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玉米大斑病菌m^(6)A甲基转移酶基因的克隆及功能分析
1
作者 朱蒙芳 刘志航 +4 位作者 李依纯 薛启鑫 巩校东 谷守芹 刘玉卫 《河北农业大学学报》 北大核心 2025年第3期22-29,共8页
本研究针对前期筛选到的玉米大斑病菌中m^(6)A甲基转移酶METTL4的同源基因StMETTL4,对其结构及功能进行了初步解析。以野生型菌株01-23的cDNA为模版克隆该基因,并运用生物信息学方法预测其结构特征及病菌不同发育时期的表达特征;利用qRT... 本研究针对前期筛选到的玉米大斑病菌中m^(6)A甲基转移酶METTL4的同源基因StMETTL4,对其结构及功能进行了初步解析。以野生型菌株01-23的cDNA为模版克隆该基因,并运用生物信息学方法预测其结构特征及病菌不同发育时期的表达特征;利用qRT-PCR技术检测其在病菌侵染玉米不同时期的表达量变化;构建StMETTL4的融合表达载体pET28a-StMETTL4,并在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG诱导目标蛋白的表达,采用SDS-PAGE技术验证其表达情况;通过Ni柱亲和层析技术纯化StMETTL4蛋白,并测定其是否具有m^(6)A甲基转移酶催化活性。结果表明,StMETTL4的CDS序列由1518个核苷酸组成,编码1个包含506个氨基酸、具有典型MT-A70结构域的蛋白质;对StMETTL4的表达模式分析发现,该基因在病菌的芽管与侵入钉发育时期表达量显著上升,且侵染玉米过程中表达量显著提高,其中24 h后表达量达到最高,由此推测其可能在病菌侵染结构发育及致病过程中发挥重要作用;SDS-PAGE结果显示该蛋白大小为72.85 kD;成功获得其纯化蛋白,且该蛋白具有m^(6)A甲基转移酶活性。该研究不仅明确了StMETTL4基因的结构特征及在病菌生长发育及侵染寄主过程中的表达模式,也证实了StMETTL4蛋白具有m^(6)A甲基转移酶催化活性,为深入揭示其功能奠定了基础。 展开更多
关键词 玉米大斑病菌 m^(6)A甲基转移酶 StMETTL4 原核表达 QRT-PCR
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猫传染性腹膜炎病毒SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用 被引量：3
2
作者 李星颖 谢梓民 +11 位作者 原耀贤 孙铭澮 江文康 赵明明 何诗 何静 赖健仪 白银山 陈胜锋 陈志胜 马骏 王丙云 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第3期44-49,共6页
为了提高猫传染性腹膜炎(FIP)的临床检出率,本试验根据猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)M基因设计特异性引物,将扩增的目的基因连接到p MD19-T载体上,获得重组质粒并作为标准阳性模板,建立针对FIPV的SYBR Green实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法... 为了提高猫传染性腹膜炎(FIP)的临床检出率,本试验根据猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)M基因设计特异性引物,将扩增的目的基因连接到p MD19-T载体上,获得重组质粒并作为标准阳性模板,建立针对FIPV的SYBR Green实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法,并对其特异性、敏感性、重复性和临床检出率进行验证。结果显示,本方法梯度稀释的标准品与Ct值呈良好的线性关系,R^(2)=0.999 9,扩增效率为92.4%;与其他猫常见病毒未发生交叉反应;最低检测限为3.48×10^(2) copies/μL,敏感性是普通PCR检测方法的100倍;该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于2.4%;应用该方法对临床阳性样本的检出率为100%,阴性样本检出率为0。结果表明,本试验建立的SYBR Green q PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、临床检测效果佳,可用于FIPV的临床诊断。 展开更多
关键词 猫传染性腹膜炎病毒 M基因 SYBR Green 实时荧光定量PCR(qPCR)
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牛呼吸道合胞体病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
3
作者 梁晓珊 宁鹏 +6 位作者 李小龙 鲍显伟 李昊 石亚楠 王雪妍 郭雪莲 许立华 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第3期94-98,共5页
为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏... 为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明:本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。 展开更多
