旨在建立一种基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白12a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 12a,CRIS...旨在建立一种基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白12a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 12a,CRISPR/Cas12a)系统的MSTN基因编辑猪检测方法,以满足基因编辑动物研发、育种等过程中核酸检测以及基因型鉴定的需求。本研究构建含有猪MSTN基因突变序列和野生型序列的标准质粒并设计靶向标准质粒的crRNA,基于RPA和CRISPR/Cas12a技术建立荧光报告和胶体金试纸条检测体系,筛选特异性识别标准质粒的crRNA、优化其反应条件并评价其检测灵敏度,最后通过检测猪耳组织样品评价本方法的准确性和稳定性。研究结果表明,该方法能够特异性识别MSTN基因2 bp碱基缺失序列和MSTN基因野生型序列。荧光报告体系最低可检测到4.1×10^(1)copies·μL^(-1)的标准质粒,胶体金试纸条体系最低可检测到4.1×10^(3)copies·μL^(-1)的标准质粒。通过对猪耳组织样本的检测,证明了该检测体系的准确性和可靠性。综上所述,本研究建立的MSTN基因编辑猪RPA-CRISPR/Cas12a检测方法具有操作简便、特异性和灵敏度高的特点,为MSTN基因编辑猪检测提供了重要技术支撑,具有广阔的应用前景。展开更多
本研究旨在对四引物扩增受阻突变体系PCR(T-ARMS PCR)方法进行拓展,将该方法应用于山羊肌肉生长抑制素(Myostain,MSTN)基因5 bp插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)变异的检测。结果显示,该方法可以明显的区分5 bp InDel变异的不同基因...本研究旨在对四引物扩增受阻突变体系PCR(T-ARMS PCR)方法进行拓展,将该方法应用于山羊肌肉生长抑制素(Myostain,MSTN)基因5 bp插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)变异的检测。结果显示,该方法可以明显的区分5 bp InDel变异的不同基因型,经Sanger测序验证,该方法检测的准确率为100%。利用该方法对577只安徽白山羊MSTN基因5 bp InDel位点进行检测和统计分析,结果显示该位点在安徽白山羊群体中有3种基因型,II(纯合插入型)、DD(野生型)和ID(杂合型),基因型频率分别为0.132、0.412和0.456。关联分析结果显示,该位点与羔羊的管围和育成羊的体重、体高及胸围显著相关。世界多个山羊品种该位点的频率分布情况显示,该位点在非洲山羊群体中变异频率较高,在亚洲山羊群体中变异程度较低。本研究利用T-ARMS PCR检测短片段InDel变异将为后续群体InDel位点的检测提供便利,同时也为山羊MSTN基因5 bp InDel的检测和标记辅助选择育种提供了基础。展开更多
文摘本研究旨在对四引物扩增受阻突变体系PCR(T-ARMS PCR)方法进行拓展,将该方法应用于山羊肌肉生长抑制素(Myostain,MSTN)基因5 bp插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)变异的检测。结果显示,该方法可以明显的区分5 bp InDel变异的不同基因型,经Sanger测序验证,该方法检测的准确率为100%。利用该方法对577只安徽白山羊MSTN基因5 bp InDel位点进行检测和统计分析,结果显示该位点在安徽白山羊群体中有3种基因型,II(纯合插入型)、DD(野生型)和ID(杂合型),基因型频率分别为0.132、0.412和0.456。关联分析结果显示,该位点与羔羊的管围和育成羊的体重、体高及胸围显著相关。世界多个山羊品种该位点的频率分布情况显示,该位点在非洲山羊群体中变异频率较高,在亚洲山羊群体中变异程度较低。本研究利用T-ARMS PCR检测短片段InDel变异将为后续群体InDel位点的检测提供便利,同时也为山羊MSTN基因5 bp InDel的检测和标记辅助选择育种提供了基础。
