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副结核分支杆菌MAP0862-2191c串联蛋白的原核表达及反应原性检测
1
作者 郝彦儒 郭号 +3 位作者 谢梦圆 陈坚 杨文洁 徐晓静 《动物医学进展》 北大核心 2025年第4期28-34,共7页
副结核分支杆菌(MAP)由于其胞内寄生的特性,难以在早期发现,待发现后往往已经不再具备治疗价值,因此寻找并制备出能同时在早晚期都有显著标识作用的抗原蛋白,有利于更好地诊断牛副结核病。通过生物信息学软件对MAP的MAP0862和MAP2191c... 副结核分支杆菌(MAP)由于其胞内寄生的特性,难以在早期发现,待发现后往往已经不再具备治疗价值,因此寻找并制备出能同时在早晚期都有显著标识作用的抗原蛋白,有利于更好地诊断牛副结核病。通过生物信息学软件对MAP的MAP0862和MAP2191c两种蛋白进行一级、二级及三级结构上的理化性质、抗原性分析及相对位置建模预测,判断串联蛋白重组表达的可行性;使用柔性肽短链序列(G4S)2连接两段序列构建了重组表达载体pET30a-MAP6291c,将其导入至BL21(DE3)原核表达载体中进行诱导表达,并进行Western blot分析。结果显示,预测MAP0862-2191c串联蛋白为一个有多个抗原表位的亲水性的蛋白,两种蛋白在三级结构上无相互影响,因此可以进行原核表达;构建合成的融合基因双酶切结果与预期结果相符;经SDS-PCGE凝胶电泳检测成功表达串联蛋白,大小约68.5 ku,与预期蛋白大小相符;分别选择鼠源抗His抗体及MAP阳性牛血清作为一抗进行Western blot验证,均显示MAP0862-2191c重组蛋白有单一的特异性条带,位置及大小与预期结果一致,证明了该串联蛋白制备的正确性,并且具有良好的反应原性,能够作为牛副结核病的诊断蛋白,为后续建立牛副结核病的诊断方法奠定了良好基础。 展开更多
关键词 副结核分支杆菌 map0862 MAP2191c 蛋白预测 串联表达
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副结核分枝杆菌MAP0862-1595融合蛋白的表达及间接ELISA检测方法的建立
2
作者 李晓宇 马聿田 +5 位作者 李阳 梁雯 阿丽雅 吉林台 马慧君 希尼尼根 《内蒙古农业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第6期1-9,共9页
为了建立基于重组蛋白MAP0862-1595的山羊副结核病诊断方法,本研究筛选副结核分枝杆菌的2个基因MAP0862与MAP1595,通过重叠延伸PCR技术将获得MAP0862-1595融合基因与重组质粒载体pEASY-T1及表达重组质粒载体pET30a连接,通过Western-blo... 为了建立基于重组蛋白MAP0862-1595的山羊副结核病诊断方法,本研究筛选副结核分枝杆菌的2个基因MAP0862与MAP1595,通过重叠延伸PCR技术将获得MAP0862-1595融合基因与重组质粒载体pEASY-T1及表达重组质粒载体pET30a连接,通过Western-blot方法验证MAP0862-1595重组蛋白的反应原性,通过以纯化后的重组蛋白MAP0862-1595作为包被抗原和反应条件优化构建间接ELISA法。结果显示:重叠延伸PCR扩增出MAP0862和MAP1595融合基因片段,长度为1601 bp;成功构建克隆重组质粒pEASY-MAP0862-1595和表达重组质粒pET30a-MAP0862-1595;MAP0862-1595重组蛋白大小约为70 kDa,主要以包涵体形式存在;Western-blot验证该蛋白能与副结核分枝杆菌阳性血清特异性结合反应。将纯化后MAP0862-1595蛋白以1μg/孔包被,一抗血清以1∶400稀释,以5%脱脂乳进行封闭,二抗以1∶50000稀释,成功构建ELISA检测法。ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为副结核病的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 map0862 MAP1595 串联表达
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禽分枝杆菌副结核亚种map0862基因与map2154c基因的串联重组表达 被引量：5
3
作者 迟磊 刘思国 +7 位作者 王春来 宫强 赵昆 刘建东 王勇 云孟克 刘慧芳 赵福广 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期856-859,共4页
