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单增李斯特菌inlF基因缺失株的构建及生物学特性研究
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作者 邓秋艳 吕悦 +6 位作者 谢嘉辉 秦赫 王静 马勋 王鹏雁 蒋建军 任静静 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第11期1113-1121,共9页
为探究inlF基因的缺失对单增李斯特菌(LM)部分生物学特性的影响,本研究通过同源重组技术构建LM90SB2的inlF基因缺失株(LM90SB2ΔinlF),并进行基因回补获得其回补株(CLM90SB2ΔinlF),将缺失株传代,每隔5代采用PCR鉴定各菌株及缺失菌株的... 为探究inlF基因的缺失对单增李斯特菌(LM)部分生物学特性的影响,本研究通过同源重组技术构建LM90SB2的inlF基因缺失株(LM90SB2ΔinlF),并进行基因回补获得其回补株(CLM90SB2ΔinlF),将缺失株传代,每隔5代采用PCR鉴定各菌株及缺失菌株的遗传稳定性;绘制亲本株、缺失株和回补株的生长曲线;将各菌株加入1%的绵羊红细胞悬液中,测定溶血活性;将各菌株分别以1×10^(9)cfu/mL~1×10^(5)cfu/mL的浓度经腹腔注射小鼠,观察并记录各组小鼠的临床状况,统计死亡率,计算各菌株对小鼠的半数致死量(LD_(50))。各组小鼠均经腹腔注射1×10^(6)cfu/mL的3株菌各0.2 mL,分别在感染24 h、48 h和72 h后无菌取各组小鼠的脑、肝脏和脾脏称重、研磨成匀浆通过平板计数法,检测各脏器的载菌量,分析inlF基因对LM致病性的影响;将各菌株均以MOI 100体外感染小鼠脑微血管内皮细胞(MBMEC)和小鼠星形胶质细胞(C8D1A),测定各菌株对两种细胞的黏附性和侵袭力;采用RT-qPCR检测各菌株感染MBMEC和C8D1A后紧密连接蛋白mRNA的相对转录水平的变化,分析inlF基因对细胞紧密连接蛋白转录水平的影响。PCR和测序结果显示,inlF基因缺失株和回补株均正确构建,且缺失株有较好的遗传稳定性。生长曲线和溶血活性结果显示,inlF基因缺失后不影响细菌的生长能力和溶血活性;小鼠致病性试验结果显示,接种剂量为1×10^(9)cfu/mL~1×10^(7)cfu/mL亲本株、缺失株和回补株的小鼠在感染后均出现精神萎靡、被毛凌乱、食欲减退等临床症状,死亡率分别为88.89%、83.33%和88.89%,接种剂量为1×10^(6)cfu/m L~1×10^(5)cfu/m L 3株菌的小鼠在感染后部分小鼠出现神经症状,死亡率较低,3株菌对小鼠的LD_(50)分别约为1×10^(6.17)cfu、1×10^(6.83)cfu和1×10^(6.50)cfu;脏器载菌量测定结果显示,在感染24 h、48 h和72 h后,缺失株在小鼠脑组织中的载菌量极显著低于亲本株(P<0.01),感染48 h和72 h后,缺失株在小鼠脑组织中的载菌量显著低于回补株(P<0.05),感染24 h后,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量均显著低于亲本株(P<0.05),感染48 h和72 h后,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量与亲本株和回补株均无显著差异(P>0.05)。黏附性和侵袭力试验结果显示,缺失株对MBMEC和C8D1A的黏附性显著低于亲本株(P<0.05),侵袭力与亲本株和回补株均无显著差异(P>0.05);RT-qPCR结果显示,亲本株和缺失株感染MBMEC后Occludin、Claudin-5和ZO-1的转录水平较对照组显著下降(P<0.05),各菌株感染C8D1A后的ZO-1转录水平较对照组极显著下降(P<0.01)。上述结果表明inl F基因对LM的生长能力和溶血活性均无影响,但其一定程度降低LM的毒力和致病性。本研究首次揭示了inl F基因在LM对宿主血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白的调控中发挥显著作用,为进一步探究inl F基因介导LM在宿主脑组织定植中的作用研究奠定基础。 展开更多
关键词 单增李斯特菌 内化素F 基因缺失株 紧密连接蛋白
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