利用PCR方法鉴定hiTAIL-PCR扩增产物中的质粒骨架片段 被引量：1

1

作者 曹媛 杨云 +2 位作者 徐化全 刘洋 王丹阳 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期104-109,共6页

T-DNA突变体是研究基因功能的重要资源。高效热不对称交错PCR(hiTAIL-PCR)是克隆突变体中T-DNA插入位点侧翼序列的常用方法。然而我们发现,利用hiTAIL-PCR克隆到的一些侧翼序列并不对应于宿主的染色体DNA序列,而是质粒的骨架DNA片段。... T-DNA突变体是研究基因功能的重要资源。高效热不对称交错PCR(hiTAIL-PCR)是克隆突变体中T-DNA插入位点侧翼序列的常用方法。然而我们发现,利用hiTAIL-PCR克隆到的一些侧翼序列并不对应于宿主的染色体DNA序列,而是质粒的骨架DNA片段。通过设置1组RB-S4/AC1或者LB-A4/AC1对照反应,用PCR方法鉴定了hiTAIL-PCR扩增产物中位于T-DNA侧翼的质粒骨架片段。在后续分析中,通过排除这些片段,提高了利用hiTAIL-PCR获得宿主染色体DNA片段的效率。同时,通过调整反应程序,使得整个PCR的反应时间也大为缩短。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)T-DNA突变体drf1侧翼序列的克隆实例中,对照反应的引入将hiTAIL-PCR中需鉴定的22条扩增产物降至4条,效率提高了81.8%。 展开更多

关键词 hitail-pcr T-DNA突变体 侧翼序列 质粒骨架 克隆

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应用hiTAIL-PCR扩增转基因木瓜的侧翼序列 被引量：5

2

作者 陈红运 黄峰 +2 位作者 陈青 方志鹏 黄文胜 《植物检疫》 北大核心 2018年第5期24-27,共4页

品系特异性检测是实施转基因产品标识管理的技术保障,而获取转基因品系的侧翼序列是建立品系特异性检测方法的前提。本研究应用hi TAIL-PCR扩增两个抗病毒转基因木瓜品系的RB区侧翼序列。结果表明,海南木瓜样品为转基因木瓜品系18-2-4,... 品系特异性检测是实施转基因产品标识管理的技术保障,而获取转基因品系的侧翼序列是建立品系特异性检测方法的前提。本研究应用hi TAIL-PCR扩增两个抗病毒转基因木瓜品系的RB区侧翼序列。结果表明,海南木瓜样品为转基因木瓜品系18-2-4,送检木瓜样品为转基因木瓜品系16-0-1。与传统TAIL-PCR方法相比,hi TAIL-PCR扩增的非目标片段和小片段少,获得目标片段的成功率高,是快速扩增已知序列邻近的侧翼序列的好方法。 展开更多

关键词 热不对称交错PCR 转基因木瓜 侧翼序列

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利用HiTAIL-PCR技术鉴定T-DNA在RNAi-OsRhoGAP2水稻中的插入位点

3

作者 葛慧雯 李佳佳 +7 位作者 王高华 闫鑫甜 安文静 杜京尧 石佳 彭静静 王美娜 梁卫红 《江苏农业科学》 2018年第9期55-59,共5页

水稻OsRhoGAP2基因是前期从幼穗cDNA文库中筛选获得的功能未知基因,采用DNA重组技术构建OsRhoGAP2基因RNA干扰载体,并转化水稻。对转基因水稻的表型分析显示,OsRhoGAP2基因RNA干扰水稻株高显著高于对照水稻。采用高效热不对称交错PCR法(... 水稻OsRhoGAP2基因是前期从幼穗cDNA文库中筛选获得的功能未知基因,采用DNA重组技术构建OsRhoGAP2基因RNA干扰载体,并转化水稻。对转基因水稻的表型分析显示,OsRhoGAP2基因RNA干扰水稻株高显著高于对照水稻。采用高效热不对称交错PCR法(Hi TAIL-PCR)对RNAi-OsRhoGAP2转基因水稻T-DNA插入位点的侧翼序列进行分析,利用特异性嵌套引物扩增,结合序列对比分析,发现在4个不同的转基因水稻株系中,TDNA均插入到水稻OsRhoGAP2基因的第5个外显子内,本研究将为后续对该基因的功能鉴定提供重要依据。 展开更多

