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HV-MDV变异株meq基因编辑缺失疫苗候选毒株的构建及免疫保护评价
1
作者 各思雨 樊剑鸣 +9 位作者 滕蔓 郑鹿平 刘金玲 韩放 张卓 张多 罗琴 赵东 柴书军 罗俊 《病毒学报》 北大核心 2025年第3期868-879,共12页
马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的一种危害严重的家禽免疫抑制病与肿瘤病,给全球养殖业造成巨大经济损失。尽管MD疫苗免疫对该病具有显著防控效果,但长期的免疫压力不断促进MDV毒... 马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的一种危害严重的家禽免疫抑制病与肿瘤病,给全球养殖业造成巨大经济损失。尽管MD疫苗免疫对该病具有显著防控效果,但长期的免疫压力不断促进MDV毒力增强及变异。近年来,新出现的MDV特超强毒株(Very virulent plus MDV,vv+MDV)和特超强MDV(Hypervirulent MDV,HV-MDV)变异株已突破经典MD疫苗的免疫保护,亟需研发新一代高效疫苗。本文以2021年分离鉴定的HV-MDV变异株HNXZ05为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功构建了一株meq基因编辑缺失的疫苗候选毒株XZ05Δmeq。经PCR鉴定、DNA测序分析、间接免疫荧光实验(IFA)、实时荧光定量PCR(qPCR)以及连续传代分析,证实该毒株的meq基因已被完全编辑缺失、稳定传代后无回复突变。动物免疫保护评价实验显示,用候选疫苗株XZ05Δmeq免疫SPF鸡,对HV-MDV变异株HNSQ01的攻击可提供82.4%的免疫保护;与阴性对照组相比,免疫攻毒组实验鸡的体重及免疫器官指数均未受到显著影响。上述数据表明,XZ05Δmeq可作为MD疫苗候选毒株,用于进一步开发新型高效的MD疫苗,以应对当前鸡群HV-MDV变异株流行带来的防控新挑战。 展开更多
关键词 马立克病 meq基因 基因编辑 CRISPR/Cas9 新型疫苗 免疫保护
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马立克病病毒特超强变异株meq基因缺失株构建及作为疫苗候选株的鉴定 被引量：2
2
作者 张卓 樊剑鸣 +9 位作者 滕蔓 张多 刘金玲 郑鹿平 赵东 各思雨 韩放 罗琴 柴书军 罗俊 《病毒学报》 CSCD 北大核心 2024年第6期1341-1353,共13页
马立克病(Marek’s disease,MD)是一种严重危害家禽健康养殖的免疫抑制病与肿瘤病,由致病性的血清1型MDV(Marek’s disease virus serotype 1,MDV-1)毒株感染引起。近年来,即使在已接种疫苗的鸡群中,MD病例的发生及危害在全球范围内仍... 马立克病(Marek’s disease,MD)是一种严重危害家禽健康养殖的免疫抑制病与肿瘤病,由致病性的血清1型MDV(Marek’s disease virus serotype 1,MDV-1)毒株感染引起。近年来,即使在已接种疫苗的鸡群中,MD病例的发生及危害在全球范围内仍呈不断上升趋势。此前研究发现,经典的MD疫苗已不能很好保护当前流行的MDV特超强毒株,尤其是新出现的特超强MDV(Hypervirulent MDV,HV-MDV)变异株,这意味着新一代高效的MD疫苗亟待研发。本研究中,以近期最新分离鉴定的HV-MDV变异株SDCW01为亲本毒株,首先将其在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)上连续传代以降低对宿主潜在的免疫抑制性,然后利用基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术敲除致瘤基因meq,构建meq基因编辑缺失的疫苗候选毒株。经过PCR扩增鉴定、病毒克隆纯化、DNA测序、间接免疫荧光试验(IFA)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及病毒体外增殖曲线测定等试验,证实获得一株meq基因完全缺失的MDV毒株,命名为SD01△meq。进一步传代培养及PCR鉴定结果显示,SD01△meq传代稳定性良好,meq基因的编辑缺失未发生回复突变,且不影响其它MDV基因的表达及体外复制能力。1日龄SPF鸡攻毒实验结果显示,与亲本毒株SDCW01相比,SD01△meq完全丧失了对宿主的免疫抑制和致病性,其诱导的MD发病率、致死率及肿瘤率均为0%。上述数据表明,本研究成功构建获得了一株meq基因编辑缺失疫苗候选毒株SD01△meq,为后续新型高效MD疫苗的研发奠定了重要基础。 展开更多
关键词 马立克病病毒 meq基因 CRISPR/Cas9 基因编辑 新型疫苗
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一株马立克病病毒特超强变异株meq基因编辑缺失候选疫苗毒株的构建与鉴定 被引量：1
3
作者 张多 滕蔓 +9 位作者 张卓 刘金玲 郑鹿平 各思雨 韩放 罗琴 柴书军 赵东 余祖华 罗俊 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5672-5683,共12页
