弓形虫微线体蛋白MIC3基因的克隆及原核表达 被引量：16

1

作者 江涛 周艳琴 +3 位作者 刘琴 聂浩 姚宝安 赵俊龙 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期587-591,共5页

根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入E.coliDH5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序... 根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入E.coliDH5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定。然后阳性重组质粒转化入E.coliBL21-CodonPlus,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列(AJ132530)的同源性达99.6%,表达的MIC3融合蛋白表观分子量约为66 ku,且可被兔抗弓形虫免疫血清识别。说明所获得的表达蛋白质具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 龚地弓形虫 mic3 基因克隆 表达

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弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及在IBRS-2细胞内的表达 被引量：9

2

作者 江涛 张东林 +2 位作者 聂浩 姚宝安 赵俊龙 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期827-831,共5页

采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质... 采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质粒,并转染IBRS-2细胞,在G418压力下进行筛选,利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达情况。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank上相应基因序列(AJ132530)的一致性达99.9%,构建的真核表达质粒pcMIC3能在转染的IBRS-2细胞中表达分子量约为39.2ku的MIC3,且表达的蛋白质具有良好的免疫活性,为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定了基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 mic3 基因克隆 真核表达

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弓形虫重组MIC3蛋白间接ELISA检测方法的建立 被引量：9

3

作者 白昀 王海燕 +4 位作者 张悦 姚景霆 吴叙苏 刘冬霞 邵国青 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期738-743,共6页

为检测弓形虫特异性抗体,以纯化的重组MIC3蛋白作为包被抗原,用羊抗猪IgG-HRP作为酶标二抗,分别对抗原浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及作用时间等进行了优化,初步建立了检测弓形虫特异性抗体的间接ELISA方法。结果显示,该方法检... 为检测弓形虫特异性抗体,以纯化的重组MIC3蛋白作为包被抗原,用羊抗猪IgG-HRP作为酶标二抗,分别对抗原浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及作用时间等进行了优化,初步建立了检测弓形虫特异性抗体的间接ELISA方法。结果显示,该方法检测猪球虫、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌等阳性血清均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。组内和组间重复性试验的变异系数均小于8%,表明该方法具有较好的重复性。应用所建立的ELISA方法和商品化试剂盒A(IHA)、B(ELISA)同时检测从南京某猪场采集的猪血清样品166份,符合率分别可达94.58%和95.78%。该方法为我国进行弓形虫病的诊断与流行病学调查提供了一种技术手段,并为试剂盒的研制与开发奠定了前期工作基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 mic3蛋白 酶联免疫吸附试验 抗体检测

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γ-干扰素对弓形虫MIC3的基因免疫效果研究 被引量：5

4

作者 江涛 周艳琴 +4 位作者 聂浩 陈声国 方瑞 姚宝安 赵俊龙 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期519-523,共5页

将编码弓形虫微线蛋白3(MIC3)的真核表达质粒pcMIC3和编码γ-干扰素(IFN-γ)的真核表达质粒pcIFN-γ各100μg混合肌肉注射,间隔2周、3次免疫Balb/c小鼠,同时设相同剂量的pcMIC3、pcDNA和PBS免疫对照组。分别以酶联免疫吸附试验(ELISA)... 将编码弓形虫微线蛋白3(MIC3)的真核表达质粒pcMIC3和编码γ-干扰素(IFN-γ)的真核表达质粒pcIFN-γ各100μg混合肌肉注射,间隔2周、3次免疫Balb/c小鼠,同时设相同剂量的pcMIC3、pcDNA和PBS免疫对照组。分别以酶联免疫吸附试验(ELISA)、四氮甲唑蓝(MTT)比色法和乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测试验小鼠血清的特异性抗体、脾淋巴细胞的增殖应答和细胞毒性T细胞(CTL)活性,并观察腹腔接种弓形虫RH株速殖子后质粒的免疫保护效果。结果表明:与其它试验组相比,pcMIC3+pcIFN-γ组试验小鼠在免疫8周后的ELISA抗体水平、脾淋巴细胞的增殖应答和CTL活性显著或极显著提高,免疫小鼠45 d时的生存率为100%,能有效抵抗小剂量弓形虫强毒株的攻击。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 弓形虫微线蛋白3(mic3) Γ-干扰素 基因免疫

