MCHR2在CHO细胞中的稳定表达及其信号通路分析 被引量：3

1

作者 杨俊霞 袁成福 +5 位作者 石华 魏丽丽 陈济 易发平 马永平 宋方洲 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期294-299,共6页

目的构建人MCHR2基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并分析MCHR2介导的信号转导通路。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,定向插入到真核表达载体pcDNA3·1(+),经酶切和测序鉴定... 目的构建人MCHR2基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并分析MCHR2介导的信号转导通路。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,定向插入到真核表达载体pcDNA3·1(+),经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,经RT-PCR和Western blot鉴定后,通过测定细胞内cAMP、Ca2+浓度的改变分析MCHR2的信号转导通路。结果成功构建了pcDNA3·1-MCHR2真核表达载体并稳定转入CHO细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因,MCH作用于MCHR2后不影响细胞内cAMP生成,可促使细胞内钙库释放Ca2+,进而使胞内Ca2+浓度出现明显而短暂的升高,提示MCHR2的信号转导通路主要是与Gq蛋白偶联。结论人MCHR2的稳定表达和信号转导通路分析为进一步体外研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础。 展开更多

关键词 mchr2 真核表达载体 稳定转染 基因表达 信号转导

暂未订购

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立 被引量：2

2

作者 袁成福 杨俊霞 +3 位作者 魏丽丽 石华 陈济 宋方洲 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期32-35,共4页

目的构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂... 目的构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、W estern b lot及免疫荧光法检测MCHR2的表达。结果成功构建了pcDNA3.1(+)/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础。 展开更多

关键词 mchr2 真核表达载体 稳定转染的CHO细胞系 基因表达

暂未订购

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立 被引量：2

3

作者 杨俊霞 石华 +5 位作者 魏丽丽 袁成福 陈济 易发平 马永平 宋方洲 《第四军医大学学报》 北大核心 2007年第3期210-213,共4页

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系.方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染... 目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系.方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,WesternBlot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因.结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础. 展开更多

关键词 mchr2 真核表达载体 转染 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

敲减人MCHR2基因抑制CHO细胞的放射性配体受体结合能力及Ca^2＋释放 被引量：1

4

作者 袁成福 杨俊霞 +5 位作者 刘革力 卜友泉 张琴 易发平 马永平 宋方洲 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期60-68,共9页

研究人黑色素浓集激素受体2（MCHR2）基因特异的小发夹RNA（shRNA）真核表达载体pGenesil-1-MCHR2-shRNA对MCHR2表达及特征的影响．将pGenesil-1-MCHR2-shRNA转染到稳定表达人MCHR2基因的CHO细胞中，通过RT-PCR和Western印迹检测MCHR2... 研究人黑色素浓集激素受体2（MCHR2）基因特异的小发夹RNA（shRNA）真核表达载体pGenesil-1-MCHR2-shRNA对MCHR2表达及特征的影响．将pGenesil-1-MCHR2-shRNA转染到稳定表达人MCHR2基因的CHO细胞中，通过RT-PCR和Western印迹检测MCHR2表达的变化；放射性配体结合实验（RBA）检测受体最大结合容量Bmax及平衡解离常数Kd值的变化；钙流检测实验观察配体MCH刺激后单个细胞Ca^2＋释放及MCH半数有效浓度EC50的变化,与转染pGenesil-1空载体组比较，pGenesil-l-MCHR2-shRNA能使MCHR2基因mRNA表达减少45．8％～66．4％；蛋白表达减少44．2％～81．0％；Bmax减少39．4％～78．7％，Kd值升高40．9％～81．9％；EC50升高114．8％～822．4％．MCHR2基因shRNA真核表达载体能有效抑制MCHR2基因的表达，减少Bmax、升高虬值及EC50，从而对MCHR2生物活性等特征产生影响。 展开更多

关键词 mchr2 shRNA真核表达载体 基因表达 生物特征

暂未订购

豚鼠MCHR2基因外显子1的克隆及序列分析 被引量：1

5

作者 杨俊霞 易发平 +1 位作者 宋方洲 周岐新 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第21期2167-2170,共4页

目的探明豚鼠体内MCHR2基因的表达情况,为构建动物模型提供实验依据。方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜豚鼠大脑组织的总RNA中扩增MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,从豚鼠脑组织中提取基因组DNA,PCR扩增MCHR2基因外显子1... 目的探明豚鼠体内MCHR2基因的表达情况,为构建动物模型提供实验依据。方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜豚鼠大脑组织的总RNA中扩增MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,从豚鼠脑组织中提取基因组DNA,PCR扩增MCHR2基因外显子1的序列,克隆入pUCm-T载体后进行序列分析。结果RT-PCR法未获得目的片段;由基因组DNA扩增出的MCHR2基因外显子1的序列片段长183bp,与GenBank登录的人、猴、白鼬、犬的MCHR2序列比对,在第47位后面多了一个碱基———A,由于移码错译而导致提前出现终止密码,从而缩短了预测的开放阅读框架。结论豚鼠体内的MCHR2基因是无功能的假基因。 展开更多