马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,该病可用疫苗进行预防和控制,但在长期免疫压力下MDV的毒力持续增强,经典MD疫苗已难以对当前流行的特超强MDV(HV-MDV)变异株提供良好的免疫保护,亟需研... 马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,该病可用疫苗进行预防和控制,但在长期免疫压力下MDV的毒力持续增强,经典MD疫苗已难以对当前流行的特超强MDV(HV-MDV)变异株提供良好的免疫保护,亟需研发新一代MD高效疫苗。本文以HV-MDV变异株HNSQ01为亲本毒株,在CEF上连续传代之后,利用CRISPR/Cas9系统对其meq基因进行编辑,通过一系列试验鉴定和分析,最终建立一株meq基因编辑缺失的MD疫苗候选毒株,命名为SQ01Δmeq。1日龄SPF鸡攻毒试验结果显示,在77 d试验周期内,亲本毒株HNSQ01不仅严重抑制感染鸡生长并导致免疫抑制,而且导致100%的MD发病率、100%致死率及80%的肉眼观察肿瘤发生率;但SQ01Δmeq未引起感染鸡的生长及免疫抑制,而且MD发病率、致死率及肿瘤发生率均为0%,表明其对宿主无致病性,生物安全性良好。本研究建立的meq基因编辑缺失MDV毒株SQ01Δmeq,为后续研发新型高效的MD疫苗奠定了重要基础。 展开更多
关键词 马立克病 MDV meq CRISPR/Cas9 基因编辑 基因缺失 新型疫苗
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马立克病病毒meq基因缺失毒株HN302Δmeq的构建及致病性分析 被引量：1
4
作者 张志会 滕蔓 +9 位作者 刘金玲 郑鹿平 王伟东 张文凯 张多 李林燕 张卓 柴书军 樊剑鸣 罗俊 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第10期71-79,共9页
马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,严重危害世界养禽业。随着MDV持续进化及毒力增强,急需研发新型高效的MD疫苗以加强该病的有效防控。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以MDV变异株HN30... 马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,严重危害世界养禽业。随着MDV持续进化及毒力增强,急需研发新型高效的MD疫苗以加强该病的有效防控。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以MDV变异株HN302为亲本毒株,成功构建了meq基因缺失的毒株HN302Δmeq,经过PCR扩增鉴定及测序分析,证实meq基因缺失且传代稳定。间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析均证实HN302Δmeq感染鸡胚成纤维细胞(CEF)中无meq基因表达,并且meq基因的缺失不影响其他病毒基因的表达。利用RT-qPCR分析HN302Δmeq在CEF中的体外增殖曲线,结果显示meq基因的缺失不影响MDV体外复制。1日龄SPF鸡攻毒试验结果显示,与亲本毒株HN302相比,HN302Δmeq对宿主无致病性,其诱导的MD发病率、死亡率和肿瘤发生率均为0,且未观察到明显的免疫器官萎缩。上述数据表明,HN302Δmeq的毒力明显丧失,具备继续作为疫苗候选株开展相关研究的可能性。本研究成功构建了MDV变异株HN302的meq基因缺失毒株,为后续MDV的致病机制及新型疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡 马立克病病毒 meq基因 CRISPR/Cas9 基因编辑 致病性
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基于马立克病病毒Meq蛋白单克隆抗体的免疫组化诊断方法的建立
5
作者 王润锦 孙英杰 +5 位作者 石彬 吴少鹏 邵红霞 钱琨 叶建强 秦爱建 《中国家禽》 北大核心 2024年第1期70-76,共7页
为了对临床上马立克病(MD)准确诊断,研究利用杆状病毒表达系统表达马立克病病毒(MDV)强毒株Meq重组蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术研制MDV Meq蛋白特异性单克隆抗体,并以此为基础建立MD诊断方法。结果显示:试验成功制备了4株Meq蛋白特异... 为了对临床上马立克病(MD)准确诊断,研究利用杆状病毒表达系统表达马立克病病毒(MDV)强毒株Meq重组蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术研制MDV Meq蛋白特异性单克隆抗体,并以此为基础建立MD诊断方法。结果显示:试验成功制备了4株Meq蛋白特异性单克隆抗体,分别命名为MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10;Western blot结果证明这些单克隆抗体不仅能与体外表达的Meq蛋白反应,而且能识别MD肿瘤细胞系MSB-1中的Meq蛋白和MD肿瘤组织细胞中的Meq蛋白;以Meq蛋白单克隆抗体成功建立免疫组化诊断MD的方法,该方法特异性强,结果稳定,易观察判定。研究表明,试验制备了4株Meq蛋白单克隆抗体(MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10),基于此建立的免疫组化MD诊断方法为临床MD鉴别诊断提供技术支撑。 展开更多