关键词 牛呼吸道合胞体病毒 实时荧光定量PCR M基因 诊断
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利用PCR-RFLP方法快速鉴别中国牛蒡属药用植物
4
作者 黄彦昌 宋跃岳 +6 位作者 许亮 郑汉 董玉玮 张娜 胡传银 窦德强 康廷国 《中华中医药学刊》 CAS 北大核心 2024年第12期80-83,I0021,共5页
目的随着近十几年来国内学者对牛蒡属药用植物研究的深入,中国牛蒡属植物鉴定需要一种快速、准确的分子鉴别手段。因此研究拟通过利用聚合酶链式反应-限制性酶切长度多态性(polymerase chain reaction restriction frag-ment length pol... 目的随着近十几年来国内学者对牛蒡属药用植物研究的深入,中国牛蒡属植物鉴定需要一种快速、准确的分子鉴别手段。因此研究拟通过利用聚合酶链式反应-限制性酶切长度多态性(polymerase chain reaction restriction frag-ment length polymorphism,PCR-RFLP)建立一种快速鉴定中国牛蒡属药用植物的方法。方法通过对两种中国牛蒡属药用植物牛蒡与毛头牛蒡常用鉴定DNA条形码进行限制性核酸内切酶图谱分析,找到牛蒡在内源转录间隔区1(internal transcribed spacer-1,ITS1)片段中有一个单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism,SNP)位点,正好为BsaAⅠ酶(YAC/GTR)的酶切位点,根据该酶切位点,设计引物对目标片段进行扩增。另外建立PCR体系:95℃预变性5min,循环反应40次(90℃20s,60℃20s,72℃20s),72℃延伸5min,4℃保温。建立限制性内切酶BsaAⅠ酶切体系,制作琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果电泳结果表明在经过BsaAⅠ酶切后牛蒡将会产生长度分别为101bp与125bp的短条带,而毛头牛蒡未被切开仍为226bp的长条带,成功将两种药用植物区分开。该方法简单、快速、准确,满足日常对中国牛蒡属植物的鉴定。结论该实验通过从牛蒡与毛头牛蒡的ITS1序列入手,利用PCR-RFLP技术首次完成了对两种植物的鉴别研究,建立了中国牛蒡属植物的PCR-RFLP鉴别方法。 展开更多
关键词 牛蒡 毛头牛蒡 鉴别 PCR-RFLP
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猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4
5
作者 李艳 卞志标 +1 位作者 翟少伦 李春玲 《广东畜牧兽医科技》 2024年第2期30-36,共7页
为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan... 为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan探针的PEDV荧光定量PCR方法,并与常规TaqMan探针法进行了比对。结果显示,所建立的PEDV的LNA-Taq-Man探针荧光定量PCR方法最低检测限为3.2拷贝/微升,较常规TaqMan探针法提高了10倍;与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等多种病原不存在交叉反应,特异性良好;批内和批间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。应用该方法对103份临床样品进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品47份,阳性率45.63%,与常规TaqMan探针法检测结果的阳性符合率为90.38%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针的荧光定量PCR方法为PEDV的精准检测和流行病学调查提供了一种新的技术选择。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 M基因 LNA-TaqMan探针荧光定量PCR
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101例乙肝患者HBV DNA前C区 nt 1896位点基因突变的研究 被引量：1
6
作者 陈素玲 王明保 皇甫建红 《长治医学院学报》 2000年第4期245-247,共3页
用错配聚合酶链反应（Ｍ－ＰＣＲ）及限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析方法对１０１例乙肝病毒感染者 ＨＢＶ ＤＮＡ前 Ｃ区 ｎｔ １８９６（Ｇ→Ａ）点突变进行检测。结果共检出 １８９６（Ｇ→Ａ）点突变株感染者２９例，检出率... 用错配聚合酶链反应（Ｍ－ＰＣＲ）及限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析方法对１０１例乙肝病毒感染者 ＨＢＶ ＤＮＡ前 Ｃ区 ｎｔ １８９６（Ｇ→Ａ）点突变进行检测。结果共检出 １８９６（Ｇ→Ａ）点突变株感染者２９例，检出率２６．１３％。其在慢性肝炎患者及肝硬化患者中的检出率明显高于急性肝炎患者中，（Ｐ＜０．０５），在肝硬化及慢性重症肝炎患者中的检出率又高于在慢性肝炎患者中（Ｐ＜０．０１）。同时对慢性肝炎患者中检出突变的病例和未检出突变的病例进行了 ＡＬＴＡＳＴ以及ＴＢＩＬ的比较，结果差别有显著性（ Ｐ＜０．０５）。以上结果说明，ＨＢＶ前 Ｃ区 ｎｔ １８９６位（Ｇ→Ａ）变异株感染可能是导致部分病人病情加重的原因之一，与肝脏病变的活动有关。 展开更多
