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酿酒酵母adh2和ald6双基因缺失突变株的构建 被引量：6
1
作者 王艳尊 雷娟娟 +6 位作者 江贤章 高媛媛 李欣 蓝灿华 陈由强 陈如凯 黄建忠 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期211-216,共6页
酿酒酵母乙醇合成代谢过程中,阻断或削弱乙醛至乙酸代谢流不但能增强乙醇合成流,同时还能降低发酵乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-Δadh2为出发菌株,应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(a... 酿酒酵母乙醇合成代谢过程中,阻断或削弱乙醛至乙酸代谢流不但能增强乙醇合成流,同时还能降低发酵乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-Δadh2为出发菌株,应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(ald6)基因敲除组件,转化酿酒酵母YS2-Δadh2敲除ald6基因,之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中,半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kanr基因筛选标记,最后,传代丢失质粒pSH65获得单倍体ald6基因缺失突变株。利用同样的敲除组件和技术再次敲除其等位基因,最终获得双基因缺失突变株YS2-△adh2-Δald6。发酵实验表明与出发菌株YS2相比,突变株乙酸合成量降低18%,乙醇最高产量提高12.5%。 展开更多
关键词 酿酒酵母 ald6 adh2 lfh-pcr 基因敲除
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家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的探索
2
作者 张小华 王跃嗣 牛新华 《滨州医学院学报》 2009年第2期81-83,共3页
目的构建铜-锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因缺失的酿酒酵母菌株,为进一步以酵母为模型开展家族性肌萎缩硬化症发病机制及防治研究奠定基础。方法运用LFH-PCR构建了带有遗传霉素抗性基因(KanMX4)的SOD1基因中断框,转化酿酒酵母BY5677,以添加... 目的构建铜-锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因缺失的酿酒酵母菌株,为进一步以酵母为模型开展家族性肌萎缩硬化症发病机制及防治研究奠定基础。方法运用LFH-PCR构建了带有遗传霉素抗性基因(KanMX4)的SOD1基因中断框,转化酿酒酵母BY5677,以添加G418的平板筛选出SOD1基因缺失菌株,并经PCR鉴定。结果PCR扩增证实SOD1基因已被成功敲除;与野生菌株相比,SOD1基因缺失菌株生长缓慢。结论成功构建了SOD1基因缺失的酿酒酵母菌株。 展开更多
关键词 家族性肌萎缩硬化症 酿酒酵母 SOD1 lfh-pcr
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基于PCR方法敲除黄酒酵母精氨酸酶基因的工程菌构建 被引量：6
3
作者 赵然然 陆健 谢广发 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2012年第17期159-162,共4页
用一种高效快速的免克隆方法-长侧翼同源PCR(LFH-PCR),构建基因敲除组件,然后通过化学转化方法把敲除组件转入黄酒酵母细胞中,利用同源重组机制精确敲除精氨酸酶基因(CAR1),构建了黄酒酵母工程菌株。结果表明,敲除CAR1基因的工程菌与出... 用一种高效快速的免克隆方法-长侧翼同源PCR(LFH-PCR),构建基因敲除组件,然后通过化学转化方法把敲除组件转入黄酒酵母细胞中,利用同源重组机制精确敲除精氨酸酶基因(CAR1),构建了黄酒酵母工程菌株。结果表明,敲除CAR1基因的工程菌与出发菌株相比,酒液中尿素的含量降低了72%,氨基甲酸乙酯含量降低了38%,并且该菌株的遗传稳定性好,发酵性能与出发菌株基本一致。 展开更多
关键词 氨基甲酸乙酯 黄酒 酵母 精氨酸酶基因 长侧翼同源PCR
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长臂同源多聚酶链反应法构建变形链球菌comD基因同源重组DNA片段 被引量：3
4
作者 陈娇 周智 +1 位作者 尹一兵 张雪梅 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2010年第1期48-51,共4页
