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牛分枝杆菌mpb51-mpb70融合基因的原核表达与抗原活性初步鉴定 被引量：2
1
作者 姜秀云 周步丹 +6 位作者 董阳 包艳红 陈敬蕊 刘磊 王春芳 徐博文 马红霞 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期805-810,共6页
目的通过获得牛分枝杆菌保护性抗原MPB51、MPB70的融合蛋白MPB51-MPB70,以提高单一蛋白的抗原性。方法采用重叠拼接PCR技术将牛分枝杆菌mpb51与mpb70基因融合,获得融合基因mpb51-mpb70,克隆至pMD19中,构建重组质粒pMD-51-70。酶切、纯... 目的通过获得牛分枝杆菌保护性抗原MPB51、MPB70的融合蛋白MPB51-MPB70,以提高单一蛋白的抗原性。方法采用重叠拼接PCR技术将牛分枝杆菌mpb51与mpb70基因融合,获得融合基因mpb51-mpb70,克隆至pMD19中,构建重组质粒pMD-51-70。酶切、纯化后连接至pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET-51-70。通过SDS-PAGE和Western blotting分析、鉴定融合蛋白的表达及抗原性。以间接ELISA比较MPB51、MPB70、MPB51-MPB70的抗原性。结果表达、纯化了45ku的融合蛋白MPB51-MPB70,并与牛结核血清发生特异性反应,且比单一蛋白反应性强。结论成功地获得了具有良好抗原性的牛分枝杆菌融合蛋白MPB51-MPB70。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 mpb51基因 mpb70基因 融合蛋白
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牛结核分枝杆菌MPB70+83MAb的制备及胶体金免疫层析试纸条的初步研制 被引量：6
2
作者 叶俊 布日额 +6 位作者 吴金花 锡林高娃 陈金龙 王金良 刘思国 崔子寅 王思珍 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1131-1136,共6页
为制备牛结核分枝杆菌(MB)感染早期分泌性蛋白MPB70+83的胶体金标记免疫层析试剂条,本研究将构建的重组大肠杆菌p ET30a(+)-MPB70+83/BL21诱导表达,经纯化后免疫小鼠,制备MPB70+83融合蛋白的单克隆抗体(MAb),对MAb标记胶体金后制备检测... 为制备牛结核分枝杆菌(MB)感染早期分泌性蛋白MPB70+83的胶体金标记免疫层析试剂条,本研究将构建的重组大肠杆菌p ET30a(+)-MPB70+83/BL21诱导表达,经纯化后免疫小鼠,制备MPB70+83融合蛋白的单克隆抗体(MAb),对MAb标记胶体金后制备检测试纸,并确定其特异性、灵敏度等技术指标。结果显示,获得分子量为39 ku的MPB70+83融合蛋白,经纯化后重组蛋白的纯度>95%,经4次免疫BALB/c小鼠后,最终获得3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4H6、5A2、4D11,小鼠腹水MAb效价分别达到1∶12800,1∶12800,1∶25600。制备的腹水MAb均经纯化后浓度分别为2.1 mg/m L、1.8 mg/mL、2.5 mg/mL。对杂交瘤细胞经15代培养,MAb均具有良好的稳定性。利用4D11 MAb标记金颗粒,4H6 MAb包被检测线,并对不同培养物人工污染健康牛血清样品进行检测,结果显示,胶体金试纸对人工污染MB培养物的健康牛血清出现阳性反应,对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌培养物人工污染的健康牛血清的检测均为阴性,最低可以检测到1∶2500倍稀释的MB培养上清。本研究为牛结核分枝杆菌感染的快速检测提供可行技术手段。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 mpb70 mpb83 单克隆抗体
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牛结核分枝杆菌早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83基因的串联表达及其抗原性鉴定 被引量：2
3
作者 布日额 陈金龙 +3 位作者 叶俊 吴金花 锡林高娃 王金良 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期622-626,共5页
为获得一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌(MB)感染早期标识物MPB70、MPB83分泌性蛋白的串联抗原蛋白,本研究利用DNAStar生物信息软件对MB感染早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83抗原结构区域进行预测后设计合成相应引物,并在两个片段之间引... 为获得一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌(MB)感染早期标识物MPB70、MPB83分泌性蛋白的串联抗原蛋白,本研究利用DNAStar生物信息软件对MB感染早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83抗原结构区域进行预测后设计合成相应引物,并在两个片段之间引入16位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术获得MBP70与MBP83基因的抗原优势区核苷酸串联片段,将其连接至原核表达载体pGEX-6p-1中经诱导、表达,结果显示构建的重组表达载体获得高效表达,目的抗原蛋白的分子质量约58ku,纯化后重组蛋白的纯度>90%,经免疫BALB/c小鼠4次后,抗体效价达到1∶51200。本实验获得了具有明显抗原活性的MB感染早期分泌性蛋白串联抗原MPB70+MPB83,为后续进一步研发MB早期感染标识物快速检测试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 mpb70 mpb83 串联表达