关键词 乙肝病毒 基因突变 HBVDNA m-pcr 乙型肝炎
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国内部分地区多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究 被引量：22
7
作者 王林柏 孙久鹤 +5 位作者 郭东春 曹培丽 刘家森 刘春国 刘大飞 曲连东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期116-119,共4页
为了解国内部分地区不同动物多杀性巴氏杆菌(P.multicida)流行情况,本研究以36株P.multicida为研究对象,通过多重荚膜PCR、多位点序列分型(MLST)和脂多糖多重PCR(LPS-m PCR)对其荚膜型和基因型进行鉴定。采用多重荚膜PCR方法将36株细菌... 为了解国内部分地区不同动物多杀性巴氏杆菌(P.multicida)流行情况,本研究以36株P.multicida为研究对象,通过多重荚膜PCR、多位点序列分型(MLST)和脂多糖多重PCR(LPS-m PCR)对其荚膜型和基因型进行鉴定。采用多重荚膜PCR方法将36株细菌的荚膜血清型分为A、B和D 3种,其中禽源P.multicida主要以A为主;以LPS-m PCR方法将P.multicida分为L1、L2、L3和L6 4种LPS基因型,禽源P.multicida主要为L1型;通过MLST技术将P.multicida分为ST-129、ST-8、ST-58、ST-5、ST-13、ST-50和ST-122 7种ST型,禽源P.multicida主要为ST-129型。本研究为P.multicida的流行病学监测和基因多样性提供了技术支撑。 展开更多
关键词 多杀性巴氏杆菌 多位点序列分型 脂多糖多重PCR LPS基因型
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Mitf-M在羊驼皮肤组织的表达与序列分析及免疫组织化学定位 被引量：7
8
作者 朱芷葳 贺俊平 +2 位作者 于秀菊 程志学 董常生 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期794-800,共7页
【目的】克隆羊驼皮肤组织表达的Mitf-M CDS序列,比较分析羊驼皮肤组织Mitf-M的特征,进一步定位分析Mitf-M蛋白表达的位置,为深入研究羊驼毛色基因表达机制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增方法分段扩增Mitf-M CDS区,分别利用Clustal X... 【目的】克隆羊驼皮肤组织表达的Mitf-M CDS序列,比较分析羊驼皮肤组织Mitf-M的特征,进一步定位分析Mitf-M蛋白表达的位置,为深入研究羊驼毛色基因表达机制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增方法分段扩增Mitf-M CDS区,分别利用Clustal X和BioEdit生物学软件对氨基酸序列进行多重序列比较分析,免疫组织化学技术对Mitf-M蛋白定位分析。【结果】羊驼皮肤组织表达的Mitf-M的CDS区由419个氨基酸组成,具有bHLH-zip转录家族的保守结构域,该基因与牛和犬亲缘关系最近,Mitf-M蛋白主要分布于羊驼皮肤组织毛球基底层细胞之间与毛乳头周围的黑色素细胞中。【结论】与其它物种相比较,羊驼皮肤组织表达的Mitf-M蛋白保守性很强,在进化过程中的变异不大,可见Mitf-M为毛发的色素沉积提供重要的物质基础。 展开更多
关键词 羊驼 皮肤 毛囊 Mitf-M PCR 免疫组织化学
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马铃薯种苗复合感染病毒多重RT-PCR同步快速检测 被引量：24
9
作者 王中康 夏玉先 +2 位作者 袁青 谭万忠 殷幼平 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期109-115,共7页
基于马铃薯病毒ssRNA的快速制备方法,根据马铃薯病毒CP基因序列设计PVX、PVS、PVY和PLRV特异性引物对、P1基因序列设计PVA特异性引物对,建立了多重RT-PCR快速检测体系,可以同步检出复合侵染马铃薯种苗主要病毒,灵敏度比传统的ELISA至少... 基于马铃薯病毒ssRNA的快速制备方法,根据马铃薯病毒CP基因序列设计PVX、PVS、PVY和PLRV特异性引物对、P1基因序列设计PVA特异性引物对,建立了多重RT-PCR快速检测体系,可以同步检出复合侵染马铃薯种苗主要病毒,灵敏度比传统的ELISA至少高100倍.结合生物活性稳定剂研制的固相化检测试剂盒,已用于四川和重庆等省区的15个县市田间与苗圃248个马铃薯显症或无症样品的实际检测,表明四川和重庆地区2～3种马铃薯病毒往往复合侵染(PVX、PVA和PVS三种病毒复合侵染或PLRV和PVY二种病毒复合侵染). 展开更多
关键词 多重RT-PCR 检测 马铃薯种苗 ssRNA
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奇异变形杆菌耐药性的4年监测及碳青霉烯类耐药株的耐药机制研究 被引量：7
10