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弓形虫MIC3蛋白质的二级结构及B细胞抗原表位预测 被引量：12

5

作者 江涛 马立安 赵俊龙 《长江大学学报（自科版）（下旬）》 CAS 2007年第1期1-4,共4页

目的：预测弓形虫MIC3的二级结构和B细胞抗原表位。方法：采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,经酶切及DNA测序鉴定,推导出相应的氨基酸序列,并与GenBank上已知氨基酸序列（登录号CAB56644）进行比对。然后采... 目的：预测弓形虫MIC3的二级结构和B细胞抗原表位。方法：采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,经酶切及DNA测序鉴定,推导出相应的氨基酸序列,并与GenBank上已知氨基酸序列（登录号CAB56644）进行比对。然后采用Garnier-Robson方法、Chou-Fas-man方法和Karplus-Schulz方法预测蛋白质的二级结构;按Hopp-Woods方案、Emini方案及Jameson-Wolf方案分别预测蛋白质的亲水性、表面可能性以及抗原性指数,并综合分析预测MIC3的B细胞抗原表位。结果：根据扩增基因推导MIC3的氨基酸序列与GenBank上相应氨基酸序列的同源性达99·7%,预测其结构中含有较多的α-螺旋、少量的β-折叠、非常丰富的β-转角和一定的不规则卷曲区段,在MIC3的N端第83~94、第136~141区段和第240~243区段内或其附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域。结论：预测MIC3的二级结构和B细胞表位,为人工合成优势肽段进行弓形虫病的疫苗研究提供依据。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 mic3 基因克隆 二级结构 B细胞抗原表位

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弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究 被引量：7

6

作者 张燕丽 曹丽艳 +5 位作者 芦赟 蔡志杰 王艳华 付宝权 李文卉 张德林 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1299-1302,共4页

根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴... 根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间。结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长。表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体蛋白3(mic3) 核酸疫苗 免疫保护

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弓形虫微线体蛋白MIC3基因的细胞免疫研究 被引量：5

7

作者 江涛 陈芳 +3 位作者 聂浩 方瑞 姚宝安 赵俊龙 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2007年第18期5433-5434,共2页

为了进行弓形虫微线体蛋白MIC3基因的细胞免疫研究。[方法]将弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒pcMIC3以肌肉注射的方式间隔2周3次免疫Balb/c小鼠,同时设空载体pcDNA3.1和PBS对照组。在末次免疫后2周分别以MTT比色法和CTL法测定试验... 为了进行弓形虫微线体蛋白MIC3基因的细胞免疫研究。[方法]将弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒pcMIC3以肌肉注射的方式间隔2周3次免疫Balb/c小鼠,同时设空载体pcDNA3.1和PBS对照组。在末次免疫后2周分别以MTT比色法和CTL法测定试验小鼠脾淋巴细胞的增殖应答和细胞毒性T细胞(CTL)毒活性。[结果]与pcDNA3.1和PBS对照组相比,pcMIC3组小鼠的脾淋巴细胞的增殖应答和CTL毒活性均极显著增强(P<0.01)。[结论]该研究为弓形虫DNA疫苗的进一步研制奠定了基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 mic3 基因免疫

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猪弓形虫重组MIC3蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用 被引量：2

8

作者 白昀 王海燕 +4 位作者 王占伟 纪燕 吴叙苏 刘冬霞 邵国青 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1622-1628,共7页

为获得针对猪弓形虫MIC3蛋白的单克隆抗体,为进一步研制免疫金标试纸条提供材料,作者以纯化的重组MIC3蛋白免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)。经ELISA筛选阳性克隆和亚克隆建株,体内诱生腹水法制备McAb,测定其亚类、... 为获得针对猪弓形虫MIC3蛋白的单克隆抗体,为进一步研制免疫金标试纸条提供材料,作者以纯化的重组MIC3蛋白免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)。经ELISA筛选阳性克隆和亚克隆建株,体内诱生腹水法制备McAb,测定其亚类、效价,进行Western blot分析,并利用胶体金颗粒标记的McAb制备免疫金标试纸条。成功制备了2株稳定分泌抗MIC3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株B7和D3,2株McAb的免疫球蛋白亚类均为IgG2a,其ELISA腹水效价分别为1∶64万和1∶192万,Western blot结果表明,2株McAbs腹水均能分别与纯化的重组MIC3蛋白和猪弓形虫全虫蛋白中大小为56和38ku左右的蛋白发生特异性反应;用纯化后McAb标记的胶体金颗粒制备的免疫金标试纸条可以检测到最低浓度为4×104 CFU·mL-1的弓形虫速殖子。本研究为猪弓形虫病的现场诊断提供了有效的方法,显示出很好的临床应用前景。 展开更多

