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牛分支杆菌MPT83基因的表达及重组蛋白的纯化 被引量：6
1
作者 鲁俊鹏 罗满林 +1 位作者 宋延华 邹潍力 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期366-370,共5页
从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA,扩增了MPT83基因,并克隆入pMD 18-T Simple Vector,将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化。经测序,构建的克隆质粒pMD-M... 从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA,扩增了MPT83基因,并克隆入pMD 18-T Simple Vector,将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化。经测序,构建的克隆质粒pMD-MPT83与Gen- Bank中的序列一致;构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamHⅠ+HindⅢ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,4 h后表达量即达到高峰;Western- blotting分析表明,融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带。表明MPT83基因原核表达载体构建成功。 展开更多
关键词 牛分支杆菌 mpt83基因 克隆 原核表达 蛋白纯化
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结核分支杆菌MPT83在真核、原核表达载体中的克隆、表达与鉴定 被引量：2
2
作者 田霞 呼西旦 +2 位作者 潘怡 朱玉贤 蔡宏 《动物医学进展》 CSCD 2003年第4期69-72,共4页
为了克隆、鉴定和表达结核分支杆菌抗原蛋白 MPT83 ,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础。以结核分支杆菌标准菌株 H3 7RV基因组 DNA为模板 ,PCR扩增目的基因 mpt83 ,扩增产物酶切后分别克隆到真核、原核表达... 为了克隆、鉴定和表达结核分支杆菌抗原蛋白 MPT83 ,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础。以结核分支杆菌标准菌株 H3 7RV基因组 DNA为模板 ,PCR扩增目的基因 mpt83 ,扩增产物酶切后分别克隆到真核、原核表达载体 p JW43 0 3和p ET2 2 b( +)中 ,构成重组真、原核表达载体 83eu和 MPT83。经酶切和序列鉴定为正确的重组真核表达载体 83 eu和重组原核表达载体MPT83 ,分别转染 COS7细胞和转化 BL2 1( DE3 ) plys S。结果表明 ,经 SDS-PAGE、Westernblotting检测显示 ,IPTG诱导的原核表达载体MPT83在 2 .6万处有正确而特异的蛋白条带 ;转染 COS7细胞的真核表达载体 83 eu。 展开更多
关键词 结核病 分支杆菌 mpt83 真核 原核 表达载体 克隆 基因表达 鉴定技术
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结核分支杆菌MPT83蛋白基因在大肠杆菌表达载体中的克隆、表达与鉴定 被引量：1
3
作者 尤敏 邓小波 崔尚金 《现代预防医学》 CAS 北大核心 2008年第18期3594-3596,共3页
[目的]从分支杆菌培养物中提取DNA,扩增结核分支杆菌MPT83蛋白基因,并在大肠杆菌中进行表达、克隆和鉴定。[方法]从分支杆菌培养物中提取总DNA,扩增MPT83因并克隆入T载体,将目的基因插入表达载体pET-32a(+)中,转化BL21宿主菌,IPTG诱导... [目的]从分支杆菌培养物中提取DNA,扩增结核分支杆菌MPT83蛋白基因,并在大肠杆菌中进行表达、克隆和鉴定。[方法]从分支杆菌培养物中提取总DNA,扩增MPT83因并克隆入T载体,将目的基因插入表达载体pET-32a(+)中,转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamHⅠ+HindⅢ双酶切进行鉴定。[结果]经SDS-PAGE分析,在约42ku处出现新的蛋白条带,5h后表达量即达到高峰;Western blotting分析表明,融合蛋白能够被分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带。表明MPT83基因原核表达载体构建成功。[结论]结核分支杆菌MPT83蛋白基因在大肠杆菌表达载体中的克隆、表达与鉴定,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础。 展开更多
关键词 结核分支杆菌 mpt83基因 原核表达 SDS-PAGE WESTERN BLOTTING
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牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立 被引量：1