关键词 马立克病 meq蛋白 单克隆抗体 免疫组化 诊断
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宁都黄鸡马立克氏病的诊断及其病毒meq基因克隆及序列分析
6
作者 吴虹瑾 黄曼孜 +4 位作者 胡煜 吴欢生 高晓娜 郭小权 谢华丽 《生物灾害科学》 2024年第4期554-560,共7页
【目的】为诊断江西宁都某鸡场黄鸡发病原因。【方法】通过病理剖检、PCR检测确诊该鸡场黄鸡患马立克氏病,并对该病毒meq基因全序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析。【结果】病鸡表现“劈叉”神经症状,剖检结果发现病鸡的心脏、肝... 【目的】为诊断江西宁都某鸡场黄鸡发病原因。【方法】通过病理剖检、PCR检测确诊该鸡场黄鸡患马立克氏病,并对该病毒meq基因全序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析。【结果】病鸡表现“劈叉”神经症状,剖检结果发现病鸡的心脏、肝脏和脾脏等器官表面均出现大小不一的灰白色结节,腺胃糜烂、出血。PCR鉴定结果为马立克氏病病毒(marek’s disease virus,MDV)阳性,随后对MDV的meq基因进行了扩增、克隆和测序,MDV meq基因全长为1020bp。与参考毒株相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为98.8%~99.8%和97.1%~99.7%,存在9个氨基酸突变位点,其中有3段4-脯氨酸(PPPP)重复序列,2段发生(PPPP-PR/APP)氨基酸突变。【结论】该毒株与近年国内强毒株或超强毒株在同一分支上,且氨基酸突变基本相同,推测该分离毒株毒力至少为强毒株。研究为临床马立克氏病诊断提供理论依据,为分析MDV变异提供重要参考。 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 PCR检测 meq基因 遗传进化 序列分析
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4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析 被引量：18
7
作者 施维松 刘长军 +4 位作者 张艳萍 秦运安 张晓巍 李晶梅 陈洪岩 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期117-125,共9页
根据鸡马立克氏病病毒（MDV）GA株Meq基因序列，设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物，利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段，进行克隆测序，对4株MDV分离毒... 根据鸡马立克氏病病毒（MDV）GA株Meq基因序列，设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物，利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段，进行克隆测序，对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析。序列比较显示，不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守，它们相互间氨基酸序列的同源性在96．5％～99．7％之间。4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变；3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变，这两处点突变是国内近几年分离株所特有的，国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化。分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性，但是这些规律性还有待进一步研究。 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 meq基因 序列比较 定点突变
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潜伏期马立克氏病病鸡血清型病毒L-meq、meq基因的比较及遗传分析 被引量：7
8
作者 潘风光 郑梅竹 +5 位作者 邹亚学 孙莹 艾永兴 崔文璟 罗翔丹 张玉静 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期43-45,50,共4页
