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eIF4A在帽依赖和IRES介导的翻译起始中的作用
1
作者 郭可盈 周杰 《生命科学》 CSCD 2024年第3期291-301,共11页
生物体内翻译起始机制分为两类:帽依赖性翻译起始和内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)介导的翻译起始。真核生物的翻译起始为经典的帽依赖性翻译起始模型,而大多数正链RNA病毒选择依赖于IRES的翻译机制。真核翻... 生物体内翻译起始机制分为两类:帽依赖性翻译起始和内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)介导的翻译起始。真核生物的翻译起始为经典的帽依赖性翻译起始模型,而大多数正链RNA病毒选择依赖于IRES的翻译机制。真核翻译起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4A,eIF4A)是DEAD-box RNA解旋酶家族的成员,具有依赖于RNA的ATP酶活性和RNA解旋酶活性,而e IF4A具体的解旋机制至今仍不清晰。同时,eIF4A与其他翻译因子有着复杂而紧密的联系,在帽依赖性与IRES介导的翻译起始过程中扮演着至关重要的角色。本文主要对eIF4A的功能、结构以及eIF4A在帽依赖性与IRES介导的翻译起始过程中的机制作一综述。 展开更多
关键词 eIF4A ires依赖性翻译 帽结构依赖性翻译 翻译起始
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病毒IRES的结构及IRES介导的蛋白质翻译研究进展 被引量：3
2
作者 傅美贤 龙健儿 《生命科学》 CSCD 北大核心 2021年第4期407-418,共12页
核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)常见于许多正链RNA病毒基因组以及部分细胞基因。在营养缺乏、内质网应激、缺氧和病毒感染等不利条件下,细胞翻译也能够从经典的帽子依赖型翻译转换为依赖于IRES的翻译机制。事实上,... 核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)常见于许多正链RNA病毒基因组以及部分细胞基因。在营养缺乏、内质网应激、缺氧和病毒感染等不利条件下,细胞翻译也能够从经典的帽子依赖型翻译转换为依赖于IRES的翻译机制。事实上,自IRES被发现以来,其相关的翻译机制调控被认为是病毒感染的关键步骤,对病毒毒力、组织靶向性和致病性具有重要作用。因此,研究IRES的结构及其功能有助于揭示病毒致病的机制,对发展有效的病毒预防或控制策略具有重要意义。该文主要对RNA病毒中目前发现的IRES结构、类型及其相关的反式调控因子和作用机制作一综述。 展开更多
关键词 ires依赖型蛋白翻译 ires结构 ires反式调控因子
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Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定 被引量：19
3
作者 何飞 谭颖徽 杨峥嵘 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1197-1200,共4页
目的　构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体。方法　利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1 IRES EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP +... 目的　构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体。方法　利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1 IRES EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP +E86和PA3 17,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;“乒乓球”法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT PCR法分别检测细胞荧光和Delta1mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能。结果　酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1 IRES EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9 7×10 5CFU ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化。结论　逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达。 展开更多
关键词 Delta GFP ires 逆转录病毒 基因转移 基因表达
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RNA病毒翻译调控元件——内部核糖体进入位点(IRES) 被引量：16
4
作者 卢杰 张珈敏 +2 位作者 林美娟 曹旭 胡远扬 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期513-518,共6页
