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真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1的构建及其在Siha细胞中的表达 被引量：2
1
作者 石艳艳 刘涛 +5 位作者 张琴 袁成福 卜友泉 易发平 刘革力 宋方洲 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第23期2707-2710,共4页
目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1并稳定转染人宫颈癌细胞系Siha细胞,检测MKRN1表达情况及对细胞增殖和凋亡的影响.方法:用RT-PCR技术从人胚肾细胞株HEK293细胞中获得MKRN1的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-N1中;构建的重组质粒经脂... 目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1并稳定转染人宫颈癌细胞系Siha细胞,检测MKRN1表达情况及对细胞增殖和凋亡的影响.方法:用RT-PCR技术从人胚肾细胞株HEK293细胞中获得MKRN1的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-N1中;构建的重组质粒经脂质体介导转染Siha细胞;Western Blot鉴定MKRN1在Siha细胞中的稳定表达.结果:RT-PCR成功地扩增出一条约1477 bp的片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western Blot证明人MKRN1能以融合蛋白的形式在Si-ha细胞中稳定表达.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1,获得了稳定表达人MKRN1基因的Siha细胞克隆,为进一步研究人MKRN1的功能及其与细胞增殖及凋亡的关系提供了实验基础和重要的细胞模型. 展开更多
关键词 mkrn1 pEGFP-N1载体 SIHA细胞 增殖和凋亡
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GST/MKRN1融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备
2
作者 白云秀 金蕊 +3 位作者 陈皓 林坚 解跃华 黄君健 《生物技术通讯》 CAS 2006年第1期31-33,共3页
目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达GST/MKRN1融合蛋白,亲和层析分离纯化目的蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:MKRN1cDNA全长1449bp,编码482个氨基酸残基。将其基因片段克隆到pGEX-4T-1载体上,获得pGEX-4T-1-MKRN1原核表达重组质粒... 目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达GST/MKRN1融合蛋白,亲和层析分离纯化目的蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:MKRN1cDNA全长1449bp,编码482个氨基酸残基。将其基因片段克隆到pGEX-4T-1载体上,获得pGEX-4T-1-MKRN1原核表达重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得可溶性表达,经谷胱甘肽Sepharose4B介质填充的层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到pGEX-4T-1-MKRN1多克隆抗体。结果:ELISA结果显示血清抗体效价可达到1∶256000。通过Western免疫印迹及免疫细胞荧光分析,自制的多克隆抗体能特异地与MKRN1蛋白相互作用,可用于免疫细胞化学分析。结论:制备了效价和特异性良好的抗MKRN1多克隆抗体,经实验验证获得的免疫血清能够满足针对MKRN1的Western免疫印迹和细胞免疫组化检测的实验要求,为今后深入研究MKRN1表达的组织分布、细胞内定位及与端粒酶催化亚基(hTERT)之间相互作用的生物学意义提供了有用的实验工具。 展开更多
关键词 mkrn1 端粒酶催化亚基 融合表达 多克隆抗体
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沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响 被引量：1
3
作者 张艺 吴道秋 +4 位作者 汤弘婷 李梦醒 刘虹麟 陈忠良 李琴山 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2023年第24期3838-3844,共7页
背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉... 背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的:构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法:采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响。结果与结论:(1)设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3),均成功连入Tet-on载体,且各组载体序列正确;通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞;(2)实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P<0.05),且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复;(3)集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P<0.05);Western blot检测敲低MKRN1后,增殖细胞核抗原表达下调,细胞凋亡相关指标BAX表达增加,Bcl2表达下调,Bcl2/BAX的比值下调(P<0.001);(4)结论:采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株,且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖,并促进其凋亡。通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础,也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。 展开更多
关键词 mkrn1基因 四环素诱导调控表达系统 基因表达调控 慢病毒
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具有MKRN1::BRAF基因融合的食管胃肠道间质瘤1例
4
作者 韦笑 陈洁宇 +3 位作者 辛恺 孙琦 孟凡青 李志文 《中华病理学杂志》 北大核心 2025年第12期1344-1346,共3页
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)为常见的胃肠道间叶源性肿瘤,多携带受体酪氨酸激酶及血小板衍生生长因子受体基因突变,未携带上述基因突变则称为野生型GIST,其中仅极少数野生型GIST涉及基因融合驱动。本文报道1例... 胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)为常见的胃肠道间叶源性肿瘤,多携带受体酪氨酸激酶及血小板衍生生长因子受体基因突变,未携带上述基因突变则称为野生型GIST,其中仅极少数野生型GIST涉及基因融合驱动。本文报道1例老年女性位于食管壁内的具有MKRN1::BRAF基因融合的野生型GIST,镜下见相对一致的梭形细胞交织排列伴间质广泛黏液变性。免疫组织化学阳性表达DOG1、CD34、平滑肌肌动蛋白和SDHB;阴性表达CD117、结蛋白、S-100蛋白、MUC4和STAT6,二代测序检测显示MKRN1::BRAF基因融合。该基因融合的GIST的发现,为进一步了解野生型GIST的分子病理特征和靶向药物的选择提供了重要的参考价值。 展开更多
关键词 mkrn1::BRAF基因融合 胃肠道间质瘤