从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用... 从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L-meq基因消失的原因,试验对L-meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明,L-meq基因中含有9个PRR(proline-rich-reapts)区域,meq中含有6个PRR区域,从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关,该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因,同时也意味着L-meq基因对于潜伏期的维持是必要的。 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 L—mep meq PCR 鸡
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超强马立克氏病病毒的鉴定及病毒Meq基因序列的比较 被引量：9
9
作者 龚振华 张康 +6 位作者 郭光礼 鱼海琼 王丽萍 于建敏 李金平 侯广宇 王建琳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1501-1506,共6页
对1例感染超强马立克氏病病毒的病例进行确诊,对感染病毒的Meq基因进行比较分析。采用病理解剖、PCR检测、病毒分离、动物试验和Meq基因序列分析,对感染病毒进行研究。病理解剖结果为病死鸡的肝脏、脾脏、腺胃、肌胃、十二指肠表现为肿... 对1例感染超强马立克氏病病毒的病例进行确诊,对感染病毒的Meq基因进行比较分析。采用病理解剖、PCR检测、病毒分离、动物试验和Meq基因序列分析,对感染病毒进行研究。病理解剖结果为病死鸡的肝脏、脾脏、腺胃、肌胃、十二指肠表现为肿瘤病变。PCR检测结果为病死鸡的组织病料感染马立克氏病病毒。病毒分离和动物试验结果证明该感染病毒是1株马立克氏病超强毒株,该病毒可以引起免疫过CVI988疫苗的鸡发病。Meq基因序列分析表明该病毒与7株马立克氏病病毒参考毒株的同源性为98.8%~99.6%,该病毒在Meq的第115、119和176位氨基酸突变同国内流行株,该检测病毒在Meq的第217位氨基酸突变同超超强马立克氏病毒株。结果表明,通过病理解剖、PCR检测、基因序列分析、病毒分离和动物试验,确诊病鸡感染超强马立克氏病病毒。 展开更多
关键词 马立克氏病 PCR meq基因 同源性
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马立克氏病病毒不同致病型meq基因的比较研究 被引量：38
10
作者 韦平 崔治中 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期88-92,共5页
为了研究马立克氏病病毒 (MDV)的 meq基因与不同毒株致病性的关系 ,应用PCR技术扩增了不同致病型MDV毒株的meq基因 ,测定和比较了它们的核苷酸和氨基酸序列。这些毒株包括 :国际通用I型疫苗毒CV1988/Rispens株和中国特有的疫苗毒 814株... 为了研究马立克氏病病毒 (MDV)的 meq基因与不同毒株致病性的关系 ,应用PCR技术扩增了不同致病型MDV毒株的meq基因 ,测定和比较了它们的核苷酸和氨基酸序列。这些毒株包括 :国际通用I型疫苗毒CV1988/Rispens株和中国特有的疫苗毒 814株、强毒GA株 (vMDV)、特超强毒 6 48A株 (vv +MDV)以及 6个广西分离到的野毒株。结果发现 ,MDV不同致病型的meq基因序列相对比较保守 ,它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均在 95 .6 %～ 99.7%。但是 ,与所有测试的致病性MDV毒株相比 ,二个I型疫苗毒CV1988/Rispens株和 814株均在阅读框的核苷酸序列中缺失第 5 75～ 5 77位 3个碱基(CAC) ,导致一个氨基酸 (脯氨酸 )的缺失。该缺失性突变恰恰位于 meq基因的多脯氨酸功能区的一个重复序列 (EELCAQLC STPPPPI)之中。该缺失性突变与一个疫苗毒株失去致肿瘤性是否有关 。 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 meq基因 序列比较 缺失性突变 毒株致病 PCR技术
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马立克氏病病毒MEQ蛋白单克隆抗体的制备及应用研究 被引量：9
11
作者 韦平 崔治中 +2 位作者 龙进学 金文杰 刘岳龙 《广西大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 2002年第1期5-9,共5页