4
作者 鲁俊鹏 罗满林 +2 位作者 邹潍力 林琳 彭南秀 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期236-240,共5页
以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应... 以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 重组mpt83蛋白 间接ELISA
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结核分枝杆菌MPT83蛋白的表达纯化及其在免疫学诊断上的应用 被引量：2
5
作者 阮锦洋 祁弋暄 +1 位作者 杜凤娇 李浩 《中国热带医学》 CAS 2023年第2期115-120,共6页
目的本试验旨在表达纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,使用临床样本初步评估其在免疫学诊断结核病(tuberculosis,TB)中的应用价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增出mpt83基因,连接到pET-21a(+)中构建原核表达载体,转入感受态细... 目的本试验旨在表达纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,使用临床样本初步评估其在免疫学诊断结核病(tuberculosis,TB)中的应用价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增出mpt83基因,连接到pET-21a(+)中构建原核表达载体,转入感受态细胞DH5α,进行菌落PCR筛选阳性克隆。提取菌落PCR为阳性菌株的重组质粒pET-mpt83,对其进行双酶切鉴定,并将阳性克隆进行测序。将测序正确的质粒转入BL21感受态细胞中进行诱导、表达后通过镍柱亲和层析法纯化。使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及免疫印迹(Western Blot)鉴定纯化产物。用纯化MPT83蛋白免疫小鼠制备鼠多克隆抗血清。分别收集8例临床诊断结核性胸膜炎患者(TB组)的胸水和血浆,8例腺癌患者(CA组)的胸水和血浆以及8名健康对照者(HC组)的血浆。采用间接ELISA法检测样本中识别MPT83蛋白的特异性抗体水平。结果成功表达纯化出结核分枝杆菌MPT83蛋白。MPT83鼠多克隆抗血清效价可高达1∶1280000。TB组血浆MPT83抗原特异性抗体水平显著高于HC组,差异有统计学意义(P<0.05);而CA组血浆中抗原特异性抗体水平与HC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。TB组和CA组的胸水与HC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。利用ROC曲线分析不同稀释度下TB组血浆和HC组血浆OD值,曲线下面积均大于0.7,显示出较高的诊断效能。结论MPT83蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病免疫学诊断方面具有很大的应用价值。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 mpt83蛋白 蛋白表达 免疫学诊断
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结核分枝杆菌抗原MPT83和MPT64二价基因疫苗的研究 被引量：1
6
作者 田霞 蔡宏 朱玉贤 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第20期1410-1413,共4页
目的探讨结核杆菌两种抗原MPT83和MPT64基因疫苗的免疫原性和免疫保护性。方法用成对引物扩增MPT83和MPT64两种抗原基因,构建到同一载体pJW4303中,测序正确和体外表达验证后免疫小鼠,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定3次免疫后小鼠... 目的探讨结核杆菌两种抗原MPT83和MPT64基因疫苗的免疫原性和免疫保护性。方法用成对引物扩增MPT83和MPT64两种抗原基因,构建到同一载体pJW4303中,测序正确和体外表达验证后免疫小鼠,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定3次免疫后小鼠的抗体滴度。对3次免疫后的小鼠脾细胞进行培养,抗原刺激,用夹心ELISA方法测定细胞因子IFN-γ和IL-4的含量。免疫小鼠攻毒,进行细菌培养,检测肺脏和脾脏的载菌量。结果每次免疫后抗原的滴度分别为1∶200、1∶800、1∶6400,而卡介苗(BCG)组的抗体滴度为1∶800,空载体组未检测到抗体滴度。融合的二价基因疫苗免疫小鼠,主要诱发Th1型细胞因子,IFN-γ占优势,二价组中的含量为7520pg/ml,IL-4的含量仅为ng级。H37Rv攻毒后,二价组小鼠的肺脏载菌量为(2.21±0.03)×105,比空载体免疫小鼠低103倍,比BCG免疫小鼠低10倍。结论抗原MPT83和MPT64二价基因疫苗有效提高了机体保护效力,对于结核病的防治具有一定的借鉴价值。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌抗原 mpt83 MPT64 基因疫苗 免疫保护性 免疫原性
