基于二聚体核衣壳蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体iELISA检测方法建立 被引量：1

1

作者 赵啸 乔松林 +3 位作者 孙亚宁 钱祁昇 李睿 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2024年第11期135-146,共12页

为制备稳定性好、免疫反应性佳的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N),设计表达二聚体N蛋白(N-dimer),并基于该蛋白质建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体间接酶联免疫吸附试验... 为制备稳定性好、免疫反应性佳的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N),设计表达二聚体N蛋白(N-dimer),并基于该蛋白质建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体间接酶联免疫吸附试验(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)检测方法。首先选取当前PRRSV国内优势毒株NADC30-like N蛋白基因序列,通过(GGGGS)3linker将N蛋白基因序列串联,经密码子优化合成后构建N-dimer重组表达载体。利用原核表达系统进行诱导表达,并通过镍离子螯合亲和层析法进行纯化。Western-blot分析其与PRRSV阳性和阴性血清的反应性;冻融法比较N-dimer与单体N蛋白(N-monomer)的沉淀析出情况;ELISA法比较N-dimer与N-monomer的免疫反应性。以N-dimer作为包被抗原建立PRRSV抗体iELISA检测方法,对该方法的反应条件进行优化,验证其特异性、敏感性、重复性,并应用于临床血清样品检测。结果表明,在16℃、0.2 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷条件下诱导16 h,N-dimer获得大量可溶性表达。Western-blot结果表明,N-dimer能够与PRRSV阳性血清发生特异性反应;相较于N-monomer,N-dimer能够稳定保存,并且免疫反应性更佳。成功建立了基于N-dimer的PRRSV抗体iELISA检测方法,且该方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性;与商业试剂盒结果进行比较,其阳性符合率为96.88%,总符合率为96.86%,符合率高。综上,成功制备了稳定性好、免疫反应性佳的N-dimer,并基于N-dimer建立了PRRSV抗体iELISA检测方法。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 核衣壳蛋白 二聚体 间接ELISA 临床检测

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布鲁氏菌病血清学Brucellacapt和iELISA检测方法的比较 被引量：12

2

作者 赵娜 赵赤鸿 +4 位作者 荣蓉 肖培 孙岩 王娜 崔步云 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1045-1047,1051,共4页

目的探索Brucellacapt方法对于我国布鲁氏菌病的诊断价值。方法对来门诊就诊的120例就诊者,使用RBPT和SAT方法结合临床表现等诊断布鲁氏菌病病人75例,非布鲁氏菌病病人45例。对全部120份就诊者血清进行Brucellacapt和iELISA检测并比较... 目的探索Brucellacapt方法对于我国布鲁氏菌病的诊断价值。方法对来门诊就诊的120例就诊者,使用RBPT和SAT方法结合临床表现等诊断布鲁氏菌病病人75例,非布鲁氏菌病病人45例。对全部120份就诊者血清进行Brucellacapt和iELISA检测并比较分析其在诊断中的意义。结果 Brucellacapt检测方法的灵敏度、特异度、符合率、Kappa值和ROC曲线下面积分别为82.7%、88.9%、85.0%、0.69、0.86,而iELISA方法的结果分别为90.7%、64.4%、80.8%、0.57、0.78。结论 Brucellacapt检测方法的特异度、符合率、Kappa值和ROC曲线下面积均高于iELISA检测方法,而iELISA检测方法的灵敏度较高。 展开更多

关键词 布鲁氏菌病 诊断 Brucellacapt ielisa

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OIE标准全乳iELISA与国标全乳环状试验在奶牛布鲁氏菌病检测中的研究 被引量：7

3

作者 赵智香 康京丽 +4 位作者 蔡一非 黄保续 于伟玲 K.Nielson 范伟兴 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第11期24-25,共2页