基因表达与病毒感染细胞及致瘤能力之间关系的阐明 ,将有助于我们对马立克氏病病毒 (MDV) meq基因功能的了解 .该研究利用通过杆状病毒载体在昆虫细胞系 SF9上高度表达的 MEQ蛋白免疫 BALB/ c小鼠 ,然后收获其免疫脾细胞与肿瘤细胞系 SP... 基因表达与病毒感染细胞及致瘤能力之间关系的阐明 ,将有助于我们对马立克氏病病毒 (MDV) meq基因功能的了解 .该研究利用通过杆状病毒载体在昆虫细胞系 SF9上高度表达的 MEQ蛋白免疫 BALB/ c小鼠 ,然后收获其免疫脾细胞与肿瘤细胞系 SP2 / 0通过 PEG于体外融合 .获得的杂交瘤细胞被克隆并通过与MDV感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)做免疫荧光试验 (FA) ,进行其分泌抗 MEQ单克隆抗体 (Mc Ab)能力的筛选 .获得 4株稳定产生抗 MEQ蛋白 Mc Ab的杂交瘤细胞 ,其中 3 G1 2 E6通过 FA和免疫酶组化技术能够检测到 MDV致瘤株感染的 CEF及自然 MD肿瘤细胞中表达的 meq基因产物 .研究的结果首次发现 ,MDV致瘤株 GA、RB1 B感染的 CEF及自然 MD肿瘤细胞中均有 meq基因的表达 ,但在弱毒疫苗株 CVI988感染的 CEF和免疫鸡组织细胞中则未检测到 MEQ.作者认为这是由于 meq基因在致瘤株中表达水平高 ,而在非致瘤株中表达水平低所致 ,这可能是决定 MDV毒力 (virulence)或致瘤性(oncogenicity)的关键因素之一 . 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 meq 蛋白 单克隆抗体 制备 应用研究 功能分析 免疫酶组化技术 鸡疾病 基因表达
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鸡马立克氏病病毒流行毒株高代次细胞毒株Meq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因变异分析 被引量：4
12
作者 刘爱玲 刘长军 +5 位作者 张艳萍 李晶梅 施维松 闫福海 张锋 程志伟 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期368-375,共8页
根据鸡马立克氏病病毒（Marek′s disease virus,MDV）GA株的全基因组序列,设计合成了用于扩增MDVMeq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因的引物,分别扩增4株MDV流行强毒株的高代次细胞毒株（L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C）及相... 根据鸡马立克氏病病毒（Marek′s disease virus,MDV）GA株的全基因组序列,设计合成了用于扩增MDVMeq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因的引物,分别扩增4株MDV流行强毒株的高代次细胞毒株（L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C）及相应亲本毒株（L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY）、MDV强毒J-1株、814疫苗株等10个毒株的Meq、RLORF4、RLORF12和132bpr基因。经克隆测序后,分析4个高代次细胞毒株中相应基因的变异,并与MDV强毒J-1株、814疫苗株及GenBank中已发表MDV毒株的相应序列进行比较。序列比对分析发现,L-CZp75C株Meq基因的第625位存在碱基C插入突变;L-ZYp75C株Meq基因第529位存在碱基C插入,且第602位缺失碱基T,从而致使Meq基因推导的相应氨基酸序列在第177~200位发生移码突变。L-SYp85C株RLORF4基因在第215~265位缺失51bp,致使该基因推导的氨基酸序列相应缺失17个氨基酸残基。分析RLORF12基因序列,发现L-MSp75C株在第67位存在碱基T缺失,814疫苗株在第18~86位缺失69 bp,缺失位置均位于复制起点（Origin of replication,,Ori）内;而L-ZYp75C毒株在RLORF12基因第168~174位存在独特的TGTTGGG碱基缺失。4个细胞高代次毒株的132 bpr基因的扩增结果表明,该基因在病毒基因组中的拷贝数明显增加,可达到10个拷贝以上。上述分析结果提示,4株MDV流行强毒株经体外连续传代后,MDV致瘤相关基因Meq、RLORF4、RLORF12和132bpr基因等发生了缺失突变或插入突变。 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 meq RLORF4 RLORF12 132bpr
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Ⅰ型马立克氏病强弱毒株Meq基因的克隆与序列分析 被引量：7
13
作者 丁维民 王旋 +4 位作者 张训海 魏建忠 赵磊 龚争 谢海晶 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第30期14604-14606,共3页