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MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定
5
作者 石艳艳 刘涛 +5 位作者 张琴 袁成福 卜友泉 易发平 刘革力 宋方洲 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2009年第3期203-207,共5页
目的构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体，并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响，为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具。方法人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS... 目的构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体，并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响，为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具。方法人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA，并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA；在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，感染表达MKRN1的HeLa细胞株，用RT-PCR法及Western印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响，用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化。结果成功构建了MKRN1的siR-NA重组腺病毒载体；MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达，并显著上调细胞中端粒酶的活性。结论构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性，从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具。 展开更多
关键词 腺病毒载体 mkrn1基因 RNA干扰 端粒酶 HELA细胞
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稳定表达Makorin环指蛋白1基因对人宫颈癌Siha细胞的影响
6
作者 罗红权 石艳艳 《重庆医学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第15期1951-1953,共3页
目的研究稳定表达Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因对人宫颈癌细胞系Siha细胞的影响。方法利用作者构建的稳定表达MKRN1基因的Siha细胞株,观察MKRN1基因对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录表达水平、端粒酶活性以及其对细胞周期的影响... 目的研究稳定表达Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因对人宫颈癌细胞系Siha细胞的影响。方法利用作者构建的稳定表达MKRN1基因的Siha细胞株,观察MKRN1基因对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录表达水平、端粒酶活性以及其对细胞周期的影响。结果转染Siha细胞后,稳定表达MKRN1基因明显抑制细胞hTERT基因mRNA水平的表达,明显抑制细胞中端粒酶活性,并且G1期细胞明显增加,而S期细胞明显减少。结论稳定表达MKRN1基因可特异性降低宫颈癌细胞中hTERT mRNA水平,抑制癌细胞内端粒酶活性,抑制宫颈癌细胞增殖,并且阻止宫颈癌细胞从G1期进入S期,促进细胞凋亡。 展开更多
关键词 mkrn1 pEGFP-N1载体 SIHA细胞 端粒酶活性 人端粒酶逆转录酶 细胞周期
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人Makorin环指蛋白1基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定 被引量：2
7
作者 刘涛 石艳艳 +5 位作者 袁成福 张琴 卜友泉 易发平 刘革力 宋方洲 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第5期443-447,共5页
目的构建人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因shRNA真核表达质粒,并检测其对HEK293细胞MKRN1基因表达的影响。方法设计并合成特异性针对人MKRN1基因的小干扰片段,定向克隆至带有卡那霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pGenesil-1... 目的构建人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因shRNA真核表达质粒,并检测其对HEK293细胞MKRN1基因表达的影响。方法设计并合成特异性针对人MKRN1基因的小干扰片段,定向克隆至带有卡那霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列分析,并用脂质体将其转染到HEK293细胞中,观察其对细胞MKRN1基因mRNA转录和蛋白表达水平的影响。结果经酶切鉴定和序列分析证明,3个人MKRN1基因shRNA真核表达质粒及其阴性对照质粒构建正确,转染HEK293细胞后,3个shRNA真核表达质粒在mRNA水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为52.4%、26.2%和42.9%,在蛋白水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为69.1%、27.9%和50.0%。结论已成功构建了人MKRN1基因的shRNA真核表达质粒,为进一步研究MKRN1基因的功能及其与人端粒酶逆转录酶的关系奠定了基础。 展开更多
关键词 Makorin环指蛋白1基因 短发夹RNA 真核表达质粒 人端粒酶逆转录酶
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人Makorin环指蛋白1基因沉默对HEK293细胞的影响
8
作者 刘涛 石艳艳 +5 位作者 袁成福 张琴 卜友泉 易发平 刘革力 宋方洲 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第2期150-153,共4页
目的探讨特异性抑制人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因的表达对HEK293细胞的影响。方法用脂质体将前期筛选出的含最有效干扰序列的人MKRN1基因shRNA真核表达质粒,转染至HEK293细胞中,观察其对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录水平、蛋... 目的探讨特异性抑制人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因的表达对HEK293细胞的影响。方法用脂质体将前期筛选出的含最有效干扰序列的人MKRN1基因shRNA真核表达质粒,转染至HEK293细胞中,观察其对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录水平、蛋白表达水平及细胞增殖的影响。结果人MKRN1基因shRNA真核表达质粒转染HEK293细胞后,在mRNA和蛋白水平均能明显上调细胞hTERT基因的表达,且细胞明显增殖。结论抑制HEK293细胞中人MKRN1基因的表达,可导致hTERT基因mRNA转录水平和蛋白表达水平上调,并促进细胞增殖。 展开更多
关键词 Makorin环指蛋白1基因 短发夹RNA 真核表达质粒 人端粒酶逆转录酶 HEK293细胞
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