作者 胡丽庆 史煜波 +1 位作者 孙定河 翁幸鐾 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2012年第7期611-614,共4页
目的了解本地区2007年到2010年奇异变形杆菌的临床分布与常用抗菌药物的耐药情况,了解碳青霉烯类耐药菌株可能存在的机制。方法回顾分析2007年到2010年临床分离奇异变形杆菌的资料及整体耐药情况;对保存的耐亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM... 目的了解本地区2007年到2010年奇异变形杆菌的临床分布与常用抗菌药物的耐药情况,了解碳青霉烯类耐药菌株可能存在的机制。方法回顾分析2007年到2010年临床分离奇异变形杆菌的资料及整体耐药情况;对保存的耐亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)或厄他培南(ETP)的菌株进行复苏,并做Hodge试验进行产碳青霉烯酶的确认,同时对试验菌株进行耐药基因的PCR扩增检测。结果 2007年到2010年,奇异变形杆菌在临床各送检样本中以痰液分离率最高:51.1%、34.4%、22.1%和35.4%,其次为尿液:14.3%、28.0%、34.9%和33.6%;耐药监测分析显示,4年间对喹诺酮类、青霉素类、头孢菌素类及氨基糖苷类耐药率相对较高且较为稳定;对碳青霉烯类耐药最低但增加明显,亚胺培南从2007年的1.8%升到2010年的16.1%,美罗培南从2007年的1.7%升到2010年的16.8%。15株耐碳青霉烯类菌株中,Hodge试验阳性7株,blaKPC基因阳性11株,blaCTX-M基因阳性13株。结论本地区奇异变形杆菌对临床常用的抗菌药物均有较高的耐药性,对碳青霉烯类药物的耐药率最低,但增加明显。位于质粒上的blaKPC基因所产生的碳青霉烯酶和blaCTX-M基因所产生的超广谱β-内酰胺酶是本菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因,临床应引起高度重视。 展开更多
关键词 奇异变形杆菌 blaKPC blaCTX-M PCR
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牛乳源金黄色葡萄球菌耐药性变迁及β内酰胺类药物耐药基因分析 被引量：7
11
作者 凡琴 刘书亮 +4 位作者 吴聪明 韩新锋 周康 刘冬香 侯小刚 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第3期147-151,共5页
采用肉汤微量稀释法,对203 株源于2006—2011年四川牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sa)进行10 种常用抗生素药敏性检测,多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,M-PCR)法对其耐甲氧西林基因(mecA)和β-... 采用肉汤微量稀释法,对203 株源于2006—2011年四川牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sa)进行10 种常用抗生素药敏性检测,多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,M-PCR)法对其耐甲氧西林基因(mecA)和β-内酰胺类药物耐药基因(blaZ)进行分析,了解Sa耐药性变迁。结果表明:牛乳源Sa菌株对青霉素、氨苄西林耐药率一直居高不下;对阿莫西林/克拉维酸、红霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐药率有增强趋势;对林可霉素、四环素耐药率呈降低趋势;对环丙沙星耐药率不定;对苯唑西林和头孢噻呋敏感;Sa分离株多重耐药率介于72.1%～100.0%,显示出不尽相同的耐药谱,却呈现出不断增宽的趋势。M-PCR检测显示,2006—2011年分离Sa菌株未从基因水平扩增出mecA基因;不同年度分离株均不同程度携带blaZ基因,不同年度分离株blaZ+检出率介于49.1%～87.5%。药敏实验结果与相关耐药基因检测结果存在对应关系,部分菌株的耐药性与耐药基因的检出率不一致,推测还存在其他耐药机制。结论:四川地区牛乳源金黄色葡萄球菌耐药性不容乐观。 展开更多
关键词 生牛乳 金黄色葡萄球菌 耐药性 多重聚合酶链式反应 β内酰胺类耐药基因
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多重RT-PCR检测PRRSV和CSFV及PRRSV ORF5基因遗传变异分析 被引量：4
12
作者 张金强 吴家强 +7 位作者 孟斌 郭文龙 王希辉 李坤 于江 刘少宁 张玉玉 王金宝 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期633-637,共5页