从不同地区采集奶样,将OIE诊断试验中用于牛布病诊断的全乳iELISA与国标中的MRT进行比对。在检测的526份样品中,全乳iELISA检出93份阳性,国内MRT抗原检出31份阳性,英国卫桥的MRT抗原检出44份阳性(检测数为264份);对其中一个地区的31份奶... 从不同地区采集奶样,将OIE诊断试验中用于牛布病诊断的全乳iELISA与国标中的MRT进行比对。在检测的526份样品中,全乳iELISA检出93份阳性,国内MRT抗原检出31份阳性,英国卫桥的MRT抗原检出44份阳性(检测数为264份);对其中一个地区的31份奶品,除了抗体的检测外,同时进行了奶样的细菌分离、奶样提取DNA的检测,全乳iELISA与乳样DNA提取均检出21份阳性,且一一对应,国内MRT抗原只检出10份阳性。结果表明全乳iELISA敏感性好,操作方便快捷,具有血清学检测所不具备的许多突出优点。 展开更多

关键词 布鲁氏菌病 全乳ielisa MRT 乳样

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牛传染性鼻气管炎病毒gG iELISA抗体检测方法的建立 被引量：4

4

作者 张芳 陈颖钰 郭爱珍 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期1504-1512,共9页

为了建立有效鉴别牛传染性鼻气管炎病毒（BoHV-1）gg-／tk-基因缺失疫苗人工免疫和BoHV-1野毒株自然感染的鉴别诊断方法，以BoHV-1gG蛋白为抗原建立了间接ELISA（iELISA）抗体检测方法。根据编码BoHV1gG蛋白的基因序列设计特异性扩增引... 为了建立有效鉴别牛传染性鼻气管炎病毒（BoHV-1）gg-／tk-基因缺失疫苗人工免疫和BoHV-1野毒株自然感染的鉴别诊断方法，以BoHV-1gG蛋白为抗原建立了间接ELISA（iELISA）抗体检测方法。根据编码BoHV1gG蛋白的基因序列设计特异性扩增引物，以BoHV1基因组DNA为模板扩增gg基因截短片段，克隆至原核表达载体pGEX-6p-1并进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot分析表明，gg基因在大肠杆菌BL21（DE3）中呈可溶性及包涵体2种形式表达，纯化的gG蛋白具有良好的反应原性。将可溶性gG蛋白纯化后作为包被抗原，建立了BoHV-1gGiELISA抗体检测方法，并优化了各反应条件。使用该方法与商业化试剂盒BoHV-1gE和gB阻断ELIsA进行比较检测，并与其他5种牛常见病原体的阳性血清进行交叉反应检测，同时进行了该方法的重复性试验、保存期试验及消长规律试验；最后使用该方法对临床1031份牛血清进行了检测，血清流行率为83．71%,4（95%CI：81．30％～85．90％）。结果显示，该方法的阴、阳性血清检测的临界值（S／P值）为0．398，与进口试剂盒比较显示该方法具有良好的诊断敏感性和特异性，且本试剂盒可在1：50倍样本稀释下进行检测，而商业化试剂盒是1：1倍样本稀释检测。此外，该方法分析特异性良好，与其他非相关病原体的阳性血清无交叉反应；检测重复性良好；在4℃条件下可保存6个月。该方法在人工感染BoHV～1野毒株和人工免疫BoHv-1gg-／tk-疫苗株20d后可以明显区分疫苗株免疫和野毒株感染。综上所述，本研究成功建立了BoHV-1 gG iELISA抗体检测方法，敏感性和特异性良好，既可以用于有效鉴别疫苗免疫和自然感染，也可作为BoHV-1的血清学诊断方法。 展开更多

