB参与ceacam1的选择性拼接。展开更多
文摘目的建立一种高效、精准的DNA条形码技术准确快速鉴定鱼胶物种。方法以细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,COI)基因为靶标,筛选并优化DNA条形码引物,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和Sanger测序评估其鉴定效果。对市售鱼胶样品进行特异性扩增,结合生命条形码数据系统(barcode of life data systems,BOLD)和美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)数据库进行物种比对,并采用邻接法(neighbor-joining,NJ)和系统发育树分析验证鉴定结果。结果通过筛选8对COI基因微型DNA条形码引物,最终确定了一组扩增目标片段约190 bp的引物组合,其PCR测序成功率达100%,物种鉴定准确率达98.15%。基于该引物对16份鱼胶样品的鉴定结果显示,仅56.25%的样本与标注物种一致,其中不符样品主要是鳘鱼胶和白花胶,鉴定阈值设为95%。进一步通过NJ分析和系统发育树构建,证实鱼胶样品的系统发育关系与BOLD/NCBI数据库比对结果高度一致,验证了鉴定结果的可靠性。结论本研究成功筛选出适用于鱼胶微型DNA条形码鉴定的引物,为鱼胶产品的真伪鉴别和质量控制提供了高效、可靠的技术手段。
文摘常用的基因治疗表达载体有病毒表达载体和质粒表达载体,这两类传统基因治疗载体含有大量病毒或细菌DNA序列,会引发人体较严重的免疫反应、细胞炎症、细胞毒性副作用、以及基因表达沉默化,是基因治疗应用于人类疾病治疗的一大障碍。项目构建了一种新型的、基于腺相关病毒(AAV)倒置末端重复序列(ITR)的基因表达单链微载体(AAV-ITR mini vector),并用GFP基因作为报告基因。通过热变性的方法制备单链DNA,然后将带有GFP的质粒、双链DNA载体、AAV-ITR基因表达微载体转入真核表达细胞,采用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测等较为简单的方法来检测其表达效率。实验结果显示,AAV-ITR基因表达微载体在293T细胞中具有较高的转染、表达效率,并且具有类似AAV病毒载体的特性。该研究结果将有助于进一步研发类似于AAV病毒载体的安全、无免疫原性的人造基因治疗载体。
文摘目的:研究在非小细胞肺癌及癌旁组织中ceacam1通过选择性拼接而产生的两种转录产物的调控机制。方法:将用PCR方法获得ceacam1基因中从内含子5至外显子8长1 606 bp DNA片段插入到真核表达载体pCMV中,构建成ceacam1迷你基因模型并与ptb基因共转染,用PCR法鉴定转染后的产物变化;根据外显子7序列设计的探针GAE(16-nt)及ACE(8-nt)进行凝胶阻滞分析实验。分离与探针结合的蛋白并进行质谱分析。结果:ptb3种cDNA与ceacam1迷你基因共转染后,CEACAM lL表达水平下降,其中ptb4对迷你基因的表达产物影响最大。仅转染迷你基因的细胞中ceacam1L在两条带中所占比例为76.7%,而与ptb3种重组质粒共转染后,比例分别下降至58.3%、64.8%和54.0%。凝胶阻滞实验表明,探针GAE能与核蛋白结合,而ACE基本不能与核蛋白结合,与GAE结合的蛋白经质谱分析为PTB。结论:PTB过表达与ceacam1低表达有明显的相关性,拼接因子PTB参与ceacam1的选择性拼接。
