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麻疹病毒沪191株反向遗传系统的建立 被引量：4
1
作者 张勇侠 李玫颖 +4 位作者 陈宗香 李竹石 杨小勇 范凤鸣 刘兰军 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期565-571,共7页
建立麻疹病毒沪191株(MV-_(S191))反向遗传系统。提取MV-_(S191)的RNA,RT-PCR分7段扩增出麻疹病毒反基因组cDNA,通过酶切、连接,拼接出MV-_(S191)全长反基因组,并分别在其3′端和5′端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRZ)和锤头核酸酶序列(... 建立麻疹病毒沪191株(MV-_(S191))反向遗传系统。提取MV-_(S191)的RNA,RT-PCR分7段扩增出麻疹病毒反基因组cDNA,通过酶切、连接,拼接出MV-_(S191)全长反基因组,并分别在其3′端和5′端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRZ)和锤头核酸酶序列(HamRZ),克隆到pT7-MCS载体,获得pT7MV_(S191)。在MV-_(S191)的P-M基因间区域插入绿色荧光蛋白(GFP),获得pT7MV_(S191)-ATU-GFP,同时构建表达麻疹病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的3个辅助质粒。将pT7MV_(S191)、pT7MV_(S191)-ATU-GFP分别与辅助质粒通过脂质体介导共转染BSRT7细胞,热休克3h。转染3d后,取上清,感染Vero-SLAM细胞。经RT-PCR、显微镜检测绿色荧光蛋白表达及合胞体形成,在该系统中成功拯救到两种有感染活性的病毒。成功建立了MV-_(S191)的反向遗传系统,为以麻疹病毒为载体进行新疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 mv-s191 反向遗传 T7RNA聚合酶 绿色荧光蛋白(GFP)
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重组麻疹病毒沪191株反向遗传系统的建立 被引量：1
2
作者 杨志辉 裴捷 +1 位作者 郭靖 申硕 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2023年第6期637-642,649,共7页
目的构建麻疹减毒病毒(Measles virus,MV)沪191(MV-S191)株感染性cDNA,以绿色荧光蛋白(eGFP)为靶标,选择外源基因插入区域,建立反向遗传系统重组病毒载体疫苗技术平台。方法提取MV-S191基因组RNA,逆转录获得cDNA,以PCR法分8段扩增麻疹... 目的构建麻疹减毒病毒(Measles virus,MV)沪191(MV-S191)株感染性cDNA,以绿色荧光蛋白(eGFP)为靶标,选择外源基因插入区域,建立反向遗传系统重组病毒载体疫苗技术平台。方法提取MV-S191基因组RNA,逆转录获得cDNA,以PCR法分8段扩增麻疹病毒全长基因组cDNA,通过Gibson法连接各片段构建全长基因组cDNA,并将其克隆至pBR322质粒,获得pMV-S191。在pMV-S191的P、M或H、L基因间区域插入eGFP,获得pMV2-eGFP、pMV3-eGFP。同时构建pcDNA-N、P、L3个辅助质粒分别表达麻疹病毒核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)和依赖RNA的RNA聚合酶(L)。将pMV-S191、pMV2-EGFP和pMV3-EGFP分别与辅助质粒通过脂质体lipofectamine 2000共转染BSR-T7/5细胞,5d后取上清及细胞裂解液感染Vero细胞,收获重组病毒。结果通过反向遗传系统成功获得麻疹病毒疫苗株拯救株rMV-S191,感染Vero细胞后,在显微镜下观察到有合胞体形成。通过无缝克隆的方式,将eGFP基因克隆至pMV-S191中,成功获得pMV2-eGFP、pMV3-eGFP,按照相同的方法共转染获得rMV2-eGFP和rMV3-eGFP,将其分别感染Vero细胞,在显微镜下均可观察到形成的麻疹病毒合胞体,且在荧光显微镜下可观察到表达的绿色荧光蛋白。结论成功建立MV-S191的反向遗传系统并确定外源基因的插入位点,为以麻疹病毒为载体新型疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 重组麻疹病毒 mv-s191 反向遗传学 T7RNA聚合酶
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