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）的基因组序列设计了2对特异性引物,建立了同时检测PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法。2008年1月至2009年12月期间,采集山东各地71个不同规模猪场及农村散养户212份病料,采用建立的多... 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）的基因组序列设计了2对特异性引物,建立了同时检测PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法。2008年1月至2009年12月期间,采集山东各地71个不同规模猪场及农村散养户212份病料,采用建立的多重RT-PCR技术同时检测PRRSV和CSFV的感染状况。检测结果显示,病料中高致病性PRRSV占57.1%（121/212）,CSFV占29.2%（62/212）。应用RT-PCR方法扩增山东不同地区16株PRRSV的ORF5基因,并进行了序列分析。结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性为97.0%~100.0%;与参考变异毒株JXA1、传统毒株VR2332核苷酸同源性分别为98.0%~99.5%和86.4%~87.7%。推导的氨基酸序列分析表明,16株毒株GP5蛋白氨基酸不存在缺失,但存在位点突变。12株在非中和表位29位点与准种进化34位点发生了突变,分别由V→A和N→S;1株在非中和表位185位点发生突变,由A→V;这与2007年流行的PRRSV毒株JXA1、HUN等不同。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 多重PCR ORF5基因
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多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用 被引量：11
13
作者 孔繁德 王荣 +2 位作者 陈琼 吴德峰 徐淑菲 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期112-116,共5页
猪瘟病毒和蓝耳病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。根据猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病(PRRS)的基因保守序列设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重RT-PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表... 猪瘟病毒和蓝耳病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。根据猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病(PRRS)的基因保守序列设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重RT-PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明能同时扩增得到2条与试验设计相符的167bp(CSFV)和320bp(PRRS)特异性条带,同时具有较好的特异性;敏感性检测结果表明,临床阳性的样品提取的核酸稀释1000倍后仍能检测出CSFV和PRRSV。本方法的建立对于这2种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 蓝耳病 多重PCR
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分枝杆菌在北京水源环境中的分布：M.arupense国内首次报告 被引量：8
14
作者 蔡林 陈雪 +1 位作者 赵亭 张建中 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期13-16,共4页
目的:研究北京水源中分枝杆菌的分布,应用表型鉴定方法和分子生物学方法进行分枝杆菌鉴定,并比较两种方法的准确性和优缺点。方法:采集水源环境标本,进行分枝杆菌分离培养,通过生化反应对所有分离株进行鉴定,同时从培养菌落中提取分枝杆... 目的:研究北京水源中分枝杆菌的分布,应用表型鉴定方法和分子生物学方法进行分枝杆菌鉴定,并比较两种方法的准确性和优缺点。方法:采集水源环境标本,进行分枝杆菌分离培养,通过生化反应对所有分离株进行鉴定,同时从培养菌落中提取分枝杆菌DNA,用PCR扩增65ku热休克蛋白基因,扩增产物分别应用两种限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析和PCR产物的测序分析。结果:从30份养鱼水中分离出35株分枝杆菌。①表型鉴定结果:RunyonⅠ群1株,可疑为海分枝杆菌;RunyonⅡ群7株,确定为戈登分枝杆菌或疑似戈登分枝杆菌;RunyonⅢ群9株,未鉴定到种;RunyonⅣ群18株,其中龟-偶发分枝杆菌复合群9株,其余9株未鉴定到种。②PCR-RFLP鉴定结果:戈登分枝杆菌8株,龟-偶发分枝杆菌复合群8株(包括M.peregrinum1株),疑似日内瓦分枝杆菌10株,其余9株未鉴定到种。③PCR产物测序鉴定:戈登分枝杆菌10株,M.arupense9株,偶发分枝杆菌7株,土分枝杆菌6株,不产色分枝杆菌1株,M.peregrinum1株,脓肿分枝杆菌1株。结论:非结核分枝杆菌(NTM)广泛存在于养鱼水中,分枝杆菌采用65ku热休克蛋白基因PCR扩增配合测序鉴定较传统表型鉴定和PCR-RFLP更准确。 展开更多
关键词 分枝杆菌 非结核 表型鉴定 M.arupense 限制性片段长度多态性 序列分析
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耐多药肺结核耐药基因突变与临床疗效探讨 被引量：11
15