关键词 牛传染性鼻气管炎 牛疱疹病毒1型 gG蛋白 ielisa 鉴别诊断

原文传递

羊布氏菌病iELISA抗体检测方法的建立及应用

5

作者 王秀丽 毛开荣 +3 位作者 程君生 张立春 丁家波 蒋玉文 《中国兽药杂志》 2013年第9期40-45,共6页

建立了以布鲁氏菌脂多糖(LPS)为抗原,用于检测羊布鲁氏菌IgG抗体的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)方法,并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性、符合率进行了评价。结果表明,iELISA比SAT和RBPT的敏感性高60～150倍;该方法特异性强... 建立了以布鲁氏菌脂多糖(LPS)为抗原,用于检测羊布鲁氏菌IgG抗体的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)方法,并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性、符合率进行了评价。结果表明,iELISA比SAT和RBPT的敏感性高60～150倍;该方法特异性强,可有效区分布鲁氏菌与大肠杆菌O157和都柏林沙门氏菌的IgG抗体,但尚无法与小肠结肠炎耶尔森菌O9的IgG抗体相区分;批间重复性试验和批内重复性试验变异系数分别为1.1%～9.8%,2.9%～9.8%,表明该方法具有良好的可重复性;保存期试验显示包被好的酶标板在4℃保存11个月,检测结果稳定。iELISA和RBPT检测385份来自不同地区的血清结果表明,阳性符合率为95.14%,阴性符合率为96.28%,对1932份临床血清样本的检测结果与RBPT比较,总符合率为91.7%,证明此方法可以应用于临床羊布鲁氏菌病的筛查。 展开更多

关键词 羊布鲁氏菌病 ielisa 脂多糖

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羊布鲁菌血清抗体iELISA方法的建立及应用 被引量：3

6

作者 张广冻 陈梦茜 +4 位作者 李俊玫 刘欢 张建民 靳亚平 王爱华 《动物医学进展》 北大核心 2017年第7期6-11,共6页

为建立一种准确、快速、安全的羊布鲁菌检测方法,构建布鲁菌bp26基因的原核表达载体,用切胶-电洗脱的方法纯化重组GST-Bp26蛋白,并以纯化的重组GST-Bp26蛋白为包被抗原,优化反应条件,建立了羊布鲁菌血清抗体的iELISA方法。结果表明,所... 为建立一种准确、快速、安全的羊布鲁菌检测方法,构建布鲁菌bp26基因的原核表达载体,用切胶-电洗脱的方法纯化重组GST-Bp26蛋白,并以纯化的重组GST-Bp26蛋白为包被抗原,优化反应条件,建立了羊布鲁菌血清抗体的iELISA方法。结果表明,所建立的iELISA方法具有较好的特异性和敏感性,与虎红平板凝集试验结果具有良好的符合性,能够满足羊布鲁菌病临床检测需要,具有较好的临床应用价值。 展开更多

关键词 布鲁菌 Bp26 原核表达 间接酶联免疫吸附试验

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施马伦贝格病毒N蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

7

作者 李阳 孙睿雪 +3 位作者 陈天杰 刘思彤 曹家慧 赵建军 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期3877-3887,共11页

[目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌... [目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的SBV N蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种iELISA方法,并对其包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育时间等反应条件进行优化,检测其阴阳性临界值、特异性、灵敏性和重复性。[结果]SDS-PAGE结果显示,SBV N蛋白分子质量为30 ku;Western blotting结果显示,纯化后SBV N蛋白与SBV阳性血清能产生特异性反应。本研究建立的SBV iELISA检测方法最佳条件为:SBV N抗原包被浓度4μg/mL、4℃包被12 h、1%明胶37℃封闭1 h、血清稀释度为1:200、37℃孵育1 h、1:6 000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h,其阴阳性临界值为0.371。该iELISA检测方法仅与SBV阳性血清产生特异性反应,与牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和阿卡斑病毒(AKAV)阳性血清均无明显交叉反应,灵敏性较高,SBV阳性血清稀释度为1:1280时仍有明显反应。批间重复试验和批内重复试验变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其总符合率为94.57%。[结论]本研究建立了一种以SBV N蛋白为检测抗原的SBV iELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于SBV血清学检测,试验结果为SBV的快速诊断提供更多选择。 展开更多