以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增出了map0862基因和map2154c基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得了融合基因map0862-2154c。将融合基因与原核表达载体pET32a(+)连接,构建了重组质粒pET0862-2154c。将重... 以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增出了map0862基因和map2154c基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得了融合基因map0862-2154c。将融合基因与原核表达载体pET32a(+)连接,构建了重组质粒pET0862-2154c。将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导后对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测。结果表明,表达的重组蛋白map0862-2154c的分子质量为76 ku,可用于建立诊断副结核病的ELISA。 展开更多
关键词 禽分枝杆菌副结核亚种 map0862基因 map2154c基因 重叠延伸剪接技术 重组表达
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副结核分枝杆菌MAP0862蛋白的表达及在间接ELISA中的初步应用 被引量：5
4
作者 张振 冯宇 +5 位作者 张阁 朱良全 蒋卉 丁家波 赵鹏 常维山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期789-795,共7页
本研究的目的是探索副结核分枝杆菌特异性蛋白MAP0862在牛副结核病血清学诊断中的作用,建立牛副结核病特异性ELISA诊断方法。将通过原核表达获得的副结核特异性蛋白MAP0862纯化并定量后作为包被抗原,经过一系列条件优化后初步建立了牛... 本研究的目的是探索副结核分枝杆菌特异性蛋白MAP0862在牛副结核病血清学诊断中的作用,建立牛副结核病特异性ELISA诊断方法。将通过原核表达获得的副结核特异性蛋白MAP0862纯化并定量后作为包被抗原,经过一系列条件优化后初步建立了牛副结核病间接ELISA诊断方法。使用牛副结核阳性血清、牛布病阳性血清、牛结核阳性血清、卡介苗免疫牛血清、牛大肠杆菌阳性血清以及健康阴性牛血清对该方法的验证表明其具有良好的特异性。使用该方法对300份临床血清进行检测,结果表明该方法与IDEXX副结核检测试剂盒的符合率为94.3%。基于副结核特异性蛋白质MAP0862建立的间接ELISA诊断方法能有效检测牛副结核病。 展开更多
关键词 牛副结核病 map0862蛋白 ELISA
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副结核分枝杆菌map0862基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量：6
5
作者 牟巍 蒋菲 +3 位作者 何宇 丁家波 彭小兵 蒋玉文 《中国兽药杂志》 2010年第8期10-12,21,共4页
为探索MAP0862蛋白在分枝杆菌感染鉴别诊断中的作用,研究构建了MAP0862的原核表达map0862-pET32a(+)质粒,并对其进行了诱导表达。以副结核分枝杆菌P10基因组DNA为模板,经PCR方法扩增副结核分枝杆菌map0862基因片段,将其克隆到原核表达载... 为探索MAP0862蛋白在分枝杆菌感染鉴别诊断中的作用,研究构建了MAP0862的原核表达map0862-pET32a(+)质粒,并对其进行了诱导表达。以副结核分枝杆菌P10基因组DNA为模板,经PCR方法扩增副结核分枝杆菌map0862基因片段,将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中。将重组子转化到大肠杆菌BL21(DE3),在E.coli中诱导表达带组氨酸标签的map0862-pET32a(+)的融合蛋白。结果显示,经IPTG诱导表达出约55 kD的融合蛋白,用副结核阳性血清进行Western blot检测,证明MAP0862重组蛋白具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 map0862基因 克隆 表达
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副结核分支杆菌MAP0862蛋白的表达及临床应用 被引量：3
6
作者 解晓莉 孙阳阳 +5 位作者 程凯慧 楚会萌 张亮 王基隆 杨美 杨宏军 《山东农业科学》 2019年第2期111-116,共6页