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牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果 被引量：5
4
作者 宫强 刘思国 +6 位作者 郭设平 王春来 王勇 刘建东 赵昆 迟磊 孔宪刚 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期61-66,共6页
用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫... 用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况。结果表明,2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升,而2对照组始终维持在较低水平,且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后,pCE6组和pC70-83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著(P<0.05),2重组质粒免疫组间差异不显著(P>0.05);2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ均显著高于2对照组(P<0.05),且pC70-83-E6组明显高于其他3组(P<0.05)。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 esat-6基因 mpb70-mpb83融合基因 DNA疫苗 免疫应答
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鹿结核分枝杆菌MPB70蛋白的表达与免疫原性鉴定 被引量：7
5
作者 王晓龙 卢天成 +1 位作者 王秀然 杨艳玲 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第12期3135-3140,共6页
本研究以分离的鹿结核分枝杆菌DNA为模板扩增免疫原性蛋白MPB70基因,获得约590bp片段,并将其克隆,构建原核表达载体pET-30a-MPB70,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化和SDSPAGE分析,在20ku处可见特异性蛋白条带。利用鹿... 本研究以分离的鹿结核分枝杆菌DNA为模板扩增免疫原性蛋白MPB70基因,获得约590bp片段,并将其克隆,构建原核表达载体pET-30a-MPB70,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化和SDSPAGE分析,在20ku处可见特异性蛋白条带。利用鹿结核阳性血清进行Western blotting鉴定,原核表达的融合蛋白可与鹿结核阳性血清抗体结合,并出现特异的免疫反应。该蛋白可作为特异性抗原进行鹿结核病的检测,从而为鹿结核病诊断方法的研究奠定基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 mpb 70 基因 原核表达
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牛型分枝杆菌MPB70蛋白胶乳凝集方法的建立及应用 被引量：9
6
作者 钦博 万学济 +5 位作者 胡巧云 喻正军 晁彦杰 郭爱珍 陈焕春 谭亚娣 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期58-62,共5页
为了研究牛结核病新型诊断试剂,提高诊断的特异性和敏感性,我们用大肠杆菌工程菌表达了牛型分枝杆菌特异性抗原MPB70并提纯蛋白建立了牛结核病乳胶凝集试验(LAT)诊断方法。MPB70是一种牛型分枝杆菌特异性分泌而卡介苗BCG缺失的蛋白质,... 为了研究牛结核病新型诊断试剂,提高诊断的特异性和敏感性,我们用大肠杆菌工程菌表达了牛型分枝杆菌特异性抗原MPB70并提纯蛋白建立了牛结核病乳胶凝集试验(LAT)诊断方法。MPB70是一种牛型分枝杆菌特异性分泌而卡介苗BCG缺失的蛋白质,热稳定性好,用此蛋白建立的乳胶凝集方法具有良好的敏感性、特异性以及较长的保存期,检测70份临床奶牛血清,与皮内变态反应和间接血凝方法相比较分别具有71.4%和88.6%的符合率。该方法还可鉴别诊断自然感染和疫苗免疫接种。我们建立的牛型分枝杆菌MPB70蛋白乳胶凝集试验诊断方法将分子生物学手段和经典试验方法有机结合,为临床快速检测牛结核病血清特异性抗体水平提供了行之有效的方法,。 展开更多
关键词 牛型分枝杆菌 牛结核病 mpb70 胶乳凝集 间接血凝
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植物黄酮MPB6的抗菌活性及对肉仔鸡生产性能的影响 被引量：7
7
作者 佟建明 高微微 +1 位作者 萨仁娜 李展 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2002年第5期23-24,共2页
通过体外抑菌试验及饲养试验 ,探讨天然植物黄酮MPB6的抗菌活性 ,以及作为饲料添加剂 ,对肉仔鸡生产性能的影响 ,并与金霉素的作用进行比较。结果表明 ,MPB6体外对鸡致病性大肠杆菌 ,鸡白痢沙门氏菌具有明显抑制作用 ,MIC分别达到 1.2 5... 通过体外抑菌试验及饲养试验 ,探讨天然植物黄酮MPB6的抗菌活性 ,以及作为饲料添加剂 ,对肉仔鸡生产性能的影响 ,并与金霉素的作用进行比较。结果表明 ,MPB6体外对鸡致病性大肠杆菌 ,鸡白痢沙门氏菌具有明显抑制作用 ,MIC分别达到 1.2 5 0mg ml和 0 .6 2 5mg ml。全生长期添加 1g kgMPB6 ,对前 3周的肉仔鸡采食有促进作用 ,并以此促进肉仔鸡生长 ,对后 4周肉仔鸡生产性能无显著影响 ,作用效果与金霉素相同。 展开更多