关键词 mchr2 基因克隆 序列分析 豚鼠 肥胖

在线阅读 下载PDF 职称材料

MCHR2在豚鼠大脑组织内的表达 被引量：1

6

作者 汪长东 朱勇 +6 位作者 袁成福 卜友泉 易发平 刘革力 宋方洲 胡平生 Tomas Hokfelt 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期589-592,共4页

肥胖症是当今危急人类健康的一大难题.研究肥胖的机制,并达到防御和治疗肥胖症是研究的最终目的.自2001年以来,研究发现,黑色素浓集激素受体2(melanin-concentrating hormonereceptor-2,MCHR2)与肥胖间存在紧密联系.但研究进展缓慢,主... 肥胖症是当今危急人类健康的一大难题.研究肥胖的机制,并达到防御和治疗肥胖症是研究的最终目的.自2001年以来,研究发现,黑色素浓集激素受体2(melanin-concentrating hormonereceptor-2,MCHR2)与肥胖间存在紧密联系.但研究进展缓慢,主要瓶颈是没找到合适的动物模型.本课题通过对多种动物的筛选,首次发现豚鼠大脑中存在MCHR2的高度表达,并运用RT-PCR、Northern印迹和Western印迹等方法进行了验证.这一结果为将豚鼠作为MCHR2功能研究的动物模型提供了实验依据. 展开更多

关键词 黑色素浓集激素受体2(mchr2) 豚鼠 肥胖 动物模型

原文传递

鸭MCHR2的基因克隆及蛋白表达鉴定

7

作者 朱勇 汪长东 +11 位作者 刘革力 袁成福 卜友泉 易发平 焦庆昉 艾青 刘竹 兰欢 武向梅 宋方洲 胡平生 Tomas Hokfelt 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期1520-1522,共3页

目的筛查能够稳定表达黑色素浓集激素受体2(MCHR2)基因的动物,为构建动物模型提供实验依据。方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜的鸭、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、狗、羊、猪等大脑组织中提取总RNA,以此扩增MCHR2基... 目的筛查能够稳定表达黑色素浓集激素受体2(MCHR2)基因的动物,为构建动物模型提供实验依据。方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜的鸭、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、狗、羊、猪等大脑组织中提取总RNA,以此扩增MCHR2基因的全长cDNA编码区序列;利用Western blot检测鸭、犬和猪的大脑海马区及皮质区MCHR2蛋白的表达情况。结果通过RT-PCR获得鸭、犬、猪脑组织中的目的片段;通过Western blot验证了MCHR2蛋白在鸭脑组织中具有高表达。结论将鸭作为构建动物模型的对象,用于MCHR2基因的相关功能研究具有可行性。 展开更多

关键词 mchr2 MCR RT-PCR WESTERN BLOT 鸭 肥胖

暂未订购

人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定

8

作者 袁成福 杨俊霞 +6 位作者 魏丽丽 刘革力 石华 陈济 易发平 马永平 宋方洲 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期355-358,共4页

目的构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响。方法根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋... 目的构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响。方法根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响。结果通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中。四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%。结论针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础。 展开更多

关键词 基因 mchr2 短发夹RNA 真核表达载体 细胞转染

暂未订购

稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系的建立

9

作者 张琴 卜友泉 +3 位作者 易发平 袁成福 袁飞 宋方洲 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期896-899,共4页

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)真核表达载体pcDNA3.1(+)MCHR2,转染SHG-44细胞,建立稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系。方法:PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到pcDNA3.1(+),构建真核表... 目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)真核表达载体pcDNA3.1(+)MCHR2,转染SHG-44细胞,建立稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系。方法:PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SHG-44细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的SHG-44细胞系,用RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测MCHR2的表达。结果:扩增出MCHR2的全长cDNA;成功构建pcDNA3.1(+)MCHR2;RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测到MCHR2的表达,提示成功建立了稳定、高表达MCHR2的SHG-44细胞株。结论:MCHR2-SHG-44细胞株的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定了良好的实验基础。 展开更多

关键词 mchr2 真核表达载体 稳定转染的SHG-44细胞系 基因表达

暂未订购

稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立

10

作者 张琴 卜友泉 +3 位作者 易发平 袁成福 秦琴 宋方洲 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期258-262,F0002,共6页

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法:采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA... 目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法:采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果:扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论:成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。 展开更多

关键词 mchr2 真核表达载体 稳定转染的SH-SY5Y细胞系 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

人MCHR2基因shRNA真核表达载体体外转染

11

作者 袁成福 刘革力 +3 位作者 卜友泉 易发平 马永平 宋方洲 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2008年第4期379-384,共6页