作者 林明贵 李洪敏 +6 位作者 吴雪琼 金关甫 王巍 王安生 张韬 丹子军 李燕峰 《中国防痨杂志》 CAS 2005年第4期229-232,共4页
目的了解耐多药肺结核耐药基因的突变与临床疗效的关系,为耐多药肺结核的治疗提供参考依据.方法 108例病人痰标本用PCR-SSCP方法检测了五种耐药基因和传统的药敏试验,并与临床疗效进行比较分析.结果耐多药肺结核耐药基因检测率分别是耐... 目的了解耐多药肺结核耐药基因的突变与临床疗效的关系,为耐多药肺结核的治疗提供参考依据.方法 108例病人痰标本用PCR-SSCP方法检测了五种耐药基因和传统的药敏试验,并与临床疗效进行比较分析.结果耐多药肺结核耐药基因检测率分别是耐异烟肼的katG基因突变率为70.4%,耐利福平的rpoB基因突变率72.2%,耐链霉素的rpsL基因突变率71.9%,耐吡嗪酰胺的pncA基因突变率53.4%,耐乙胺丁醇的embB基因突变率31.7%,其中高浓度耐药菌的基因突变率远高于低浓度的突变率.根据药敏试验及耐药基因检测结果指导治疗,应用以KAOP为基础的化疗方案,配合患者过去未曾用过的1～2种抗结核药物,经过平均1.4年的治疗,108例耐多药病人74.1%的病人痰菌阴转,且67.5%的病人痰结核杆菌培养阴转,83.3%的病人病灶吸收好转,65.3%的空洞闭合,取得了临床上较为满意的疗效.结论对耐多药肺结核进行耐药基因检测是一项重要工作,对指导治疗及预后判断有一定的参考价值.但尚需进行更多的观察. 展开更多
关键词 耐多药 肺结核 耐药性 基因突变 分枝杆菌 聚合酶链反应-单链构象多态性
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马铃薯病毒一步法多重RT-PCR检测技术的构建 被引量：31
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作者 董代幸 张祥林 +4 位作者 罗明 韩剑 冯世强 唐德贤 岳仲海 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期131-137,共7页
根据马铃薯病毒PVX、PVY、PVA、PLRV的CP基因序列设计4对特异性引物,通过对试剂浓度和反应条件进行优化,建立了能够同步检测PVX、PVY、PVA、PLRV的一步法多重RT-PCR检测方法。该方法对PVX、PVY、PVA、PLRV扩增出的靶带大小分别为732、42... 根据马铃薯病毒PVX、PVY、PVA、PLRV的CP基因序列设计4对特异性引物,通过对试剂浓度和反应条件进行优化,建立了能够同步检测PVX、PVY、PVA、PLRV的一步法多重RT-PCR检测方法。该方法对PVX、PVY、PVA、PLRV扩增出的靶带大小分别为732、422、132和336 bp,凝胶电泳易辨别区分。病毒RNA最低检测限度为7.8 pg/μL,对PVM、PVS、AMV、TMV及PSTVd的扩增为阴性。研究结果表明,该方法特异、灵敏,比两步法多重RT-PCR检测更加快速、简便,提高了检测效率,降低检测成本,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。 展开更多
关键词 一步法 多重RT-PCR 病毒检测 马铃薯
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低温肉制品中3种食源性致病菌多重聚合酶链式反应快速检测方法的建立 被引量：12
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作者 李新福 王周平 +3 位作者 李聪 方伶俐 赵颖 徐宝才 《肉类研究》 北大核心 2017年第2期45-50,共6页
针对低温肉制品中较易污染的沙门氏菌(Salmonella spp.)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有害微生物,利用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,m-PCR)的方法,对3... 针对低温肉制品中较易污染的沙门氏菌(Salmonella spp.)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有害微生物,利用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,m-PCR)的方法,对3种菌同时快速检测,从而达到节省时间,提高效率的目的。使用沙门氏菌的inv A基因、金黄色葡萄球菌的Prf A基因和单增李斯特菌nuc基因设计3对特异性引物,在确定特异性引物的基础上,将3种菌进行培养增菌后接种于低温肉制品中,过夜富集后收集并进行灵敏度检测,优化多重PCR反应体系并应用于实际样品的检测。结果表明:多重PCR方法在同时检测这3种有害微生物时,m-PCR最佳反应条件如下:25 μL反应体系、10×PCR缓冲液2.5 μL、2.5 mmol/L d NTPs 2.0 μL、2.5 U/μL的DNA聚合酶0.5 μL及上、下游引物各0.5 μL、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的模板1.0 μL、沙门氏菌的模板2.0 μL,加dd H_2O补足至25 μL,最佳退火温度为64℃。多重PCR快速检测方法适用于低温肉制品中沙门氏菌等3种食源性致病菌的检测,具有快速、灵敏、特异、简便等特点。 展开更多
关键词 低温肉制品 多重PCR 快速检测 食源性致病菌