关键词 植物 黄酮 mpb6 抗菌活性 肉仔鸡 生产性能
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高敏感度酶联免疫吸附测定法检测分泌蛋白MPB64对于活动性肺结核诊断的价值 被引量：9
8
作者 赵冰 侯萍 +4 位作者 黄静 贺文从 欧喜超 刘东鑫 赵雁林 《中国防痨杂志》 CAS 2017年第12期1303-1308,共6页
目的评价以结核分枝杆菌（MTB）分泌蛋白MPB64为检测抗原的高敏感度酶联免疫吸附测定法（high sensitivityenzyme-linked immunosorbent assay，HI-ELISA）用于检测痰液中MTB的价值。方法选取97份储存的疑似肺结核患者的痰标本，分别进... 目的评价以结核分枝杆菌（MTB）分泌蛋白MPB64为检测抗原的高敏感度酶联免疫吸附测定法（high sensitivityenzyme-linked immunosorbent assay，HI-ELISA）用于检测痰液中MTB的价值。方法选取97份储存的疑似肺结核患者的痰标本，分别进行BACTEC MGIT960液体培养（简称“MGIT960培养”）、MTB／利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测系统（Gene Xpert MTB／RIF，简称“Xpert检测”）和HI-ELISA检测，通过与MGIT 960培养比较来评价HI-ELISA的诊断效能。结果本研究97份痰标本中，MGIT 960培养、HI-ELISA检测MTB的阳性率分别为36．08％（35／97）、32．99％（32／97）；与MGIT 960培养比较，HI-ELISA的检测敏感度、特异度、总体符合率分别为88．57％（31／35）、98．39％（61／62）、94．85％（92／97）。在Xpert检测阳性的66份痰标本中，MGIT 960培养、HI-ELISA检测MTB的阳性率分别为51．51％（34／66）、48．48％（32／66）；与MGIT 960培养相比，HI-ELISA的检测敏感度、特异度、总体符合率分别为91．18％（31／34）、96．88％（31／32）、93．93％（62／66）。Xpert检测MTB为阴性的31份痰标本中，仅有1份标本的MGIT960培养阳性而HI-ELISA未能检测到MTB，其他30份标本检测结果全部相符，符合率为96．77％（30／31）。结论HI-ELISA可以特异性检测MTB活菌，对活动性肺结核的诊断及治疗评价有很高的应用价值。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 分泌蛋白 mpb64 酶联免疫吸附测定 敏感性与特异性 诊断
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牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量：6
9
作者 姜秀云 王春凤 +1 位作者 王春芳 何昭阳 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期298-300,共3页
以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板 ,以MPB5 1成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增 ,获得约80 0bp的DNA片段。通过T- A克隆技术 ,将PCR产物克隆至pGEM TVector中 ,成功地构建出克隆质粒pGEM T -5 1。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM T- ... 以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板 ,以MPB5 1成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增 ,获得约80 0bp的DNA片段。通过T- A克隆技术 ,将PCR产物克隆至pGEM TVector中 ,成功地构建出克隆质粒pGEM T -5 1。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM T- 5 1和pET2 8a(+) ,并将纯化的MPB5 1基因亚克隆至pET2 8a (+)中 ,构建出原核表达质粒pET2 8a- 5 1。将pET2 8a- 5 1转化至感受态E .coliBL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导和SDS PAGE分析 ,可见约30kD外源蛋白带。Westernblot分析发现 ,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性 ,从而为进一步研究MPB5 1的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 mpb51基因 克隆 原核表达
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直接检测痰标本中MPB64蛋白在结核病诊断中的临床应用价值 被引量：5
10
作者 孟繁荣 谢贝 +6 位作者 郑小凌 尹小毛 蔡杏珊 许婉华 彭湘明 赖艳榕 刘志辉 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2010年第23期4267-4269,共3页