目的构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其转染效率。方法根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到HEK293细胞... 目的构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其转染效率。方法根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到HEK293细胞中,用荧光显微镜和流式细胞仪观察荧光表达,鉴定转染效率。结果与结论成功构建4条表达shRNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞系中,转染效率达50%以上。 展开更多

关键词 mchr2 短发夹RNA 真核表达载体 细胞转染

在线阅读 下载PDF 职称材料

pGenesil-1-MCHR2-shRNA对MCHR2与其放射性配体结合的影响

12

作者 袁成福 《湖北民族学院学报（医学版）》 2007年第4期5-9,共5页

目的研究人黑色素浓集激素受体2（MCHR2）基因特异的小发夹RNA（shRNA）真核表达载体（pGenesil-1-MCHR2-shRNA）对MCHR2与其放射性配体结合特征的影响。方法将pGenesil-1-MCHR2-shRNA表达载体转染到稳定表达人MCHR2基因的中国仓鼠卵巢... 目的研究人黑色素浓集激素受体2（MCHR2）基因特异的小发夹RNA（shRNA）真核表达载体（pGenesil-1-MCHR2-shRNA）对MCHR2与其放射性配体结合特征的影响。方法将pGenesil-1-MCHR2-shRNA表达载体转染到稳定表达人MCHR2基因的中国仓鼠卵巢细胞CHO中，通过放射性配体结合实验（RBA）检测受体最大结合容量（Bmax）及平衡解离常数（Kd值）的变化。结果与转染pGenesil-1空载体组比较，pGenesil-1-MCHR2-shRNA使Bmax减少39．4％～78．7％，Kd值升高40．9％～81．9％。结论MCHR2基因shRNA真核表达载体能有效减少Bmax、升高kd值，为利用RNA干扰技术研究人MCHR2基因功能奠定良好的实验基础。 展开更多

关键词 mchr2 shRNA真核表达载体 放射性配体结合特征

暂未订购

以黑色素浓集荷尔蒙受体为靶点高通量筛选细胞模型的建立

13

作者 成伟家 张娅玲 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期252-257,共6页

背景:研究表明,激活黑色素浓集荷尔蒙(melanin concentrating hormone,MCH)受体可引起细胞内钙浓度的变化,通过检测钙浓度的变化可以反映受体的功能。目的:建立以MCHR为靶点的高通量筛选细胞模型。设计、时间及地点:对比观察,于2006-09... 背景:研究表明,激活黑色素浓集荷尔蒙(melanin concentrating hormone,MCH)受体可引起细胞内钙浓度的变化,通过检测钙浓度的变化可以反映受体的功能。目的:建立以MCHR为靶点的高通量筛选细胞模型。设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/11在中国科学院北京基因组研究所药理组实验室完成。材料:人胎脑TotalRNA购自STRATAGENE公司,经中国科学院北京基因组研究所药理组反转录为cDNA文库;人胚肾细胞系HEK293由中国医学科学院基础所细胞中心提供。方法:首先从人胎脑cDNA文库中得到MCHR1和MCHR2的全长cDNA,并将其克隆到pcDNA3.1载体中,构建人MCHR1,MCHR2基因的表达质粒,继而转染人胚肾293,通过G418筛选建立了稳定的表达人MCHR1和MCHR2的细胞株;进一步通过人MCHR的内源激动剂MCH及人MCHR1的特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175来检测细胞株的功能和稳定性。主要观察指标:通过对钙离子敏感的荧光指示剂Fluo-3,检测细胞内部反映钙离子浓度变化的荧光值,通过荧光值计算出反映受体活性的半数有效浓度EC50和半数抑制浓度IC50值,以及反映系统可靠性的Z因子。结果:实验建立了稳定表达MCHR1,MCHR2的高通量药物筛选细胞模型,对所建立细胞模型的功能、稳定性、特异性、高通量等特点进行检测。MCHR1细胞模型对MCH的EC50值为17.72nmol/L,对起特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175的EC50和IC50分别为37.42nmol/L和13.6nmol/L。而MCHR2细胞模型对MCH的EC50值为3nmol/L,对HD-01和ATC0175则没有反应,MCHR1和MCHR2细胞模型的第1代和25代对激动剂和拮抗剂的反应是基本一样的。MCHR1和MCHR2细胞模型的Z因子为0.61和0.73,并对筛选条件进行了优化,确定了实验系统中细胞的数量为3×104个/孔和二甲基亚砜的终浓度为不超过10g/L系统最佳。结论:采用钙流测定方法可成功建立稳定的MCHR1和MCHR2筛选细胞株及可靠的筛选方法,该细胞模型可同时用于人MCHR激动剂与拮抗剂的筛选。 展开更多

关键词 MCHR1 mchr2 钙流检测 高通量筛选

暂未订购