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EB病毒vIL-10基因的表达与功能研究
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作者 刘瑞坪 陈彦妤 +5 位作者 王俊颖 孙德月 辛宪云 张栋 薛庆节 王晖 《中国病原生物学杂志》 北大核心 2025年第2期131-135,140,共6页
目的构建EB病毒vIL-10基因的原核表达载体并纯化vIL-10,进行小鼠实验探究其对MC38肿瘤细胞的作用,为进一步探究vIL-10的在机体内的作用及其机制奠定基础。方法根据vIL-10的DNA序列,设计引物并通过PCR扩增获得vIL-10基因;构建重组质粒vIL... 目的构建EB病毒vIL-10基因的原核表达载体并纯化vIL-10,进行小鼠实验探究其对MC38肿瘤细胞的作用,为进一步探究vIL-10的在机体内的作用及其机制奠定基础。方法根据vIL-10的DNA序列,设计引物并通过PCR扩增获得vIL-10基因;构建重组质粒vIL-10-pGEX-4T-1,将重组质粒转化E.coli.DH5α;抗性平板筛选阳性菌落,提取质粒后做PCR、双酶切及测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒vIL-10-pGEX-4T-1转化E.coil.DE3并用氨苄西林筛选、IPTG诱导表达,超声波破碎菌体提取蛋白并做SDS-PAGE、Western blot鉴定;大量培养阳性菌株,破碎菌体后提取蛋白,利用GST标签纯化vIL-10,取少量纯化产物再次做SDS-PAGE、Western blot鉴定;凝血酶切掉GST标签,透析袋除盐、浓缩蛋白后测定蛋白含量,备用;收集MC38细胞,皮下注射6周龄体重相近的野生型、IL-10基因敲除型C57BL/6J小鼠,3周后取成功构建的肿瘤模型小鼠,按400μg/kg肿瘤周围浸润注射vIL-10,每7天注射1次,共注射2次。末次注射7d后处死小鼠,剥离肿瘤称重并记录、分析。结果PCR获得的vIL-10基因大小约为513bp,重组质粒vIL-10-pGEX-4T-1的PCR、双酶切结果均符合预期,基因测序结果与vIL-10模板序列相符;转化vIL-10-pGEX-4T-1的E.coil.DE3经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示与对照组对比可见45ku条带,Western blot显示该蛋白表达成功;阳性菌株经大量培养,提取蛋白后用GST标签进行纯化,Western blot结果显示该蛋白能被特异性纯化,经切割透析浓缩后测定蛋白含量为0.56mg/mL;动物实验结果显示,野生型(C57BL/6J)小鼠注射vIL-10蛋白组比未注射组肿瘤重量明显增加(P<0.05);IL-10基因敲除(IL-10-KO)小鼠注射vIL-10组比未注射组肿瘤重量明显增加(P<0.001)。结论经Western blot鉴定含有重组质粒vIL-10-pGEX-4T-1的E.coil.DE3能成功表达vIL-10,动物实验表明vIL-10能够促进肿瘤生长。为探究vIL-10对肿瘤的作用研究及其机制奠定了基础。 展开更多
关键词 EB病毒 vIL-10 原核表达 GST标签纯化 mc38
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吡西达替尼抑制单核细胞向肿瘤微环境的聚集并减少M2型肿瘤相关巨噬细胞的数量 被引量：3
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作者 李晓婷 决利利 +1 位作者 王世广 庞晓斌 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期307-312,共6页
目的研究吡西达替尼(pexidartinib)对单核细胞向肿瘤微环境的聚集与M2型肿瘤巨噬细胞极化的影响。方法皮下接种结肠癌MC38细胞建立结肠癌细胞小鼠体内成瘤模型,观察吡西达替尼对小鼠体内的成瘤速度、荷瘤小鼠存活,免疫荧光组织化学染色... 目的研究吡西达替尼(pexidartinib)对单核细胞向肿瘤微环境的聚集与M2型肿瘤巨噬细胞极化的影响。方法皮下接种结肠癌MC38细胞建立结肠癌细胞小鼠体内成瘤模型,观察吡西达替尼对小鼠体内的成瘤速度、荷瘤小鼠存活,免疫荧光组织化学染色检测肿瘤组织F4/80阳性肿瘤相关巨噬细胞(TAM)数量;分离增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠外周血单核细胞经尾静脉过继转移给荷瘤小鼠后,用吡西达替尼处理,流式细胞术检测肿瘤组织中单核细胞聚集及F4/80和CD206阳性细胞的比例。结果吡西达替尼减缓MC38结肠癌细胞在体内的成瘤速度并提高荷瘤小鼠的生存率,还可减少肿瘤微环境中TAM的数量和M2型TAM的形成,并抑制外周血的单核细胞向肿瘤微环境的聚集。结论吡西达替尼抑制单核细胞向肿瘤微环境的聚集并减少M2型TAM的数量。 展开更多
关键词 吡西达替尼 结肠癌 mc38细胞 肿瘤微环境 巨噬细胞 极化
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基于靶点人源化小鼠的PD-1/CTLA-4双特异性抗体及其IgG1亚型的抗癌活性评价 被引量：2
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作者 胡红梅 于秋红 +2 位作者 杨毅 沈月雷 刘柏宏 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期380-386,共7页
目的:构建基于靶点人源化小鼠的程序性死亡受体-1(PD-1)/细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)双特异性抗体(BsAb)并对BsAb及其IgG1亚型进行抗癌活性评价和探讨其潜在的作用机制。方法:构建和扩增并纯化不同结构及抗体亚型的PD-1/CTLA-4抗体... 目的:构建基于靶点人源化小鼠的程序性死亡受体-1(PD-1)/细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)双特异性抗体(BsAb)并对BsAb及其IgG1亚型进行抗癌活性评价和探讨其潜在的作用机制。方法:构建和扩增并纯化不同结构及抗体亚型的PD-1/CTLA-4抗体BsAb1、BsAb2和BsAb3,对纯化BsAb进行靶点亲和力检测,采用荧光素酶报告基因实验和FCM检测抗体的生物学活性。基于B-hPD-1-hPD-L1-h CTLA-4人源化小鼠的MC38-hPD-L1结肠癌细胞移植瘤模型对BsAb进行体内药效评估,并通过移植瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析PD-1/CTLA-4抗体的作用机制。结果:成功制备的BsAb1、BsAb2及BsAb3对靶点PD-1和CTLA-4均有较强的特异性亲和力、对靶点通路均有不同程度的阻滞活性,均明显抑制移植瘤的生长(P<0.05或P<0.01)。IgG1亚型BsAb体内药效更优(P<0.01),TIL分析发现BsAb2-IgG1明显增加了CTL百分率(P<0.05),显著降低了肿瘤浸润Treg细胞百分率(P<0.01),使肿瘤免疫微环境更有利于杀伤肿瘤细胞;增强ADCC活性的Fc突变体亚型BsAb2-SI则不能进一步提高抗肿瘤活性。结论:具有Fc效应功能的IgG1亚型的PD-1/CTLA-4抗体体内抗癌药效更优,因其可以更好地清除TIL中的Treg细胞。 展开更多
关键词 程序性死亡受体-1 细胞毒性T淋巴细胞抗原-4 双特异性抗体 抗体亚型优化 肿瘤 mc38-hPD-L1结肠癌细胞
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