目的:探讨直接检测痰液标本MPB64蛋白作为结核病快速诊断方法的可能性。方法:对65例肺结核病患者和72例非结核病患者的痰液标本同时进行痰涂片染色抗酸菌检查、实时荧光定量PCR检测结核杆菌DNA和免疫胶体金法检测MPB64蛋白,比较分析3种... 目的:探讨直接检测痰液标本MPB64蛋白作为结核病快速诊断方法的可能性。方法:对65例肺结核病患者和72例非结核病患者的痰液标本同时进行痰涂片染色抗酸菌检查、实时荧光定量PCR检测结核杆菌DNA和免疫胶体金法检测MPB64蛋白,比较分析3种方法的检测结果,并依据临床诊断对MPB64蛋白检测结果进行诊断方法学评价。结果:MPB64蛋白检测法与涂片染色、荧光定量PCR检测结果的符合率均为60.58%;MPB64蛋白检测的敏感度、特异度、准确度分别为58.46%、69.44%和64.23%,其敏感度显著高于涂片染色法的27.69%与荧光定量PCR法的35.38%,但其特异度和准确度则低于涂片染色法(100%、65.69%)与荧光定量PCR法(98.61%、68.61%)。结论:采用免疫胶体金法直接检测痰液标本中MPB64蛋白对结核病的诊断具有较高的敏感度,可以作为筛查检测手段;但特异度相对较低,可否作为一种结核病快速诊断方法值得进一步研究。 展开更多
关键词 结核 mpb64 方法学评价
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牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析 被引量：4
11
作者 雷剑明 谢芝勋 +4 位作者 谢志勤 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢丽基 《广西农业科学》 CAS CSCD 2009年第9期1229-1233,共5页
根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定... 根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100%。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 CFP-10 ESAT-6 mpb70 克隆 序列分析
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基因免疫制备牛分枝杆菌MPB64抗原单克隆抗体 被引量：3
12
作者 刘建东 刘思国 +4 位作者 王春来 宫强 王勇 迟磊 赵昆 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期870-873,共4页
为了建立针对牛分枝杆菌分泌抗原MPB64的检测手段,制备该抗原的单克隆抗体,构建真核表达载体pcDNA-mpb64,以原核表达并纯化的融合蛋白H-MPB64包被ELISA板,建立单克隆抗体检测方法。利用基因免疫方法免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选... 为了建立针对牛分枝杆菌分泌抗原MPB64的检测手段,制备该抗原的单克隆抗体,构建真核表达载体pcDNA-mpb64,以原核表达并纯化的融合蛋白H-MPB64包被ELISA板,建立单克隆抗体检测方法。利用基因免疫方法免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选出针对牛分枝杆菌分泌蛋白MPB64的单克隆抗体一株,并制备了腹水,经鉴定腹水效价达到1∶10240,采用硫酸铵沉淀法纯化腹水,纯化抗体效价为1∶8000,为今后研制分枝杆菌鉴定技术奠定基础。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌mpb64蛋白 基因免疫 单克隆抗体
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牛分枝杆菌MPB63基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量：2
13
作者 姜秀云 王春凤 +1 位作者 王春芳 何昭阳 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第2期129-132,共4页
以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB63成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约400 bp的DNA片段. 通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-63. 以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-63和pET28... 以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB63成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约400 bp的DNA片段. 通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-63. 以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-63和pET28a(+),并将纯化的MPB63基因亚克隆至pET28a (+)中,构建出原核表达载体pET28a-63. 将pET28a-63转化至感受态E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,可见约18 ku外源蛋白带. 蛋白质印迹分析发现,该蛋白质具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB63的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础. 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 mpb63基因 克隆 原核表达