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结核分枝杆菌Dnak和MPT83蛋白的抗原性评价 被引量：4
7
作者 李晓琴 肖彤洋 +5 位作者 李马超 刘海灿 李霜君 罗巧 楼永良 万康林 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期106-113,共8页
目的对两种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)蛋白Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873)进行抗原性评价,为结核病免疫诊断和疫苗研究提供实验依据。方法通过基因重组和蛋白质纯化技术,克隆表达和纯化结核分枝杆菌蛋白Dnak(Rv0350)和MPT8... 目的对两种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)蛋白Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873)进行抗原性评价,为结核病免疫诊断和疫苗研究提供实验依据。方法通过基因重组和蛋白质纯化技术,克隆表达和纯化结核分枝杆菌蛋白Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873)。收集人群包括结核病患者、非结核病其他肺部疾病患者和健康志愿者的血液标本,以基因重组Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873)蛋白作抗原,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和效应T细胞酶联免疫斑点试验(ELISPOT)分别进行人群体液和细胞免疫学检测,分析其免疫学性能。结果成功获得基因重组表达和纯化的结核分枝杆菌蛋白Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873),以这两种蛋白质作抗原进行人群体液和细胞免疫学检测。体液免疫检测,用ELISA检测135名结核病患者、56名非结核病其他肺部疾病患者和94名健康人的血清特异性IgG抗体,结果显示,Dnak(Rv0350)检测的灵敏度、特异度和准确率分别为77.80%(105/135)、56.70%(85/150)和66.67%(190/285);MPT83(Rv2873)检测的灵敏度、特异度和准确率分别为76.30%(103/135)、43.30%(65/150)和58.95%(168/285)。细胞免疫检测,用ELISPOT检测59名结核病患者、65名非结核病其他肺部疾病患者和64名健康志愿者的外周血单核细胞被抗原刺激后效应T淋巴细胞产生γ干扰素(IFN-γ)的水平,结果显示,Dnak(Rv0350)检测的灵敏度、特异度和准确率分别为66.10%(39/59)、62.79%(81/129)和63.83%(120/188);MPT83(Rv2873)检测的灵敏度、特异度和准确率分别为47.46%(28/59)、79.84%(103/129)和69.68%(131/188)。结论结核分枝杆菌Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873)蛋白均具有较好的抗原性,并且刺激T细胞产生免疫应答的能力较强,两者联合可能对于结核病免疫诊断和新型抗结核疫苗研究有更好的应用价值。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 Dnak(Rv0350)蛋白 mpt83(Rv2873)蛋白 抗原性 免疫学评价
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结核分枝杆菌MPT83的免疫原性及其奶牛结核病血清学检测方法的建立 被引量：10
8
作者 孟闯 万婷 +4 位作者 徐正中 单法 范峰 陈祥 焦新安 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期220-226,共7页
【目的】利用大肠杆菌系统表达并纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,通过小鼠模型评价其免疫原性,建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病临床检测,评价其应用潜能。【方法】构建p ET30a(+)-mpt83重组质粒,转化BL21(DE3)诱导表达并纯化,经细胞表... 【目的】利用大肠杆菌系统表达并纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,通过小鼠模型评价其免疫原性,建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病临床检测,评价其应用潜能。【方法】构建p ET30a(+)-mpt83重组质粒,转化BL21(DE3)诱导表达并纯化,经细胞表面分子的流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析、ELISPOT试验等分析其在小鼠中的免疫原性,建立间接ELISA方法,检测临床奶牛血样,评价其用于牛结核病血清学检测的潜能。【结果】SDS-PAGE显示目的蛋白成功表达,Western blot证实其对兔抗H37Rv多抗血清具有良好免疫反应性;FCM结果显示其下调树突状细胞表面CD80分子的表达,上调小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞表面CD69的表达,ELISPOT结果表明其诱导的特异性IL-4分泌细胞数显著高于IFN-γ分泌细胞数,表现为Th2型免疫应答;建立了ELISA方法,检测临床奶牛血样200份,与牛结核外周血γ-干扰素体外释放试验结果的阳性符合率和阴性符合率分别为48.6%和90%。【结论】在大肠杆菌系统中高效可溶性表达MPT83蛋白,其在小鼠模型中主要呈现Th2型免疫应答,并以该蛋白为抗原建立了牛结核病血清学检测的间接ELISA方法。 展开更多