关键词 施马伦贝格病毒(SBV) N蛋白 间接ELISA(ielisa) 原核表达

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羊布鲁氏菌病四种血清学检测方法的比较

8

作者 张伟 赵正宏 赵灿奇 《四川畜牧兽医》 2025年第7期21-24,共4页

运用荧光偏振试验(FPA)、竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)及微量法补体结合试验(mCFT)分别对1 962份羊血清进行布鲁氏菌病抗体检测,以mCFT法作为判定标准,分析比较不同检测方法的敏感性、特异性、符合率。... 运用荧光偏振试验(FPA)、竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)及微量法补体结合试验(mCFT)分别对1 962份羊血清进行布鲁氏菌病抗体检测,以mCFT法作为判定标准,分析比较不同检测方法的敏感性、特异性、符合率。结果显示:FPA、cELISA、iELISA与mCFT检测结果的符合率分别为98.78%、98.01%和98.67%,FPA、cELISA、iELISA、mCFT等高通量检测方法具有较高的敏感性和特异性,适用于大规模布鲁氏菌病的专项检测。建议在同一灵敏度条件下先采用cELISA初筛,再采用iELISA、FPA或m CFT复核确诊,通过2种或2种以上方法联合诊断较为理想。 展开更多

关键词 布鲁氏菌病 羊 FPA CELISA ielisa mCFT

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羊布鲁氏菌病的血清学检测研究--以甘肃省庆城县为例 被引量：1

9

作者 刘昊 高海霞 马奔 《甘肃畜牧兽医》 2024年第2期64-67,73,共5页

为了分析比较羊布鲁氏菌病不同检测方法的阳性检出率、操作简便性、经济实惠性和用时长短,本文分别采用国标虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)以及世界动物卫生组织(OIE)推荐的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)3种检测方法对庆城县... 为了分析比较羊布鲁氏菌病不同检测方法的阳性检出率、操作简便性、经济实惠性和用时长短,本文分别采用国标虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)以及世界动物卫生组织(OIE)推荐的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)3种检测方法对庆城县6个乡(镇)的2398份羊血清进行了布鲁氏菌病血清学检测。结果表明,RBT与SAT相结合的检测方法目前最适用于基层畜牧兽医部门,随着社会经济水平的进一步发展,检测流程较简洁且检测结果更为准确的iELISA法有望逐步普及,并得到广泛应用。 展开更多

关键词 羊 布鲁氏菌病 RBT SAT ielisa

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布鲁氏菌Bp26蛋白原核表达的优化与间接ELISA检测方法的建立 被引量：1

10

作者 刘尚博 王振华 +1 位作者 秦建华 郑可 《现代畜牧科技》 2024年第10期27-31,共5页

为原核表达布鲁氏菌Bp26蛋白,利用布鲁氏菌M5-90疫苗株扩增得到Bp26基因片段,克隆构建pET28a-XXA-HRV 3C-Bp26原核表达载体,通过诱导表达和Ni-NTA亲和纯化得到XXA-HRV 3C-Bp26重组蛋白,再使用PreScission Protease酶切得到无标签的Bp26... 为原核表达布鲁氏菌Bp26蛋白,利用布鲁氏菌M5-90疫苗株扩增得到Bp26基因片段,克隆构建pET28a-XXA-HRV 3C-Bp26原核表达载体,通过诱导表达和Ni-NTA亲和纯化得到XXA-HRV 3C-Bp26重组蛋白,再使用PreScission Protease酶切得到无标签的Bp26蛋白。通过SDS-PAGE和Western Blot试验结果,证明成功表达XXA-HRV 3C-Bp26重组蛋白,且蛋白是可溶性表达,并通过酶切获得了无任何标签的Bp26蛋白。以Bp26蛋白做为诊断抗原,初步建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法,通过与商用布鲁氏菌ELISA检测试剂盒对256份羊血清样本进行检测,符合率为93.75%,证明建立的布鲁氏菌间接ELISA检测方法可以做为临床中的一种布鲁氏菌病检测方法。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 Bp26蛋白 间接ELISA