真核生物大多数蛋白质合成采用了依赖帽子结构的翻译起始方式.但一组缺乏帽子结构的RNA病毒的蛋白质合成起始是依赖其5′端非翻译区(untranslated region,UTR)翻译调控的顺式作用元件———内部核糖体进入位点(internal ribosome entry ... 真核生物大多数蛋白质合成采用了依赖帽子结构的翻译起始方式.但一组缺乏帽子结构的RNA病毒的蛋白质合成起始是依赖其5′端非翻译区(untranslated region,UTR)翻译调控的顺式作用元件———内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES).它们能够在一些反式作用因子的辅助下,招募核糖体小亚基到病毒mRNA的翻译起始位点.目前,依赖IRES元件翻译起始的RNA病毒在哺乳动物,无脊椎动物及植物中均有发现.因此,对RNA病毒IRES元件的深入研究,不仅有助于阐明相关疾病的发生机理,而且为工业应用和疾病治疗提供借鉴意义.本文对RNA病毒IRES元件发现、分类、结构与功能等作了综述. 展开更多
关键词 RNA病毒 内部核糖体进入位点(ires) 翻译起始
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IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用 被引量：4
5
作者 梁雪松 连建奇 +2 位作者 周永兴 聂青和 郝春秋 《世界华人消化杂志》 CAS 2003年第2期157-160,共4页
目的:研究核糖体内部进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitorRNA,IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV)IRES介导蛋白翻译的抑制作用.方法:体外应用脂质体细胞转染法,将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA... 目的:研究核糖体内部进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitorRNA,IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV)IRES介导蛋白翻译的抑制作用.方法:体外应用脂质体细胞转染法,将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA转染人肝癌细胞株(HHCC),经G418筛选4wk后建立IRNA及mIRNA表达株;以相同的方法构建pcHCVcluc转染株;以脂质体介导细胞转染法将pCMVNCRLuc转染IRNA及mIRNA细胞株,于转染后48h检测荧光素酶表达量;将IRNA及mIRNA真核表达体转染pcHCVcLuc表达株,于转染后不同时间检测荧光素酶表达量.结果:HCVIRES介导蛋白翻译在IRNA表达株明显受到抑制,同样IRNA对HCV翻译复制子的蛋白翻译作用有明显抑制性;突变体mIRNA表达株和空载体对照株中未见相似的抑制性.结论:pcHCVcluc在HHCC细胞中获得有效表达;IRES特异性IRNA能有效的抑制HCVIRES介导细胞内蛋白翻译作用. 展开更多
关键词 ires 特异性IRNA HCV ires 启动蛋白翻译 细胞内 抑制作用
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HCVIRES特异性抑制性RNA二级结构模拟及自剪切转录载体构建 被引量：3
6
作者 梁雪松 周永兴 +2 位作者 连建奇 郝春秋 王临旭 《医学研究生学报》 CAS 2002年第3期189-192,共4页
目的 :构建可保证HCVIRES特异性抑制性RNA(IRNA)序列完整性的转录载体。　方法 :应用计算机软件模拟IRNA二级结构 ;体外化学合成IRNA及其互补体的cDNA ,以AatⅡ和XbaⅠ双酶切后克隆入具自剪切作用的顺式核酶载体pGEMRz中 ;应用酶切方法... 目的 :构建可保证HCVIRES特异性抑制性RNA(IRNA)序列完整性的转录载体。　方法 :应用计算机软件模拟IRNA二级结构 ;体外化学合成IRNA及其互补体的cDNA ,以AatⅡ和XbaⅠ双酶切后克隆入具自剪切作用的顺式核酶载体pGEMRz中 ;应用酶切方法、PCR和测序法对重组载体进行三重鉴定 ;最后对重组体进行体外转录。　结果 :计算机模拟发现HCVIRES特异性IRNA二级结构包括两个环、一个茎状结构和一个膨出 ,在其序列两端加3～ 5个碱基不会改变其二级结构 ,而缺失 3～ 5个碱基却会明显改变其结构。经三重鉴定证实 ,目的序列被正确地克隆入质粒pGEMRz,并经体外转录得到约 70个碱基大小的IRNA。　结论 :本研究构建转录载体pGRz IRNA可保证IRNA序列的完整性。 展开更多
关键词 HCV ires 抑制性RNA 体外转录
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猪传染性胃肠炎病毒S与M基因融合表达载体及IRES连接双基因共表达载体的构建 被引量：3
7
作者 贺小英 彭树英 +1 位作者 杨瑞锋 张涌 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2006年第6期34-37,共4页
目的:研究如何提高猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)中主要抗原基因S与M基因对猪传染性胃肠炎的免疫调节作用,进一步探究基因疫苗的有效开发途径。方法:通过两种方法应用牛β酪蛋白启动子构建S和M融合基因表达载体以及构建IRES连接M和S双基因... 目的:研究如何提高猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)中主要抗原基因S与M基因对猪传染性胃肠炎的免疫调节作用,进一步探究基因疫苗的有效开发途径。方法:通过两种方法应用牛β酪蛋白启动子构建S和M融合基因表达载体以及构建IRES连接M和S双基因共表达核酸疫苗载体。结论:成功构建好M和S融合基因表达载体及IRES连接的M和S双基因真核共表达载体,并为利用乳腺生物反应器生产可食性疫苗提供有效措施。 展开更多