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牛结核分枝杆菌MPB70蛋白分泌性载体的构建与蛋白表达 被引量：3
14
作者 贾浩 周晶 +4 位作者 徐广贤 李娟 张艳 许涛 王玉炯 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第6期13-15,共3页
为了研究牛结核病新型诊断抗原,试验根据GenBank中Mycobacterium bovis基因序列设计1对引物,将牛结核分枝杆菌MPB70基因构建到pET22b(+)原核表达载体上,将重组载体转到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导获得高效表达,并进行SDS-PAGE和Westen... 为了研究牛结核病新型诊断抗原,试验根据GenBank中Mycobacterium bovis基因序列设计1对引物,将牛结核分枝杆菌MPB70基因构建到pET22b(+)原核表达载体上,将重组载体转到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导获得高效表达,并进行SDS-PAGE和Westen-blot分析。结果表明:MPB70蛋白以可溶形式在细胞周质中表达,有部分蛋白以包涵体形式在细胞质中表达,其分子质量约为30ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;重组MPB70蛋白可与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应。说明重组MPB70蛋白能够作为诊断抗原。 展开更多
关键词 牛结核分枝杆菌 mpb70 表达 WESTERN-BLOT
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MPB64抗原检测对分枝杆菌菌型快速鉴别的价值探讨 被引量：6
15
作者 顾欣荣 陈俊林 +2 位作者 顾德林 施军卫 王小平 《江苏预防医学》 CAS 2009年第3期34-35,共2页
关键词 结核分枝杆菌 非结核分枝杆菌 mpb64抗原 胶体金法
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MPB64在杆状病毒系统中的表达纯化及免疫原性鉴定 被引量：1
16
作者 徐丹 姜潮 +3 位作者 陈昱 艾君 王晓艳 李校堃 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期921-926,共6页
目的：在杆状病毒昆虫细胞表达系统中表达结核分枝杆菌蛋白MPB64，并鉴定其免疫原性。方法：目的基因MPB64连接到pFastBac载体，获得pFastBac-MPB64质粒转化DH10 Bac感受态，通过Tn7转座片段将目的基因转座到Bacmid中，得到Bacmid-MPB6... 目的：在杆状病毒昆虫细胞表达系统中表达结核分枝杆菌蛋白MPB64，并鉴定其免疫原性。方法：目的基因MPB64连接到pFastBac载体，获得pFastBac-MPB64质粒转化DH10 Bac感受态，通过Tn7转座片段将目的基因转座到Bacmid中，得到Bacmid-MPB64穿梭载体，脂质体包被后转染Sf 9细胞收获P1代病毒，重复转染Sf 9细胞三次获得高滴度的P4代病毒，收集细胞上清通过Q Sepharose FF和Ni亲和层析柱两步层析纯化得到目的蛋白MPB64。纯化的蛋白免疫BALB／c小鼠并检测血清中抗体滴度，ELISA检测MPB64蛋白刺激脾脏细胞产生IFN-γ的浓度，MTT法检测目的蛋白对免疫后小鼠脾脏细胞的增殖作用。结果：MPB64在昆虫细胞中成功表达，纯化后蛋白纯度达90％以上，蛋白产量为35 mg／L，纯化蛋白能有效刺激BALB／c小鼠产生抗体，提高小鼠脾脏细胞培养基中IFN-γ的含量，目的蛋白在0.2～100μg／ml之间对脾脏细胞有明显的促增殖作用。结论：成功在杆状病毒昆虫细胞表达系统中表达了具有免疫原性的MPB64蛋白，为生产结核病疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 mpb64 杆状病毒表达系统 Sf 9细胞 结核分枝杆菌
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牛分枝杆菌MPB83基因的原核表达及免疫活性分析 被引量：1
17
作者 张秀华 刘思国 +6 位作者 王春来 郭设平 郭洋 邵美丽 宫强 彭永刚 沈国顺 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期76-80,共5页
利用PCR技术,以牛型分枝杆菌(M.bovis)Vallee菌株的全基因组DNA为模板,扩增出了一条600bp的MPB83基因片段,将其克隆至pMD18T载体中,经核苷酸序列测定确证后,KpnI/EcoRI双酶切,然后亚克隆到原核表达载体pET30a的相同酶切位点,构建表达质... 利用PCR技术,以牛型分枝杆菌(M.bovis)Vallee菌株的全基因组DNA为模板,扩增出了一条600bp的MPB83基因片段,将其克隆至pMD18T载体中,经核苷酸序列测定确证后,KpnI/EcoRI双酶切,然后亚克隆到原核表达载体pET30a的相同酶切位点,构建表达质粒pETMPB83,将鉴定的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDSPAGE检测表达情况,重组质粒pETMPB83在30kDa处有一特异表达带,与预计大小相符。经Ni柱纯化后,Westernblot检测纯化蛋白具有免疫活性,用纯化的该蛋白进行动物(兔)接种制备抗血清,用Westernblot和ELISA检测该抗血清的效价和特异性,结果表明特异性较好。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 mpb83基因 原核表达Western BLOT 抗血清 ELISA
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应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌的初步研究 被引量：7