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几种布鲁氏菌病血清学诊断方法的比较研究 被引量：60

11

作者 范伟兴 钟旗 +3 位作者 何倩倪 吴冬玲 蔡一飞 赵智香 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2006年第6期31-33,共3页

疑似布病感染的牛场采集牛奶和全血进行细菌分离,采集血清用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、iELISA、cELISA进行抗体检测;采集免疫牛场和部分免疫羊场血清430份进行国内4个厂家生产的RBT抗原比对实验,并且选择特异性最高厂... 疑似布病感染的牛场采集牛奶和全血进行细菌分离,采集血清用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、iELISA、cELISA进行抗体检测;采集免疫牛场和部分免疫羊场血清430份进行国内4个厂家生产的RBT抗原比对实验,并且选择特异性最高厂家的RBT抗原与SAT、iELISA和cELISA同时进行抗体检测。结果表明4个厂家生产的RBT抗原检测结果的一致性较差,RBT和SAT与加拿大布病参考实验室提供的iELISA和cELISA试剂盒检测结果相比一致率较高,但前两者均有较高的假阳性和假阴性。通过对比试验得出:在布病检疫时可选择特异性好的RBT抗原进行初筛,阳性结果用iELISA或cELISA进行确诊。 展开更多

关键词 布鲁氏菌病 ielisa CELISA SAT RBT

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牛布鲁氏菌病间接ELISA检测方法的建立及应用 被引量：6

12

作者 吴同垒 冀梦瑶 +4 位作者 于秀剑 杜万年 张志强 吴清民 史秋梅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期366-370,共5页

为建立牛布鲁氏菌病血清学诊断方法,本研究以牛种布鲁氏菌B.abortus2308基因组为模板,PCR扩增其HSP70基因,构建重组表达质粒pET32a-HSP70,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达并纯化,SDS-PAGE结果显示,得到重组HSP70蛋白,HSP70主要以包涵体形... 为建立牛布鲁氏菌病血清学诊断方法,本研究以牛种布鲁氏菌B.abortus2308基因组为模板,PCR扩增其HSP70基因,构建重组表达质粒pET32a-HSP70,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达并纯化,SDS-PAGE结果显示,得到重组HSP70蛋白,HSP70主要以包涵体形式表达。经条件优化建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA(iELISA)方法,结果显示,iELISA最佳反应条件为:抗原HSP70包被浓度为0.2μg/孔,血清稀释度为1200,封闭液为5%脱脂奶粉,兔抗牛IgG-HRP稀释度为14000,显色10 min;该iELISA方法的临界值为0.186。特异性试验结果显示,除布鲁氏菌病阳性血清外,该iELISA与IBR、BVD和FMD阳性血清无明显交叉反应;敏感性试验结果显示,血清1400稀释时仍能有效检出布鲁氏菌;重复性试验结果显示。批内批间变异系数均小于10%,重复性好。利用本实验建立的iELISA方法与传统的虎红凝集和试管凝集试验同时对血清样品进行检测,比分析检测结果,结果显示该iELISA方法与其它两者符合率较高。利用本方法对秦皇岛未进行布鲁氏菌病免疫的规模化肉牛养殖场血清样品进行检测,布病抗体阳性率为2.5%。本研究建立的iELISA为牛布鲁氏菌病的血清学诊断提供了可行方法。 展开更多

关键词 布鲁氏菌病 ielisa HSP70

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抗克伦特罗单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：1

13

作者 李红梅 徐斐 +1 位作者 李琳 陈佳 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第S1期154-157,共4页