关键词 核酸疫苗 ires 融合基因 共表达载体
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IRES序列连接的D-氨基酸氧化酶与绿色荧光蛋白基因导入K562e细胞的表达 被引量：2
8
作者 翟勇平 王健民 +2 位作者 张雨生 周虹 吕书晴 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2002年第3期209-211,共3页
内部核糖体进入位点 (IRES)序列来源于脑心肌炎病毒 ,它可翻译一条mRNA上的两个开放读框 ,由其连接的两个基因的表达率相同。本实验应用以IRES序列连接D 氨基酸氧化酶 (DAAO)和绿色荧光 (GFP)基因构建的逆转录病毒载体 ,转染K5 6 2e细... 内部核糖体进入位点 (IRES)序列来源于脑心肌炎病毒 ,它可翻译一条mRNA上的两个开放读框 ,由其连接的两个基因的表达率相同。本实验应用以IRES序列连接D 氨基酸氧化酶 (DAAO)和绿色荧光 (GFP)基因构建的逆转录病毒载体 ,转染K5 6 2e细胞获得稳定表达GFP的单克隆细胞KDfGC和KDfGd,测定转基因细胞的荧光阳性率以及荧光强度 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO+细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。结果表明 ,KDfGC和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .6 4 % ,96 .31% ;2× 10 4细胞的荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。GFP荧光强度与H2 O2 的产量间呈指数相关。结论 :IRES序列调控的双基因可同时表达 ,GFP的荧光强度可以间接地反映DAAO基因的表达水平 ,为了解目的基因表达水平高低提供了新的方法。 展开更多
关键词 ires序列 D-氨基酸氧化酶基因 绿色荧光蛋白基因 K562e细胞系 白血病 病理学 基因转移
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基于FMDV IRES的双顺反子载体的构建及体外表达分析 被引量：1
9
作者 郑海学 郭慧琛 +2 位作者 靳野 刘湘涛 谢庆阁 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期29-33,共5页
利用RT-PCR扩增出口蹄疫病毒小核糖体进入位点(IRES)序列,并定向克隆进pcDNA3.1(+)载体,构建成双顺反子真核表达载体。为了验证该载体是否能够转录出双顺反子mRNA,在IRES起始密码(ATG)下游正确插入增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp),把重... 利用RT-PCR扩增出口蹄疫病毒小核糖体进入位点(IRES)序列,并定向克隆进pcDNA3.1(+)载体,构建成双顺反子真核表达载体。为了验证该载体是否能够转录出双顺反子mRNA,在IRES起始密码(ATG)下游正确插入增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp),把重组质粒转染BHK-21细胞,培养20～48h,在紫外显微镜下观察,能够看到典型的绿色荧光,表明载体能够体能够利用FMDV的IRES能够介导非帽依赖性表达外源基因。并通过流式细胞仪,与同样是CMV启动转录egfp的pGFPN1质粒在细胞中的表达水平进行了比较。该载体的成功构建为体外表达双基因、双顺反子逆转录载体构建以及相关应用奠定基础,并有作为基因疫苗和标记定位基因治疗载体的潜力。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 ires 双顺反子 双顺反子载体
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靶向口蹄疫病毒IRES区RNA干扰位点的选择及shRNA表达载体的构建与鉴定 被引量：1
10
作者 崔丽瑾 王兴龙 +4 位作者 任林柱 李晓艳 郎需龙 张付贤 王英超 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第3期1-5,共5页
以口蹄疫病毒WFL株为试验株,对口蹄疫病毒的IRES序列进行了保守性分析和RNA二级结构预测,推测高度保守的FMDV复制原点区域位于容易被siRNA结合的IRESRNA二级结构的环区,因此,在该区选择确定了2个siRNA干扰靶位,设计并合成能表达其小发... 以口蹄疫病毒WFL株为试验株,对口蹄疫病毒的IRES序列进行了保守性分析和RNA二级结构预测,推测高度保守的FMDV复制原点区域位于容易被siRNA结合的IRESRNA二级结构的环区,因此,在该区选择确定了2个siRNA干扰靶位,设计并合成能表达其小发夹结构shRNA的表达模板,克隆到含有U6启动子的真核表达载体中,建立了靶向口蹄疫病毒IRES区的siRNA真核表达系统,为进一步研究针对该区的RNA干扰对口蹄疫病毒的抑制作用打下了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 ires序列 SIRNA 干扰靶位
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人白细胞介素12双亚基共表达pVAX1-IRES-hIL12载体的构建与表达 被引量：2
11
作者 王伟 高江平 +5 位作者 阎瑾琦 肖毅 任杰 王宇 江乐 于继云 《军医进修学院学报》 CAS 2010年第6期600-603,共4页