关键词 岗地弓形虫 mic3蛋白 单克隆抗体 胶体金

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刚地弓形虫NT株MIC3基因的克隆和原核表达 被引量：2

9

作者 白昀 刘茂军 +5 位作者 冯志新 白方方 熊祺琰 孔猛 吴叙苏 邵国青 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第6期1295-1299,共5页

为构建刚地弓形虫微线体蛋白3(MIC3)原核表达体系,获得高纯度MIC3蛋白用于制备单克隆抗体,评价MIC3蛋白在临床诊断方面的应用价值,根据刚地弓形虫MIC3基因编码的已知序列设计引物,应用PCR技术从刚地弓形虫NT株的基因组DNA中扩增出去除... 为构建刚地弓形虫微线体蛋白3(MIC3)原核表达体系,获得高纯度MIC3蛋白用于制备单克隆抗体,评价MIC3蛋白在临床诊断方面的应用价值,根据刚地弓形虫MIC3基因编码的已知序列设计引物,应用PCR技术从刚地弓形虫NT株的基因组DNA中扩增出去除信号肽的MIC3基因,将该基因克隆入pET-32a(+)表达载体,构建pET-32a(+)表达载体,并转化入大肠杆菌(Escherichia.coli)Trans 5α感受态细胞。扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列(AF509564.1)的同源性达99.9%。将阳性重组表达质粒转化入E.coli BL21-codon plus,经IPTG20℃低温诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示,MIC3融合蛋白分子量约为56 000。Western-blotting分析鉴定结果表明,MIC3融合蛋白可被猪抗弓形虫免疫血清所识别。获得的MIC3融合蛋白具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 mic3基因 克隆 原核表达

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MIC3-EGFP融合蛋白真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达 被引量：1

10

作者 张琼 谭逵 +4 位作者 蒋立平 谢荣华 范久波 舒衡平 吴翔 《现代生物医学进展》 CAS 2008年第5期825-827,F0003,共4页

目的:构建以绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C2-MIC3并检测MIC3-EGFP融合蛋白其在COS-7细胞中的表达及定位。方法:通过基因重组的方法构建pEGFP-C2-MIC3重组真核表达质粒,并通过酶切和基因... 目的:构建以绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C2-MIC3并检测MIC3-EGFP融合蛋白其在COS-7细胞中的表达及定位。方法:通过基因重组的方法构建pEGFP-C2-MIC3重组真核表达质粒,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,转染后24h在活细胞状态下用倒置荧光显微镜直接观察MIC3-EGFP融合蛋白在COS-7细胞中的分布。结果:PCR检测,酶切鉴定及测序证实目的基因MIC3正确连接到pEGFP-C2的多克隆位点。pEGFP-C2-MIC3重组体转染COS-7后,在细胞质表达。结论:成功地构建了pEGFP-C2-MIC3融合蛋白真核表达质粒,在COS-7细胞中获得表达。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 mic3 GFP表达载体 表达定位

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人弓形虫病重组蛋白MIC3诊断抗原纯化方法的比较 被引量：2

11

作者 江涛 刘锦宏 赵俊龙 《长江大学学报（自科版）（下旬）》 CAS 2007年第3期217-219,共3页

目的:探讨人弓形虫病重组蛋白MIC3诊断抗原的纯化。方法:采用SDS-PAGE和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测GST亲和层析法与复性透析法对rMIC3纯化的影响。结果:2种方法纯化的rMIC3的SDS-PAGE分析显示,目的蛋白带明显,杂蛋白带少;2种方法纯化... 目的:探讨人弓形虫病重组蛋白MIC3诊断抗原的纯化。方法:采用SDS-PAGE和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测GST亲和层析法与复性透析法对rMIC3纯化的影响。结果:2种方法纯化的rMIC3的SDS-PAGE分析显示,目的蛋白带明显,杂蛋白带少;2种方法纯化的rMIC3的ELISA检测结果差异无显著性(P>0·05)。结论:大量纯化的弓形虫rMIC3为人弓形虫病诊断试剂的研制和推广应用奠定了基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii) mic3 纯化方法