利用重氮化法,将小分子半抗原克伦特罗（CL）与牛血清白蛋白（BSA）偶联,制备得到CLBSA完全抗原,并用其免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合、连续克隆筛选能稳定分泌高特异性抗CL的单克隆抗体细胞株。结果显示:使用偶联率为17的克伦特罗完全... 利用重氮化法,将小分子半抗原克伦特罗（CL）与牛血清白蛋白（BSA）偶联,制备得到CLBSA完全抗原,并用其免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合、连续克隆筛选能稳定分泌高特异性抗CL的单克隆抗体细胞株。结果显示:使用偶联率为17的克伦特罗完全抗原免疫Balb/c鼠,间接ELISA法检测其中三只小鼠血清效价较高;细胞融合检测得到其融合率为85.26%,阳性率为15.23%;经四次连续克隆得到了一株特异性最佳的细胞株4H5,间接ELISA法检测其培养上清的OD_450nm达到1.265±0.060,与BSA交叉反应OD_450nm仅为0.060±0.006,腹水效价达3.2×10⁶;最后经鉴定确定该单克隆抗体亚型为IgG1,轻链为κ。 展开更多

关键词 克伦特罗 完全抗原 单克隆抗体 ielisa

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内蒙古东部地区奶牛布鲁氏菌病流行学调查及分离与鉴定

14

作者 李向阳 霍晓伟 +3 位作者 武迎红 宋丽华 白旭华 张嘉保 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期921-925,共5页

为掌握内蒙古自治区东部地区奶牛布鲁氏菌病的流行现状和流行特征,在试验中采用全乳环状试验(milk ring test,简称MRT)、奶液间接酶联免疫吸附试验(indire enzyme-linked immunosorbent assay,简称iELISA)两种方法对科尔沁地区5个牛场... 为掌握内蒙古自治区东部地区奶牛布鲁氏菌病的流行现状和流行特征,在试验中采用全乳环状试验(milk ring test,简称MRT)、奶液间接酶联免疫吸附试验(indire enzyme-linked immunosorbent assay,简称iELISA)两种方法对科尔沁地区5个牛场进行了布病流行学调查,比较两种方法对检测布鲁氏菌病阳性牛的差异性。通过对内蒙古自治区东部地区5个盟市进行牛布鲁氏菌病流行学调查;最后对检出的部分阳性奶牛乳汁进行细菌分离培养,用VirB8和AMOS方法进行扩增鉴定。表明两种方法(MRT和iELISA)检测结果差异不显著;经检测17株分离株均为布鲁氏菌。布鲁氏菌分子分型扩增的鉴定显示,牛场感染的菌株为牛种布鲁氏菌。内蒙古东部地区部分饲养场布鲁氏菌病阳性率为1.67%。 展开更多

关键词 内蒙古东部 牛乳 布鲁氏菌 MRT ielisa 分离鉴定

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FPA与ELISA方法在我国部分地区牛布鲁菌病诊断应用中的比较研究 被引量：6

15

作者 任燕斌 张慧 +3 位作者 孙翔翔 李泽钦 蔡家利 范伟兴 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期806-809,共4页

目的评价荧光偏振试验(FPA)在我国部分地区临床牛血清样品检测中的应用。方法荧光偏振试验(FPA)检测1 286份牛血清样本,其中布病感染阳性血清309份,阴性血清977份,ROC曲线分析FPA临界值;荧光偏振试验(FPA)、间接ELISA(IELISA)及竞争ELIS... 目的评价荧光偏振试验(FPA)在我国部分地区临床牛血清样品检测中的应用。方法荧光偏振试验(FPA)检测1 286份牛血清样本,其中布病感染阳性血清309份,阴性血清977份,ROC曲线分析FPA临界值;荧光偏振试验(FPA)、间接ELISA(IELISA)及竞争ELISA(CELISA)同时检测1 160份牛血清样本,其中布病感染阳性血清231份,阴性血清929份,Kappa分析检测方法一致性。结果 ROC曲线分析FPA最优临界值(cutoff)为95mP,此时敏感性为100%,特异性为99.6%;比较FPA、IELISA、CELISA 3种方法,敏感性分别为97%、99.56%和98.27%,特异性分别为100%、98.06%和99.56%,同时3种方法一致性均≥0.75。结论 FPA检测技术可以用于动物布病诊断,在田间条件下,快速、准确诊断布病,避免动物二次抓捕,适于推广应用。 展开更多