目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检... 目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。 展开更多
关键词 白细胞介素12 基因融合 真核细胞 ires
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HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶基因在肝细胞中的表达 被引量：1
12
作者 刘水平 谭德明 +2 位作者 侯周华 刘双虎 文质 《湖南医科大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第4期335-337,共3页
目的 :构建HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶 (SEAP)基因表达的细胞模型。方法 :用PCR技术扩增HCV 5′NCR片段 ,定向克隆至表达质粒 pSEAP2 Control的SEAP基因上游 ,构建HCV 5′NCR调控SEAP表达的重组质粒 pdNCRSEAP。用脂质体基因转染技... 目的 :构建HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶 (SEAP)基因表达的细胞模型。方法 :用PCR技术扩增HCV 5′NCR片段 ,定向克隆至表达质粒 pSEAP2 Control的SEAP基因上游 ,构建HCV 5′NCR调控SEAP表达的重组质粒 pdNCRSEAP。用脂质体基因转染技术 ,将pdNCRSEAP转染至肝细胞株QSG770 1。用化学发光法检测SEAP的表达 ,并观察不同浓度反义寡聚核苷酸 (ASODN)对SEAP表达的影响。结果 :重组质粒 pdNCRSEAP表达的发光强度为pSEAP2 Control的 76 %,5 μmol和 10 μmolASODN对pdNCRSEAP发光强度的抑制率分别为2 9.2 %和 44 .6 %,而对 pSEAP2 Control的SEAP表达无显著抑制作用 (P >0 .0 5 )结论 :重组质粒 pdNCRSEAP的SEAP表达受HCV 5′NCR调控 ,为以HCV 5′NCR为靶位点的药物评价建立了检测方便的细胞模型。 展开更多
关键词 HCV ires 调控 外分泌性碱性磷酸酶基因 肝细胞 表达
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IRES特异性抑制性RNA对HCV IRES介导的蛋白翻译的体外抑制作用 被引量：1
13
作者 梁雪松 周永兴 +1 位作者 连建奇 聂青和 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 2002年第2期136-138,共3页
目的　研究IRES特异性抑制性RNA(IRNA)对HCVIRES介导蛋白翻译的体外抑制作用。方法　体外化学合成IRNA及其互补体RNA(cIRNA)的cDNA ,以AatⅡ和XbaⅠ双酶切后克隆入具有自剪切作用的顺式核酶载体pGEMRz中 ;最后对重组体的体外转录体在体... 目的　研究IRES特异性抑制性RNA(IRNA)对HCVIRES介导蛋白翻译的体外抑制作用。方法　体外化学合成IRNA及其互补体RNA(cIRNA)的cDNA ,以AatⅡ和XbaⅠ双酶切后克隆入具有自剪切作用的顺式核酶载体pGEMRz中 ;最后对重组体的体外转录体在体外无细胞反应体系中的抑制活性进行了初步探讨。结果　IRNA和cIRNA在体外无细胞翻译体系中对HCVIRES介导的蛋白翻译具有相似的抑制活性 ,最大抑制率达 90 %左右。结论　IRNA及cIRNA在体外对HCVIRES介导的蛋白翻译均具有抑制活性。 展开更多
关键词 体外抑制作用 HCV ires 抑制性RNA 体外蛋白翻译
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靶向IRES序列的siRNA对口蹄疫病毒体外增殖抑制效果
14
作者 崔丽瑾 王兴龙 +5 位作者 任晓慧 任林柱 郎需龙 杨艳玲 李晓艳 卜朝阳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期629-633,共5页
为探讨靶向核糖体进入位点(IRES)区域的siRNA在真核细胞中对FMDV复制的抑制作用,对FMDV WFL株的IRES序列进行了保守性分析和二级结构预测,选择了靶向IRES保守的功能核心区的病毒复制原点附近的2个干扰靶位,设计并构建了shRNA真核表达质... 为探讨靶向核糖体进入位点(IRES)区域的siRNA在真核细胞中对FMDV复制的抑制作用,对FMDV WFL株的IRES序列进行了保守性分析和二级结构预测,选择了靶向IRES保守的功能核心区的病毒复制原点附近的2个干扰靶位,设计并构建了shRNA真核表达质粒,转染到IBRS-2细胞后感染FMDV,通过双抗夹心ELISA和real-timeRT-PCR检测FMDV复制情况,结果表明,针对IRES区域的RNAi能够在一定程度上抑制FMDV的复制。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 RNA干扰 ires序列 IBRS-2细胞 抑制
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IRES特异性IRNA在丙型肝炎抗病毒治疗中作用
15
作者 梁雪松 连建奇 周永兴 《世界华人消化杂志》 CAS 2003年第2期242-245,共4页
丙型肝炎基因治疗是目前研究的热点,HCVIRES是丙肝病毒核酸复制和蛋白翻译的关键结构.目前针对IRES结构的治疗策略主要包括反义核酸、核酶、抑制性RNA等.现就抑制性RNA在HCV感染基因治疗中作用研究进展作简要综述.