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弓形虫微线体蛋白MIC3基因在大肠杆菌内的高效表达研究 被引量：2

12

作者 江涛 董秀均 汪长城 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第17期7157-7158,共2页

[目的]探讨弓形虫微线体蛋白MIC3基因在大肠杆菌内高效表达的条件。[方法]通过SDS-PAGE分析,研究不同菌液密度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间对MIC3基因在大肠杆菌中表达量的影响。[结果]MIC3基因在大肠杆菌中最适表达条件为:菌液密度OD600... [目的]探讨弓形虫微线体蛋白MIC3基因在大肠杆菌内高效表达的条件。[方法]通过SDS-PAGE分析,研究不同菌液密度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间对MIC3基因在大肠杆菌中表达量的影响。[结果]MIC3基因在大肠杆菌中最适表达条件为:菌液密度OD600为0.4,诱导剂IPTG终浓度为0.4mmol/L和诱导时间3.5h。在该条件下表达的融合蛋白经初步分离提纯后,1 L培养液约含融合蛋白143mg,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的49%。[结论]该研究为研究和制备弓形虫病的rMIC3诊断试剂奠定了基础。 展开更多

关键词 弓形虫 mic3基因 高效表达

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弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达

13

作者 唐莉娜 刘涛 +2 位作者 黄雨婷 徐丽娜 卢丽丹 《山东医药》 CAS 2012年第31期11-13,共3页

目的构建弓形虫微线体蛋白(MIC3)的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白的功能奠定基础。方法 PCR法扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,... 目的构建弓形虫微线体蛋白(MIC3)的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白的功能奠定基础。方法 PCR法扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增法对重组质粒进行鉴定;应用HifectinⅡ真核细胞转染试剂将弓形虫PCDNA-MIC3真核表达质粒转染幼地鼠肾细胞(BHK),表达产物用SDS-PAGE进一步确认,ELISA法检测表达蛋白的免疫原性。结果重组质粒PCDNA-MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1 120 bp大小相同的片段,PCDNA-MIC3能在BHK细胞中高效表达,表达产物能被弓形虫特异性血清所识别。结论成功构建了弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA-MIC3。 展开更多

关键词 弓形虫微线体蛋白 真核表达质粒 PCDNA-mic3表达

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弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

14

作者 唐莉娜 刘涛 +2 位作者 黄雨婷 徐丽娜 卢丽丹 《医学动物防制》 2013年第10期1065-1067,共3页

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法 PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切... 目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法 PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA-MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA-MIC3. 展开更多

关键词 弓形虫微线体蛋白mic3 真核表达质粒 构建

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弓形虫微线体蛋白MIC3的研究进展

15

作者 江涛 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1044-1046,共3页

弓形虫（Toxoplasma gondii）的微线体（mi-croneme）散布于虫体前端棒状体周围,是一种具有分泌功能的细胞器,其分泌的微线体蛋白（mi-croneme proteins MICs）与虫体对宿主细胞的识别和结合密切相关,在虫体入侵宿主细胞早期发挥重要作用。

关键词 微线体蛋白 弓形虫 mic3 分泌功能 宿主细胞 棒状体 虫体 细胞器

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CRISPR/Cas9技术在构建弓形虫微线体蛋白MIC3敲除株上的应用 被引量：4

16

作者 王一凡 张伟超 +5 位作者 吴颢 李龙娇 周艳琴 方瑞 申邦 赵俊龙 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1720-1725,共6页