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作者 何霞 谭守勇 +3 位作者 蔡杏姗 樊晖 罗春明 刘志辉 《国际医药卫生导报》 2007年第18期14-15,107,共3页
目的探讨应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌的临床应用价值。方法应用抗酸染色涂片阳性样本进行分枝杆菌培养前处理,接种于BacT/Alert 3D全自动分枝杆菌培养系统培养基中。在培养监测的同时,每天定时测定培养液中的结核... 目的探讨应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌的临床应用价值。方法应用抗酸染色涂片阳性样本进行分枝杆菌培养前处理,接种于BacT/Alert 3D全自动分枝杆菌培养系统培养基中。在培养监测的同时,每天定时测定培养液中的结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64,比较它们可指示有结核分枝杆菌生长在时间上的差异。结果在12例涂片阳性样本中,仪器系统对12例样本都指示培养阳性结果,其中10例样本MPB64检测阳性;对12例样本进行分枝杆菌菌鉴定,培养指示阳性、MPB64指示阴性的2例样本为非结核分枝杆菌,培养与MPB64均指示阳性的10例样本为结核分枝杆菌;仪器系统指示培养阳性的平均时间为11.5天,MPB64检测指示有结核分枝杆菌生长的平均时间为6.5天。结论应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64来指示有无结核分枝杆菌生长具有操作简便、报告结果快速的特点,值得更进一步研究。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核分泌 蛋白 mpb64 免疫色谱法 抗体 单克隆
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水溶性ZnSe量子点在快速灵敏检测牛分枝杆菌表面MPB83蛋白中的应用 被引量：1
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作者 阮晓娟 王蓓蓓 +2 位作者 马美湖 郭爱珍 蔡朝霞 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2014年第5期643-647,共5页
本实验以巯基丙酸作为稳定剂,在水相条件下快速合成稳定性好的水溶性硒化锌量子点（ ZnSe QDs）,采用透射电子显微镜、X射线衍射、红外光谱、荧光以及紫外光谱法等对ZnSe QDs进行了材料表征。将得到的ZnSe QDs通过共价结合方式标记到牛... 本实验以巯基丙酸作为稳定剂,在水相条件下快速合成稳定性好的水溶性硒化锌量子点（ ZnSe QDs）,采用透射电子显微镜、X射线衍射、红外光谱、荧光以及紫外光谱法等对ZnSe QDs进行了材料表征。将得到的ZnSe QDs通过共价结合方式标记到牛分枝杆菌表面的MPB83蛋白抗体分子上,基于抗体与MPB83蛋白的特异性相互作用,建立了一种检测MPB83蛋白的光谱新方法。研究了pH值及温度对检测的影响,得到pH 8.5,37℃为适宜的体系酸度和温度。在优化的实验条件下,MPB83蛋白浓度在44~528 mg/L范围内,QDs的荧光强度与蛋白浓度间呈现良好的线性关系,此方法对MPB83蛋白的检出限为4.4 mg/L。该方法为实现准确而及时的诊断牛结核病提供一定理论依据。 展开更多
关键词 ZNSE量子点 牛结核病 牛分枝杆菌 mpb83蛋白
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结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64表达纯化 被引量：2
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作者 石华 戈朝晖 +4 位作者 贾伟 马小明 牛宁奎 董辉 王自立 《宁夏医科大学学报》 2011年第8期704-707,共4页
目的表达并纯化结核分枝杆菌重组蛋白pET32a-MPB64。方法将构建好的表达载体pET32a-MPB64测序后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)内。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。结果质粒pET32a-MPB6... 目的表达并纯化结核分枝杆菌重组蛋白pET32a-MPB64。方法将构建好的表达载体pET32a-MPB64测序后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)内。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。结果质粒pET32a-MPB64经测序,结果与Geneback中的结核分枝杆菌标准菌株H37RV核苷酸序列基本一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以可溶性的形式表达,其分子质量约为24 kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经MagExtractor-His-tag-磁珠纯化试剂盒纯化后浓度达2.49mg.mL-1;Western-blot结果显示融合蛋白可与抗His-Tag标签的单克隆抗体结合。结论成功得到高纯度的重组目的蛋白pET32a-MPB64,为进一步制备其单克隆抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 mpb64 免疫印迹 蛋白表达纯化
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