[目的]为获得MDV-1强弱毒株Meq基因序列的差异。[方法]根据GENE BANK登录的马立克氏病毒Meq基因序列,设计一对引物,采用PCR技术对MDV-I型国内商用CVI988/Rispens疫苗株和参考强毒京-1(BJ-1)株的Meq基因进行了扩增,并将扩增产物提纯后克... [目的]为获得MDV-1强弱毒株Meq基因序列的差异。[方法]根据GENE BANK登录的马立克氏病毒Meq基因序列,设计一对引物,采用PCR技术对MDV-I型国内商用CVI988/Rispens疫苗株和参考强毒京-1(BJ-1)株的Meq基因进行了扩增,并将扩增产物提纯后克隆到pcDNA3.1(+)上,进行酶切鉴定及测序验证。[结果]CVI988疫苗株和BJ-1强毒株的Meq基因开放阅读框(ORF)长度分别为1200和1197bp。通过与国际标准强毒GA株Meq基因进行比较,BJ-1株和CVI988株Meq基因中分别有一段180和177bp的插入序列,第211位核苷酸由G变为T,导致第71位氨基酸由丙氨酸A变为丝氨酸S;同时,CVI988株Meq基因第228位核苷酸由A变为G,导致第77位氨基酸由赖氨酸K变为谷氨酸E。此外,与BJ-1株相比,CVI988株Meq基因在576～578bp之间缺失3个碱基(ACC),并导致第193位脯氨酸P的缺失,该突变发生在一个多脯氨酸重复区域内。[结论]MDV-1强弱毒株Meq基因序列存在明显差异,为从其分子水平进行区分及生物学功能的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 MDV meq基因 克隆 序列分析
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马立克氏病病毒致瘤相关基因meq在不同病变组织中的变化 被引量：5
14
作者 付本懂 王鲁 +5 位作者 申海清 褚秀玲 王春元 郭志廷 伊鹏霏 韦旭斌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期620-623,共4页
以MSB-1肿瘤细胞建立的马立克氏病为病理模型,利用PCR技术扩增不同病变组织中的meq基因,构建meq基因重组阳性质粒,测定和比较它们的核苷酸和氨基酸序列。结果显示,与L-meq(1 200 bp)和标准株GA的meq(1 020 bp)比较,MSB-1细胞和脾脏肿瘤... 以MSB-1肿瘤细胞建立的马立克氏病为病理模型,利用PCR技术扩增不同病变组织中的meq基因,构建meq基因重组阳性质粒,测定和比较它们的核苷酸和氨基酸序列。结果显示,与L-meq(1 200 bp)和标准株GA的meq(1 020 bp)比较,MSB-1细胞和脾脏肿瘤组织的meq基因(1 197 bp)、羽髓meq基因(1 017 bp)分别相应缺失3个碱基(CCA);MSB-1细胞和脾脏肿瘤组织的meq基因具有与L-meq相同的180 bp插入序列;氨基酸序列也发生相应变化。结果表明,meq基因在不同病变组织中的核苷酸序列发生了变化,这种变化可能与马立克氏病病毒的致瘤机制有关。 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 meq基因 病变组织
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鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析 被引量：4
15
作者 屈素洁 邹联斌 +6 位作者 胡杰 粟艳琼 莫胜兰 施开创 尹彦文 李军 张步娴 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第1期45-49,共5页
为研究鸡马立克氏病病毒（MDV）广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株... 为研究鸡马立克氏病病毒（MDV）广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,Meq基因序列全长为1 020bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 meq基因 基因克隆 序列分析
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马立克氏病病毒meq基因缺失株细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定 被引量：3
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作者 孙鹏 苏帅 +2 位作者 李延鹏 丁家波 崔治中 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第2期285-291,共7页