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种可以感染几乎所有温血动物的专性细胞内寄生原虫。该寄生虫入侵和感染宿主细胞需要其分泌细胞器所分泌的蛋白,其中包括微线体蛋白。近年来,CRISPR/Cas9技术已经成为分子生物学和功能基因组学研究的... 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种可以感染几乎所有温血动物的专性细胞内寄生原虫。该寄生虫入侵和感染宿主细胞需要其分泌细胞器所分泌的蛋白,其中包括微线体蛋白。近年来,CRISPR/Cas9技术已经成为分子生物学和功能基因组学研究的重要工具,本研究利用CRISPR/Cas9技术对弓形虫Ⅰ型虫株RH和Ⅱ型虫株PRU的微线体蛋白mic3基因进行敲除。通过单克隆的筛选和鉴定,成功获得了2种虫株的mic3敲除株。之后对RH敲除株进行研究,发现mic3缺失可以轻微提高虫体在体外培养时的生长速度以及对小鼠的毒力。本研究不仅说明了CRISPR/Cas9技术可以应用到弓形虫的基因敲除和改造上,并且不受弓形虫虫株的限制,同时也为进一步研究mic3在虫体中的功能奠定基础。 展开更多

关键词 弓形虫 CRISPR/Cas9 基因敲除 mic3基因

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弓形虫SAG1-MIC3融合基因真核表达载体的构建与鉴定 被引量：2

17

作者 田小东 古钦民 +4 位作者 周怀瑜 张加勤 丛华 赵群力 李瑛 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2008年第3期190-193,214,共5页

目的构建编码弓形虫RH株膜表面蛋白1(SAG1)和微线体蛋白3(MIC3)的重组真核表达载体pcDNA3.1-SAG1-MIC3并鉴定,为弓形虫疫苗研制作准备。方法采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中分别扩增SAG1和MIC3基因片段,分别克隆入pMD18-T载体,并对重组... 目的构建编码弓形虫RH株膜表面蛋白1(SAG1)和微线体蛋白3(MIC3)的重组真核表达载体pcDNA3.1-SAG1-MIC3并鉴定,为弓形虫疫苗研制作准备。方法采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中分别扩增SAG1和MIC3基因片段,分别克隆入pMD18-T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定;采用亚克隆技术将SAG1和MIC3基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),经含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性重组质粒pcDNA3.1-SAG1-MIC3,PCR、酶切和测序鉴定;采用脂质体法将重组载体转染Hela细胞,经RT-PCR法检测转染细胞转录情况。结果MIC3和SAG1基因的TA-cloning经PCR和酶切鉴定,大小分别为933bp和789bp,与预期值一致;pcNDA3.1-SAG1-MIC3经酶切鉴定,目的片段约为1722bp,与SAG1-MIC3长度相当;测定重组载体的核苷酸序列,与GenBank中的相应序列100%同源;PCR验证载体携带的SAG1-MIC3融合基因在Hela细胞中转录生成mRNA。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1-SAG1-MIC3,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 刚地弓形虫 mic3 SAG1 疫苗 构建 表达

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弓形虫微线体蛋白MIC3及其构建的核酸疫苗研究进展

18

作者 段志强 嵇辛勤 《上海畜牧兽医通讯》 2010年第2期26-27,共2页

关键词 弓形虫病 核酸疫苗 mic3 蛋白 刚地弓形虫 爬行类动物 弓形体病 弓浆虫病

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弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性 被引量：1

19

作者 唐菲 韩思琪 +1 位作者 吴焜 陈晓光 《中国热带医学》 CAS 2013年第7期786-788,792,共4页

目的克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析。方法应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱... 目的克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析。方法应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确。两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Western-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性。结论原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础。 展开更多

关键词 弓形虫 mic3 基因表达 免疫反应性

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刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3的克隆与原核表达 被引量：4

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作者 苟惠天 王艳华 +3 位作者 李文卉 李航 付宝权 张德林 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2008年第5期1-5,共5页

根据Genbank中编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术对刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3进行克隆、表达及鉴定.结果表明:克隆的MIC3基因的开放阅读框与Genbank收录的MIC3基因在核菌酸和氨基酸水平上高度一致,说明弓... 根据Genbank中编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术对刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3进行克隆、表达及鉴定.结果表明:克隆的MIC3基因的开放阅读框与Genbank收录的MIC3基因在核菌酸和氨基酸水平上高度一致,说明弓形虫MIC3蛋白的高度保守性;构建的原核细胞表达质粒PET-MIC3表达产物分子量为46 ku,且经Western-blot显示可被猪抗弓形虫免疫血清识别. 展开更多

关键词 刚地弓形虫 微线体 克隆 表达

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