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食品中3种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用 被引量：12
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作者 钱志伟 孙新城 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第16期236-239,共4页
目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nu... 目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和单增李斯特菌的prs基因,运用Primer Premier 5.0分别设计3对片段大小不同的特异性引物;通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。结果:建立的多重PCR方法灵敏度测试结果分别为7.6、3.8、5.1pg/μL,在此灵敏度下可以扩增出全部特异性引物条带,验证性实验结果出现相应的目的条带且未发生交叉影响。结论:初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。 展开更多
关键词 食源性致病菌 多重聚合酶链式反应(PCR) 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单核细胞增生性李斯特菌 食品检测
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郑州地区大肠埃希菌中CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的基因型分布 被引量：4
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作者 张志坚 郭小兵 +1 位作者 阎志勇 张钦宪 《中华医院感染学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第18期2382-2384,共3页
目的了解郑州地区CTX-M型ESBLs在大肠埃希菌中的基因型分布。方法收集郑州大学第一、三附属医院2006-2007年临床分离产ESBLs不重复大肠埃希菌138株,小量提取菌株质粒,依据CTX-M型ESBLs基因同源性分析结果,设计4对简并引物,采用各对引物... 目的了解郑州地区CTX-M型ESBLs在大肠埃希菌中的基因型分布。方法收集郑州大学第一、三附属医院2006-2007年临床分离产ESBLs不重复大肠埃希菌138株,小量提取菌株质粒,依据CTX-M型ESBLs基因同源性分析结果,设计4对简并引物,采用各对引物对所提质粒进行PCR扩增,阳性扩增产物纯化后直接测序,测序结果与blaCTX-M比对后明确流行型别。结果138株产ESBLs大肠埃希菌中共检出CTX-M型ESBLs80株,具有单一CTX-M型别者53株,同时具有两种CTX-M型别者25株,3种CTX-M型别者2株;CTX-M型ESBLs中,CTX-M-1(43株)、CTX-M-14(56株)、CTX-M-25(7株)及CTX-M-38(5株)。结论郑州地区大肠埃希菌CTX-M型ESBLs以CTX-M14型为主,且同一菌株可有多种CTX-M酶型。 展开更多
关键词 CTX-M 超广谱Β-内酰胺酶 PCR基因型
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正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系 被引量：25
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作者 唐辉 陈宗游 +3 位作者 史艳财 柴胜丰 王满莲 孔德鑫 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期610-615,共6页
目的建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系。方法利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度)进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程... 目的建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系。方法利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度)进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测。结果大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响最大;地枫皮ISSR-PCR最佳反应体系(20μL)为:Mg2+1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;最佳退火温度和循环次数分别为51.8℃和40次;从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析。 展开更多
关键词 地枫皮 ISSR—PCR 正交设计 最佳退火温度 最佳循环次数 遗传差异
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