本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒（MDV）感染性克隆基因组中细菌人工染色体（BAC）序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9—1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞（CEF）拯救SC9—1重组病毒。将SC9—1... 本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒（MDV）感染性克隆基因组中细菌人工染色体（BAC）序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9—1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞（CEF）拯救SC9—1重组病毒。将SC9—1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养，利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1～10代不同代次SC9—1重组病毒的DNA作为模板，利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物，以MDV保守基因pp38作为内参，对不同代次病毒基因组中BAc序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9—1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列，通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示，1～5代病毒DNA均能扩增出600bp的特异性目的条带，证实病毒的基因组中含有BAC序列。6～10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带，证实病毒基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR结果显示，病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少，直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中，对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定，结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点，序列同源性均在99．7％以上。结果表明，利用cre／loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDVmeq基因缺失株SC9—1的BAC序列完全敲除掉，且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性。 展开更多
关键词 马立克氏病 meq基因 细菌人工染色体 敲除 鉴定
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马立克氏病病毒meq基因功能研究 被引量：20
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作者 韦平 崔治中 L.F.Lee 《广西科学》 CAS 2003年第1期52-62,共11页
从马立克氏病病毒(MDV)不同致病型毒株meq基因序列、meq基因产物及其细胞内表达特性和meq蛋白生物学功能的研究探讨马立克氏病病毒致瘤基因meq功能。完成了648A、CVI988/Rispens、814、广西地方毒株G2、N、0093、0095、0297、0304共9个... 从马立克氏病病毒(MDV)不同致病型毒株meq基因序列、meq基因产物及其细胞内表达特性和meq蛋白生物学功能的研究探讨马立克氏病病毒致瘤基因meq功能。完成了648A、CVI988/Rispens、814、广西地方毒株G2、N、0093、0095、0297、0304共9个MDV毒株meq基因的序列测定。MDV不同致病型毒株的。meq基因序列相对比较保守,它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高;与所有7个致瘤的MDV毒株相比,在2个MDV-1弱毒疫苗CVl988/Rispens株和814株发现有二个特征性位点突变;此外,还在其ORF中首次发现含15个氨基酸残基(EELCAQLCSTPPPPI)的2个重复和含6个氨基酸残基(PPICTP)的4个重复,全分布在MEQ蛋白C-端的转录激活域内。MEQ蛋白的表达仅局限于感染细胞的核内,而且随感染时间增加,具有从核质向核仁和核膜转移趋向;Western Blotting和免疫沉淀试验证实重组杆状病毒感染细胞裂解物中有大小约为60 kD的特异带。利用表达的MEQ蛋白产物免疫BALB/c小鼠,获得的杂交瘤细胞被克隆并与MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)做免疫荧光试验(FA),获得4株稳定产生抗MEQ蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,其中3G12E6单克隆抗体能够检测到MDV致瘤株感染的CEF及自然MD肿瘤细胞中表达的meq基因产物,而CVl988/Rispens感染的细胞则未检测到。发现细? 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 致瘤基因 meq基因 单克隆抗体 基因功能 畜禽疾病