关键词 ires 特异性IRNA 丙型肝炎 抗病毒治疗 治疗
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HCV IRES特异性抑制性RNA结构模拟及在体外对病毒翻译启动的抑制作用
16
作者 梁雪松 周永兴 +2 位作者 连建奇 郝春秋 王临旭 《传染病信息》 2002年第4期146-146,共1页
目的计算机模拟IRNA二级结构,研究HCV IRES特异性抑制性RNA对HCV IRES介导蛋白翻译的体外抑制作用。方法应用计算机软件模拟IRNA二级结构;体外化学合成IRNA及其互补体的cDNA,以Aat Ⅱ和Xba Ⅰ双酶切后克隆入具有自剪切作用的顺式核酸载... 目的计算机模拟IRNA二级结构,研究HCV IRES特异性抑制性RNA对HCV IRES介导蛋白翻译的体外抑制作用。方法应用计算机软件模拟IRNA二级结构;体外化学合成IRNA及其互补体的cDNA,以Aat Ⅱ和Xba Ⅰ双酶切后克隆入具有自剪切作用的顺式核酸载体pGEMRz中;应用酶切方法、PCR方法和测序法对重组载体进行三重鉴定。最后应用含HCV IRES的双顺反子构建体pT7DC1-341和单顺反子构建体pCMVNCR1uc对重组体的体外转录体RNA及其互补体IRNA(cIRNA)在体外无细胞反应体系中的抑制活性进行了初步研究。结果计算机模拟发现HCV IRES特异性IRNA二级结构包括2个环、1个茎和1个大的膨出,cIRNA具有相似的结构;在IRNA一级序列两端加3～5个碱基不会改变其二级结构,而缺失3～5个碱基却会明显改变其结构。IRNA和cIRNA在体外无细胞翻译体系中对HCV IRES介导蛋白翻译具有相似的抑制活性。结论本研究构建转录载体pGRz-IRNA可保证IR-NA结构正确性,IRNA及cIRNA在体外对HCV IRES介导蛋白翻译具有相似的抑制活性。 展开更多
关键词 ires 抑制性RNA 体外转录 基因治疗
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IRES/polyA-promoter介导的Ang-1与VEGF165双基因表达效率的对比分析 被引量：2
17
作者 陈瑶 缪竞诚 +6 位作者 韩亚丽 盛伟华 包婉蓉 田丽娜 张凤娟 吕海涛 杨吉成 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期10-19,共10页
目的：构建IRES及polyA-promoter介导人血管生成素-1（Angiogenin-1,Ang-1）和人血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor165,VEGF165）双基因共表达的腺病毒载体,比较IRES与polyA-promoter不同表达模式及其对位于二... 目的：构建IRES及polyA-promoter介导人血管生成素-1（Angiogenin-1,Ang-1）和人血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor165,VEGF165）双基因共表达的腺病毒载体,比较IRES与polyA-promoter不同表达模式及其对位于二者前后基因的表达效率和诱导兔角膜新生血管的形成功能,为今后构建双基因或多基因高效共表达载体提供实验依据。方法：以pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165质粒为模板,PCR扩增人VEGF165及Ang-1基因片段,分别将其亚克隆至改建的pAdTrack-CMV-PolyA-promoter及pAdTrack-CMV-IRES转移质粒中,构建pTrack-CMV-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165、pTrack-CMV-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1、pTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1基因重组转移质粒,再与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中同源重组,然后经PacI线性化后转染QBI-293A人胚肾成纤维细胞（简称293A细胞）,收获腺病毒重组病毒子Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165及Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165在QBI-293A细胞中的转录,ELISA法分别检测不同腺病毒载体目的基因的表达量,比较分析Ang-1与VEGF165基因在IRES和polyA-promoter介导的不同腺病毒表达载体中的表达能力,及在同一腺病毒表达载体中前后不同位置的表达效率。并进一步于兔角膜缘注射Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165,Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,Ad-Ang-1-IRES-VEGF165,检测角膜新生血管的面积,并比较其诱导血管形成能力的差异。结果：测序显示Ang-1和VEGF165序列正确,不同重组腺病毒载体均获得成功包装,病毒效价可达2~5×1010pfu/m l,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165均能有效转录,ELISA法检测结果表明Ang-1、VEGF165基因不仅均能在细胞中有效表达,而且IRES介导的Ang-1及VEGF165基因,无论在IRES上游或下游,其表达量均低于polyA-promoter相同位置的Ang-1及VEGF165基因表达量,大约降低60%~70%左右,同时Ang-1/VEGF165在同一载体上、下游不同位置,其下游基因的表达量均明显低于上游基因表达量,大约降低30%~40%左右。