关键词 牛结核病 mpt83蛋白 原核表达 免疫原性 血清学检测
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结核分枝杆菌三价DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答 被引量：2
9
作者 张云峰 刘福元 +2 位作者 蔡宏 呼西旦 徐雪萍 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期1317-1323,共7页
【目的】研究结核分枝杆菌Ag85B、MPB64和MPT83抗原DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答。【方法】以PJW4303为载体,构建上述3种抗原基因的三价DNA疫苗,免疫6月龄荷斯坦奶牛3次。ELISA法检测免疫奶牛的特异性抗体滴度。利用双抗夹心ELISA... 【目的】研究结核分枝杆菌Ag85B、MPB64和MPT83抗原DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答。【方法】以PJW4303为载体,构建上述3种抗原基因的三价DNA疫苗,免疫6月龄荷斯坦奶牛3次。ELISA法检测免疫奶牛的特异性抗体滴度。利用双抗夹心ELISA定量测定免疫奶牛各月IFN-γ浓度。【结果】免疫前奶牛体内特异性抗体为阴性,1免2、免后抗体效价上升较缓,3免后抗体效价上升快。MPT83特异性抗体上升最快,抗体效价1∶3 200持续6个月;Ag85B特异性抗体效价1∶3 200持续2个月;MPT64特异性抗体效价较低。免疫奶牛中MPT83、Ag85B、MPT64三种蛋白诱导产生IFN-γ在3免后6个月到达最高,浓度分别为(1 098.95±165.03)(、711.45±110.43)(、355.06±72.76)pg/mL,阴性对照组PBS刺激IFN-γ浓度为(114.5±27.46)pg/mL。阴性对照与三种抗原相比,差异均极显著(P<0.01)。【结论】多价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答,可能有利于增强疫苗对抗结核病的抗性。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85B MPB64 mpt83 DNA疫苗 免疫应答
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血浆中干扰素-γ及相关抗原检测对结核分枝杆菌潜伏感染的灵敏度和特异性影响 被引量：3
10
作者 陈苏芳 马丽玲 徐俊驰 《抗感染药学》 2020年第12期1804-1807,共4页
目的:考察血浆中相关抗原(MPt 83、ESAT-6)及结核分枝杆菌干扰素-γ释放试验(TB-IGRSA)检测对结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)的灵敏度和特异性影响。方法:选取2019年9月—2020年1月间被确诊为TB 102例患者,分别用MPt 83抗原和结核分枝杆菌... 目的:考察血浆中相关抗原(MPt 83、ESAT-6)及结核分枝杆菌干扰素-γ释放试验(TB-IGRSA)检测对结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)的灵敏度和特异性影响。方法:选取2019年9月—2020年1月间被确诊为TB 102例患者,分别用MPt 83抗原和结核分枝杆菌干扰素-γ(TB-IGRA)试验检测患者血浆中的IFN-γ水平,分析其检测结果对TB-IGRA阳性和阴性的活动性肺结核(ATB)和社区获得性肺炎(CAP)分布以及结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)的诊断、结核抗原MPt 83和早期分泌靶向抗原(ESAT-6)分布特征等情况;并采用受试者特征试验曲线(ROC)分析其检测的灵敏度和特异性。结果:对MPt 83、ESAT-6和IFN-γ的测定,可有效区分ATB和LTBI患者的诊断,提高了临床对ATB、LTBI检测的灵敏度、特异性以及检测效率。结论:采用MPt 83、ESAT-6检测IFN-γ水平,有利于对ATB、LTBI患者的诊断,其检测的灵敏度MPt 83高于ESAT-6。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 干扰素-γ释放试验 结核分枝杆菌潜伏感染 结核抗原MPt 83 ESAT-6
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