关键词 布鲁菌病 FPA ielisa CELISA

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基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：9

16

作者 钱榜 李彦敏 +4 位作者 朱学亮 张学燕 Niyokwishimira Alfred 窦永喜 张志东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期144-153,共10页

本研究旨在建立针对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)H蛋白抗体的iELISA检测方法。以筛选的H蛋白B细胞表位为基础,选择反应原性较好的4个抗原表位肽串联后合成作为包被抗原,优化各步反应条件及筛选各种缓冲液,... 本研究旨在建立针对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)H蛋白抗体的iELISA检测方法。以筛选的H蛋白B细胞表位为基础,选择反应原性较好的4个抗原表位肽串联后合成作为包被抗原,优化各步反应条件及筛选各种缓冲液,并确定检测临界值。经优化后,多表位抗原肽的最佳包被量为1.5×10~(-6)μg·孔~(-1),血清临界稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶80 000;包被液为碳酸氢盐缓冲液,血清和二抗稀释液均为PBST溶液,封闭液为2%BSA溶液;阴、阳性临界值为0.25。不同血清的检测结果表明,批内及批间检测结果变异系数均小于10%,证明该方法具有良好的稳定性;对羊痘、口蹄疫、蓝舌病阳性血清的检测均为阴性,说明该方法具有良好的特异性;与ID-Vet公司的cELISA试剂盒对306份临床血清平行检测,两者相对符合率为92.81%。该研究所建立的PPRV H蛋白抗体iELISA检测方法特异、稳定、敏感,操作比cELISA简便快捷,省时省力,可用于临床小反刍兽疫抗体检测。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 H蛋白 B细胞表位 ielisa

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致马属动物流产沙门氏菌通用型间接ELISA抗体检测方法的建立与应用 被引量：7

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作者 郭奎 张泽楠 +5 位作者 李帅杰 初晓雨 王垚鑫 郭巍 胡哲 王晓钧 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期2421-2430,共10页

【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌(Salmonella)共同的优势抗原,建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA(iELISA)抗体检测方法,实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清... 【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌(Salmonella)共同的优势抗原,建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA(iELISA)抗体检测方法,实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀(pull down)试验,筛选出马流产沙门氏菌优势抗原;根据质谱分析结果找到优势抗原基因,将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性;其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达,设计3对引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a;测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)Rosetta(DE3)中并加入0.6 mmol·L^(-1)异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,观察蛋白的表达形式;蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性;然后利用纯化后蛋白作为包被抗原,通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法,并对该方法的特异性、敏感性进行评估。最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测,并将检测结果同凝集试验结果比较。【结果】筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA(Outer Membrane Protein,OMP),通过序列比对,该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4%—100%,具有很好的保守性;PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因;成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA33个重组质粒。SDS-PAGE结果表明,在24℃、0.6 mmol·L^(-1) IPTG诱导5 h下,含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白,其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达,重组ompA3蛋白以可溶性形式表达;Western blot显示,重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应,证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性,可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原;以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,在最大P/N比确定的最佳反应条件如下:最佳包被抗原浓度为1μg·mL^(-1),待检血清(1﹕200)37℃作用1 h,酶标抗马二抗(1﹕10000稀释),TMB在37℃孵育10 min,待检血清OD450>0.143判定为阳性,特异性试验结果显示,该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测,iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d,相比微量凝集(69 d)多监测了47 d,因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测,其抗体平均阳性检出率为63.3%,比微量凝集阳性检出率高53.9%。【结论】成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA,实现了对该蛋白的可溶性表达,建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法,该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测,该方法具有特异性强、敏感性高,可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具。 展开更多

关键词 马流产沙门氏菌病 OMPA 通用型 ielisa 诊断

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羊场布鲁氏菌病监测净化血清学检测方法选择与优化研究 被引量：5