角膜血管形成动物实验的结果表明Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1及Ad-VEGF165-IRES-Ang-1诱导角膜新生血管形成面积和血管密度的能力相对较强,且前者比后者效果更为显著。结论：在腺病毒表达载体中,由IRES/polyA-promoter介导的Ang-1与VEGF165双基因均能在细胞中成功表达,并具血管诱导性,但polyA-promoter比IRES介导的双基因表达效率高,诱导血管形成能力强;同时两者下游基因的表达量及血管诱导性能均明显低于上游基因。 展开更多
关键词 血管生成素-1 血管内皮生长因子 ires PolyA-promoter 构建
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基于IRES序列的多基因共表达载体构建 被引量：3
18
作者 田聪慧 谢雪梅 +3 位作者 李英 尹晓东 韩军 李军 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期97-104,共8页
目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,... 目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和HeLa两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白质免疫印迹实验表明,DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组,并且两种蛋白质表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白质相互作用及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。 展开更多
关键词 ires 载体构建 基因共表达
原文传递
脑心肌炎病毒IRES置换不影响口蹄疫病毒的复制和毒力 被引量：1
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作者 高荣远 杨德成 +3 位作者 孙超 周国辉 王海伟 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期834-837,共4页
内部核糖体进入位点(IRES)是微RNA病毒起始蛋白合成的关键元件。为研究IRES元件在病毒致病过程中的作用,本研究以口蹄疫病毒(FMDV)为模型,在已建立的O型FMDV c DNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法以脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES替换F... 内部核糖体进入位点(IRES)是微RNA病毒起始蛋白合成的关键元件。为研究IRES元件在病毒致病过程中的作用,本研究以口蹄疫病毒(FMDV)为模型,在已建立的O型FMDV c DNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法以脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES替换FMDV的IRES,构建并拯救出含有EMCV IRES的嵌合病毒(r FMDV-EIRES)。一步生长曲线结果显示r FMDV-EIRES无论是在鼠源BHK-21细胞还是在猪源IBRS-2细胞中的复制能力均与亲本病毒相近。另外,r FMDV-EIRES对乳鼠的致病力与亲本病毒也相同。以上研究结果表明,虽然EMCV IRES与FMDV IRES一级序列存在显著差异,但二者的置换并不影响FMDV的复制和毒力,该结果有助于加深IRES在微RNA病毒复制和致病性功能的认识。 展开更多
关键词 内部核糖体进入位点 蛋白翻译起始 口蹄疫病毒 ires嵌合 病毒拯救
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IRES连接双基因在溶瘤腺病毒中的抗肝癌作用 被引量：3
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作者 刘金 刘必胜 刘新垣 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2007年第4期466-470,493,共6页
单基因治疗癌症可能杀伤力还嫌不够,故使用两个基因在癌症治疗中具有重要价值。利用IRES将双基因连接起来在溶瘤腺病毒中表达,构成ZD55-IL-24-IRES-TRAIL。研究发现,该病毒在多种肝癌细胞中能有效地介导外源双基因表达,并在很大程度上... 单基因治疗癌症可能杀伤力还嫌不够,故使用两个基因在癌症治疗中具有重要价值。利用IRES将双基因连接起来在溶瘤腺病毒中表达,构成ZD55-IL-24-IRES-TRAIL。研究发现,该病毒在多种肝癌细胞中能有效地介导外源双基因表达,并在很大程度上杀死肿瘤细胞,而对正常细胞WI38无明显杀伤力。并且,该病毒可以有效地抑制体内肿瘤生长,有的肿瘤甚至完全消失。 展开更多
关键词 双顺反子溶瘤腺病毒 内部核糖体进入住点(ires) 基因治疗
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