本研究以腹泻牛粪便基因组DNA为模板,扩增MAP0862基因,构建重组表达载体pET-30a(+)-MAP0862和pEGX-6P-1-MAP0862,通过原核表达系统表达His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白,经纯化后制备兔源高免血清,建立ELISA特异性检测方法,最后将纯化蛋白... 本研究以腹泻牛粪便基因组DNA为模板,扩增MAP0862基因,构建重组表达载体pET-30a(+)-MAP0862和pEGX-6P-1-MAP0862,通过原核表达系统表达His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白,经纯化后制备兔源高免血清,建立ELISA特异性检测方法,最后将纯化蛋白和ELISA方法用于牛副结核病临床样品检测,并对检测数据进行分析。结果表明,以MAP0862蛋白为检测原建立的ELISA检测方法在临床样品检测中具有较高的特异性和敏感性,说明MAP0862蛋白适用于副结核病抗体检测。本研究建立的ELISA检测方法可有效检测临床样品中副结核病的感染。 展开更多
关键词 副结核病 map0862蛋白 ELISA 副结核分枝杆菌
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副结核分枝杆菌MAP0862蛋白的重组表达及抗原性分析 被引量：1
7
作者 李丹丹 张体银 +2 位作者 王绥家 晁哲 高慎阳 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第5期79-81,共3页
为了验证MAP0862蛋白在副结核分枝杆菌感染鉴别诊断中的作用,试验以从发病山羊消化道病料中提取的副结核分枝杆菌基因组DNA为模板,克隆MAP0862基因并构建重组表达载体pET28a-MAP0862,然后对其进行诱导表达及Western-blot分析。结果表明... 为了验证MAP0862蛋白在副结核分枝杆菌感染鉴别诊断中的作用,试验以从发病山羊消化道病料中提取的副结核分枝杆菌基因组DNA为模板,克隆MAP0862基因并构建重组表达载体pET28a-MAP0862,然后对其进行诱导表达及Western-blot分析。结果表明:检测到的羊副结核分枝杆菌MAP0862基因与GenBank中K10菌株基因完全相同;重组表达载体pET28a-MAP0862经IPTG诱导表达出约40 ku的目标蛋白,与预期结果相符;Western-blot对比分析显示, MAP0862蛋白只与羊副结核阳性血清发生显色反应。说明MAP0862蛋白具有良好的免疫反应原性和特异性。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 map0862基因 克隆表达 免疫反应原性 特异性
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利用重组表位蛋白map0862-2154c检测牛副结核血清抗体胶体金免疫层析方法的建立（英文） 被引量：5
8
作者 赵越 白云 +4 位作者 刘立元 乔臻 赵月兰 包永占 秦建华 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期133-141,共9页
筛选牛副结核分枝杆菌的2个主要抗原map0862、map2154c中抗原指数高的抗原表位基因，将多表位基因序列合成，与原核表达栽体pET28a（＋）连接，构建重组质粒pET28a—map0862—2154c。重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中诱... 筛选牛副结核分枝杆菌的2个主要抗原map0862、map2154c中抗原指数高的抗原表位基因，将多表位基因序列合成，与原核表达栽体pET28a（＋）连接，构建重组质粒pET28a—map0862—2154c。重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中诱导表达，以表达的重组表位蛋白为抗原建立检测牛副结核分枝杆菌抗体的胶体金免疫层析方法（GIcA，map0862—2154c-GICA），同时对河北省部分牛场采集的242份副结核病奶牛血样进行血清抗体检测。结果表明，牛副结核分枝杆菌表位蛋白map0862—2154c成功表达，表达产、物能与牛副结核分枝杆菌阳性血清反应。临床血清样本检测结果表明，其敏感性、特异性和符合率分别为91．86％（79／86），94．23％（147／156）和93．38％（226／242），该方法可用于牛副结核病的血清抗体检测。 展开更多
关键词 牛副结核 牛副结核分支杆菌 重组表位基因map0862—2154c 胶体金免疫层析法(GICA) 血清抗体
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