目的构建变形链球菌UAl59密度感应相关的comD基因同源重组DNA片段,为利用同源重组原理构建基因功能丧失菌株做准备。方法通过NCBI基因数据库获取变形链球菌的DNA序列,利用聚合酶链反应技术分别扩增变形链球菌UA159comD基因上、下游片段... 目的构建变形链球菌UAl59密度感应相关的comD基因同源重组DNA片段,为利用同源重组原理构建基因功能丧失菌株做准备。方法通过NCBI基因数据库获取变形链球菌的DNA序列,利用聚合酶链反应技术分别扩增变形链球菌UA159comD基因上、下游片段及抗红霉素基因片段,再通过长臂同源多聚酶链反应将这3个片段连接起来,形成同源重组DNA片段。结果经过PCR反应和琼脂电泳分析,得到了一个碱基数为3个单片段总和的连接片段,测序结果显示连接片段为预期的comD同源重组片段。结论成功构建了变形链球菌UA159comD基因同源重组DNA片段,可直接用于细菌转化构建comD基因缺陷菌株。 展开更多
关键词 变形链球菌 coreD基因 长臂同源多聚酶链反应 同源重组 转化
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替代失活法构建变形链球菌LuxS基因缺陷株 被引量：1
5
作者 李月恒 陈惠珍 +4 位作者 周智 陈娇 李锐 尹一兵 张雪梅 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2011年第3期201-203,共3页
目的 LuxS基因是变形链球菌生物膜早期形成过程中的关键基因,构建该基因的缺陷菌。方法采用长臂同源多聚酶链反应(LFH-PCR)方法构建含红霉素耐药基因片段的LuxS基因上、下游同源序列的连接片段,转化到变形链球菌中,在红霉素的平板上筛... 目的 LuxS基因是变形链球菌生物膜早期形成过程中的关键基因,构建该基因的缺陷菌。方法采用长臂同源多聚酶链反应(LFH-PCR)方法构建含红霉素耐药基因片段的LuxS基因上、下游同源序列的连接片段,转化到变形链球菌中,在红霉素的平板上筛选缺陷菌株,并采用PCR鉴定。结果对变形链球菌LuxS基因缺陷菌株进行PCR和DNA序列测定分析证实构建成功。结论成功构建出变形链球菌LuxS基因的缺陷菌株,为后期针对变形链球菌LuxS基因的相关研究奠定基础。 展开更多
关键词 变形链球菌 基因缺陷 PCR鉴定 失活 多聚酶链反应 同源序列 DNA序列 S基因
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肺炎链球菌ply基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究
6
作者 李忱炜 袁军 +7 位作者 王虹 贺潇 董杰 崔瑾 姜慧 张雪梅 胥文春 何於娟 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期993-997,共5页
目的 构建肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,Sp）溶血素基因（pneumolysin,ply）缺陷菌株,并对其毒力作初步研究,为进一步探索宿主对溶血素的防御应答奠定基础.方法 采用长臂同源多聚酶链反应（LFH-PCR）技术将ply基因替换为红霉... 目的 构建肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,Sp）溶血素基因（pneumolysin,ply）缺陷菌株,并对其毒力作初步研究,为进一步探索宿主对溶血素的防御应答奠定基础.方法 采用长臂同源多聚酶链反应（LFH-PCR）技术将ply基因替换为红霉素耐药基因（erm）后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出ply缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株,观察体外缺陷菌株生长情况,并在小鼠体内感染模型研究其毒力侵袭变化.结果 PCR结果显示ply基因完全被erm基因所替代,构建ply缺陷菌成功 单个菌落培养基生长情况表明ply基因缺陷并未对细菌的体外生长造成影响 但在小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株入血时间（6 h）明显晚于野生菌株（2 h）,且各时间点的菌量均显著低于野生菌株,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01） 小鼠腹膜感染模型显示野生菌株半数致死时间为3 d,而缺陷菌株半数致死时间为18d,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代ply基因,方法简便快捷 ply的缺陷不影响细菌在体外的生长,但可显著降低细菌在宿主体内的毒力和侵袭. 展开更多
关键词 肺炎链球菌 溶血素 长臂同源多聚酶链反应 毒力
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