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马立克氏病病毒河南分离株Meq基因的克隆与序列分析 被引量：2
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作者 余祖华 滕蔓 +5 位作者 丁轲 闵亚杰 禹乐乐 宿靖伟 程相朝 罗俊 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第8期15-20,共6页
【目的】了解马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）河南分离株Meq基因的分子特性,为中原地区MDV流行情况提供较详细的信息,为更好地防控MD奠定基础。【方法】应用PCR方法分别扩增了17株MDV河南省野毒分离株的Meq基因片段,克隆... 【目的】了解马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）河南分离株Meq基因的分子特性,为中原地区MDV流行情况提供较详细的信息,为更好地防控MD奠定基础。【方法】应用PCR方法分别扩增了17株MDV河南省野毒分离株的Meq基因片段,克隆测序后,将各毒株Meq基因序列与vv＋MDV 648A株、vvMDV RBIB株、vMDV GA株、mMDV疫苗株CVI988株和814株的Meq基因序列进行比对分析。【结果】17株分离株中除HNGS201和HNLC503的Meq基因扩增产物较预期稍大外,其余15个的片段长度为1 020bp,与预期长度相符;MDV河南分离株之间及其与参考毒株Meq基因的核苷酸同源性为99.0%～100%,部分毒株Meq基因的氨基酸序列有10个位点的氨基酸存在规律性突变;MDV河南分离株和参考株共组成3个进化分支,其中强毒株GA、RB1B和648A位于一个分支,分离株HNGS201、HNLH304、HNLC503与mMDV毒株CVI988和814位于同一分支,其余14株分离株位于另一个较大的分支。【结论】河南省可能流行着不同毒力的MDV,一些mMDV毒株的Meq蛋白存在59个或60个氨基酸的插入。 展开更多
关键词 马立克氏病病毒 meq基因 克隆 序列分析
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鸡MDV meq基因对鸡胚成纤维细胞p53基因表达的影响 被引量：2
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作者 潘风光 郑梅竹 +4 位作者 李赫 邹亚学 孙莹 崔文璟 张玉静 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期243-246,共4页
利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR的方法检测了鸡马立克氏病病毒(MDV)meq基因对鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)p53基因表达的影响,并用本室改进的TRAP法测定了端粒酶活性。结果显示,meq基因激活了CEF中... 利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR的方法检测了鸡马立克氏病病毒(MDV)meq基因对鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)p53基因表达的影响,并用本室改进的TRAP法测定了端粒酶活性。结果显示,meq基因激活了CEF中原癌基因p53的表达,并且48 h的表达量是72 h的18.8倍;在对CEF和转染前后48、72 h的细胞端粒酶活性测定时也发现,端粒酶活性在转染后48 h是转染后72 h的16倍。流式细胞仪检测发现meq基因使S期细胞比例较转染前有所上升,进一步印证了meq基因是MDV中致瘤的主要因素。 展开更多
关键词 MDV meq基因 P53基因
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阴极电泳涂料的制备及MEQ值的测定 被引量：5
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作者 赵晓磊 何为 《化学研究与应用》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期330-333,共4页
采用封闭的甲苯二异氰酸酯作为固化剂合成了环氧树脂阴极电泳涂料,讨论了基料树脂的合成条件,最终确定了合成树脂的反应条件为:温度80℃,反应时间为2h,并采用了简便的方法测定了槽液的MEQ值,在150v下电泳3m in,得到外观平整,综合性能优... 采用封闭的甲苯二异氰酸酯作为固化剂合成了环氧树脂阴极电泳涂料,讨论了基料树脂的合成条件,最终确定了合成树脂的反应条件为:温度80℃,反应时间为2h,并采用了简便的方法测定了槽液的MEQ值,在150v下电泳3m in,得到外观平整,综合性能优良的漆膜。 展开更多
关键词 电泳涂料 meq值 环氧树脂 甲苯二异氰酸酯
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