【目的】制备番鸭丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase,MAPK1)蛋白多克隆抗体,鉴定其特异性与适用性,并探究MAPK1蛋白在卵泡颗粒细胞及卵泡中的表达定位,为研究其在番鸭卵泡发育与生殖调控中的功能提供试验工具。【...【目的】制备番鸭丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase,MAPK1)蛋白多克隆抗体,鉴定其特异性与适用性,并探究MAPK1蛋白在卵泡颗粒细胞及卵泡中的表达定位,为研究其在番鸭卵泡发育与生殖调控中的功能提供试验工具。【方法】以番鸭卵巢组织cDNA为模板,通过PCR扩增MAPK1基因并测序,运用生物信息学工具分析MAPK1蛋白理化性质及主要抗原表位,筛选免疫原区段。对免疫原序列进行大肠杆菌密码子优化并人工合成,经同源重组克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达载体pET30a-MAPK1并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。在HB-PET自诱导培养基中表达、纯化MAPK1重组蛋白,将纯化蛋白与QuickAntibody-Rabbit8W佐剂混合后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。采用ELISA、Western blotting、细胞免疫荧光(CIF)、组织免疫荧光(TIF)和免疫组化(IHC)等方法检测多克隆抗体的效价、特异性与适用性,并以颗粒细胞标志物促卵泡激素受体(FSHR)为参照分析MAPK1表达定位。【结果】成功克隆了番鸭MAPK1基因,大小约1107 bp,编码368个氨基酸。MAPK1蛋白理论分子质量约42 ku。生物信息学预测显示,MAPK1蛋白不含信号肽和跨膜结构;第50—100、200—300和250—350位氨基酸区段亲水性良好,第30—90和200—300氨基酸区段抗原指数较高,第30—70、120—150、200—260及320—360位氨基酸区段的氨基酸表面暴露概率较大。MAPK1蛋白二级结构以α-螺旋为主,包含典型激酶保守结构,活化环呈无规则卷曲状态,主要定位于细胞质和细胞核。综合蛋白特性,最终筛选了第4—364位氨基酸作为候选免疫原区段。成功构建原核重组表达载体pET30-MAPK1,MAPK1重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量约48 ku。成功制备了兔抗鸭MAPK1蛋白多克隆抗体,ELISA结果显示该抗体效价达1∶102400;Western blotting、CIF、TIF和IHC结果显示,制备的多克隆抗体可特异识别MAPK1重组蛋白及番鸭卵泡颗粒细胞和卵泡中的内源性MAPK1蛋白。在颗粒细胞中,MAPK1主要定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核;在卵泡中,MAPK1主要分布于卵泡颗粒细胞层,表达定位与FSHR基本一致。【结论】试验成功制备了番鸭MAPK1多克隆抗体,该抗体特异性良好,适用于番鸭卵泡相关细胞与组织样本中MAPK1的免疫学检测。研究结果为MAPK1在卵泡发育及生殖调控中的功能研究提供了技术支撑。展开更多
目的:基于生物信息学探讨香叶醇靶向MAPK1(Mitogen-Activated Protein Kinase 1)抗骨肉瘤的机制。方法:从TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems)数据库下载人类软骨肉瘤相关基因数据集GSE16088数据集,其中GSE16088数据集中共有8...目的:基于生物信息学探讨香叶醇靶向MAPK1(Mitogen-Activated Protein Kinase 1)抗骨肉瘤的机制。方法:从TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems)数据库下载人类软骨肉瘤相关基因数据集GSE16088数据集,其中GSE16088数据集中共有8例样本,其中健康人群4例、骨肉瘤患者4例,从铁死亡数据库筛选铁死亡相关基因并对香叶醇靶基因与铁死亡相关基因取交集,从TARGET数据库中分析骨肉瘤中MAPK1与铁死亡核心调控子GPX4(Glutathione Peroxidase 4)的相关性。结果:通过TCMSP数据库确认了香叶醇的38个可能靶点,通过铁死亡数据库确认出567个铁死亡相关基因;香叶醇靶基因与铁死亡相关基因取交集确认五个香叶醇靶向的铁死亡基因:HMOX1(Heme Oxygenase 1),MAPK1,TP53(Tumor Protein P53),PTGS2(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2),HRAS(Harvey Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog)通过GSE16088数据集分析发现与正常组织相比,MAPK1在骨肉瘤中显著高表达,TARGET数据库分析表明,骨肉瘤中MAPK1与铁死亡核心调控子GPX4正相关。结论:香叶醇可能通过靶向MAPK1调控铁死亡过程,从而发挥抗骨肉瘤的作用。展开更多
文摘目的:基于生物信息学探讨香叶醇靶向MAPK1(Mitogen-Activated Protein Kinase 1)抗骨肉瘤的机制。方法:从TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems)数据库下载人类软骨肉瘤相关基因数据集GSE16088数据集,其中GSE16088数据集中共有8例样本,其中健康人群4例、骨肉瘤患者4例,从铁死亡数据库筛选铁死亡相关基因并对香叶醇靶基因与铁死亡相关基因取交集,从TARGET数据库中分析骨肉瘤中MAPK1与铁死亡核心调控子GPX4(Glutathione Peroxidase 4)的相关性。结果:通过TCMSP数据库确认了香叶醇的38个可能靶点,通过铁死亡数据库确认出567个铁死亡相关基因;香叶醇靶基因与铁死亡相关基因取交集确认五个香叶醇靶向的铁死亡基因:HMOX1(Heme Oxygenase 1),MAPK1,TP53(Tumor Protein P53),PTGS2(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2),HRAS(Harvey Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog)通过GSE16088数据集分析发现与正常组织相比,MAPK1在骨肉瘤中显著高表达,TARGET数据库分析表明,骨肉瘤中MAPK1与铁死亡核心调控子GPX4正相关。结论:香叶醇可能通过靶向MAPK1调控铁死亡过程,从而发挥抗骨肉瘤的作用。