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作者 吕素芳 王建军 +4 位作者 董炳梅 李玲 任洪林 胡莉萍 李峰 《中国草食动物科学》 CAS 2021年第6期45-49,共5页

为比较GICA与RBT方法用于布病初筛检测,iELISA、cELISA与SAT等方法用于布病确诊检测符合情况,统计比较以RBT、iELISA、GICA作为初筛试验方法,以SAT、cELISA、iELISA作为确诊检测方法不同组合阳性判断结果符合程度,遴选适合基层布病血清... 为比较GICA与RBT方法用于布病初筛检测,iELISA、cELISA与SAT等方法用于布病确诊检测符合情况,统计比较以RBT、iELISA、GICA作为初筛试验方法,以SAT、cELISA、iELISA作为确诊检测方法不同组合阳性判断结果符合程度,遴选适合基层布病血清学检测方法的组合。同时采用RBT、GICA、iELISA与cELISA方法,对滨州某羊场151只绵羊进行布病抗体检测,选择RBT检测阳性样品,应用SAT复检,并对以上初筛方法和确诊方法进行不同组合分析,与RBT初筛、cELISA方法确诊方法判定结果进行符合程度比较。结果显示:以确定RBT法初筛、cELISA法确诊,GICA法初筛、cELISA法确诊,RBT法初筛、iELISA法确诊等组合可作为布病监测净化的优先选择血清学检测方法。 展开更多

关键词 羊场 布鲁氏菌病 RBT GICA ielisa CELISA SAT

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犬瘟热病毒N基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及应用 被引量：2

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作者 冯佩平 张蕾 +9 位作者 柴秀丽 张海玲 赵建军 胡博 白雪 高晗 邵西群 闫喜军 赵权 徐磊 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期60-66,共7页

目的:为检测犬瘟热抗体提供诊断抗原,应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)N蛋白。方法:采用RT-PCR克隆CDV-N基因,构建重组杆粒BacmidCDV-N,并将其转染Sf9昆虫细胞。通过Western blot和间接免疫... 目的:为检测犬瘟热抗体提供诊断抗原,应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)N蛋白。方法:采用RT-PCR克隆CDV-N基因,构建重组杆粒BacmidCDV-N,并将其转染Sf9昆虫细胞。通过Western blot和间接免疫荧光检测N蛋白的表达。以表达的CDV N蛋白为包被抗原,建立了检测犬瘟热抗体的间接ELISA方法。结果:成功表达了CDV N蛋白。间接ELISA(iELISA)方法中,犬血清最佳稀释度1∶80,N蛋白稀释度1∶40(6.3μg/100μl)。应用该方法共检测了36份犬血清,与中和试验检测方法相比较,其特异性为81.8%,灵敏度为96.0%,符合率为91.7%。结论:表达的CDV-N蛋白具有良好反应原性,建立了快速检测CDV阳性血清的iELISA方法。 展开更多

关键词 CDV-N蛋白 杆状病毒表达系统 ielisa

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三种血清学方法检测牦牛布鲁氏菌病的比较 被引量：2

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作者 李金平 郭会玲 +4 位作者 薛晓波 薛晶 吐尔洪.努尔 马俊杰 易新萍 《草食家畜》 2014年第3期52-54,共3页

采集牦牛血清237份,用虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)进行布鲁氏菌病抗体检测。结果表明,RBPT和SAT与iELISA检测法阳性符合率分别为64.3%和57.1%,但iELISA与SAT和RBPT检测法总符合率达95%以... 采集牦牛血清237份,用虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)进行布鲁氏菌病抗体检测。结果表明,RBPT和SAT与iELISA检测法阳性符合率分别为64.3%和57.1%,但iELISA与SAT和RBPT检测法总符合率达95%以上。本结果表明iELISA试剂盒检测法快速、简便,敏感性和特异性高于RBPT和SAT法。 展开更多

关键词 布鲁氏菌病 牦牛 ielisa SAT RBPT

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