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基于过表达IRA、IRB蛋白的MDCK细胞构建胰岛素受体结合能力体外检测模型
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作者 周小磊 褚成龙 +3 位作者 赵天宇 李珍珍 王泽 王晓良 《药物评价研究》 北大核心 2025年第8期2247-2252,共6页
目的 分别构建稳定过表达胰岛素受体(IR)A、IRB蛋白的犬肾细胞MDCK,用于胰岛素受体结合能力体外检测。方法 利用慢病毒感染法在MDCK细胞内分别稳定过表达IRA、IRB蛋白,构建MDCK-IRA、MDCK-IRB细胞,同时制备感染空白对照质粒的MDCK-mock... 目的 分别构建稳定过表达胰岛素受体(IR)A、IRB蛋白的犬肾细胞MDCK,用于胰岛素受体结合能力体外检测。方法 利用慢病毒感染法在MDCK细胞内分别稳定过表达IRA、IRB蛋白,构建MDCK-IRA、MDCK-IRB细胞,同时制备感染空白对照质粒的MDCK-mock细胞,Western blotting检测IR蛋白表达,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测IR、IRB m RNA水平。进行^(125)I标记胰岛素(1 nmol·L^(-1))与MDCK-IRA、MDCK-IRB细胞结合动力学实验,筛选孵育温度、时间、细胞接种数;以中国食品药品检定研究院(中检院)生物甘精胰岛素粉末与来得时公司生产的甘精胰岛素注射液作为胰岛素受试品,进行与^(125)I标记胰岛素的竞争结合实验。结果 与MDCK-mock细胞比较,MDCK-IRA与MDCK-IRB细胞均高表达IR蛋白;MDCK-IRA与MDCK-IRB细胞均检测出转录较高水平的IR mRNA,但IRB特异引物只能在MDCK-IRB细胞中检测到IRB m RNA,均显著升高(P<0.01、0.001)。2种细胞模型具有胰岛素结合作用,MDCK-IRA与胰岛素的结合能力强于MDCK-IRB细胞,^(125)I标记胰岛素与MDCK-IRA、MDCK-IRB细胞最佳孵育温度与时间为4℃条件下孵育10 h,最适接种细胞数量为每孔5×10^(5)个细胞以内。不同浓度来得时和中检院甘精胰岛素对^(125)I标记胰岛素与IRA结合活性抑制作用的半数抑制浓度(IC_(50))值分别为3.698、5.829 nmol·L^(-1),对^(125)I标记胰岛素与IRB结合活性抑制作用IC_(50)值分别为4.977、9.068 nmol·L^(-1)。结论 过表达IRA、IRB蛋白的MDCK细胞模型简便、功能稳定,可用于体外检测胰岛素制剂与IR结合活性。 展开更多
关键词 胰岛素受体 MDCK-IRA mdck-irb 竞争结合实验 甘精胰岛素
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