关键词 OsRhoGAP2基因 hitail-pcr 侧翼序列 T-DNA 转基因水稻 插入位点

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应用hiTAIL-PCR技术克隆Marinomonas sp.BSi20584菌株β-半乳糖苷酶基因 被引量：3

4

作者 周莉莉 陈瑞琴 +2 位作者 陈秀兰 曾胤新 陈波 《极地研究》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期249-256,共8页

实验使用hiTAIL-PCR(high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,高效热不对称交错PCR)方法,从海单胞菌Marinomonas sp.BSi20584中克隆β-半乳糖苷酶基因。从GenBank注册的已知β-半乳糖苷酶氨基酸序列出发,设计引物克隆编码β... 实验使用hiTAIL-PCR(high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,高效热不对称交错PCR)方法,从海单胞菌Marinomonas sp.BSi20584中克隆β-半乳糖苷酶基因。从GenBank注册的已知β-半乳糖苷酶氨基酸序列出发,设计引物克隆编码β-半乳糖苷酶保守片段的DAN序列;根据Marinomonas sp.BSi20584天然酶N端氨基酸残基测序结果,设计上游引物,保守DNA片段5'端设计下游引物,克隆N端到保守序列之间的DNA片段;将所得的2个DNA片段拼接并命名拼接后的片段为nbs。根据hiTAIL-PCR方法设计引物,染色体步移克隆nbs上下游片段,拼接上下游片段得到全长序列,设计引物扩增全长片段并测序。本文成功克隆了Marinomonas sp.BSi20584菌株β-半乳糖苷酶的编码基因,全长1 971 bp,NCBI比对表明其编码产物为GH-42家族的一个新成员。 展开更多

关键词 Β-半乳糖苷酶 高效热不对称交错PCR 染色体步移

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环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因侧翼序列的hiTAIL-PCR扩增及其生物信息学分析

5

作者 岑双庆 李有全 +10 位作者 张晓 何海宁 刘志杰 陈泽 杨吉飞 关贵全 牛庆丽 刘爱红 任巧云 罗建勋 殷宏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期1-6,共6页

为扩增环形泰勒虫微线体一棒状体蛋白基因的侧翼序列，从感染环形泰勒虫的淋巴细胞系中提取RNA，反转录合成第1链cDNA。以该cDNA为模板，利用高效热不对称交互PCR法（hiTAIL-PCR）进行扩增，将目的片段连接到pGEM—TEasy载体并进行测序... 为扩增环形泰勒虫微线体一棒状体蛋白基因的侧翼序列，从感染环形泰勒虫的淋巴细胞系中提取RNA，反转录合成第1链cDNA。以该cDNA为模板，利用高效热不对称交互PCR法（hiTAIL-PCR）进行扩增，将目的片段连接到pGEM—TEasy载体并进行测序。结果显示，获得了环形泰勒虫微线体一棒状体蛋白基因的5’端侧翼序列，该序列编码894个氨基酸。生物信息学分析结果表明，该蛋白具有信号肽，信号肽剪切部位位于第19～20个氨基酸残基之间，很可能是一种分泌蛋白；经TMHMM2．0预测，该蛋白在第875～892位氨基酸残基部位具有典型的跨膜结构；Motifscan预测的结果显示，环形泰勒虫微线体一棒状体蛋白存在2处N-糖基化位点（153NLSF、333NESM）和15处CK2蛋白激酶磷酸化位点；在该蛋白第500～650位氨基酸残基部分具有较高的抗原性，推测可能是该蛋白与其他蛋白发生相互作用的区域。 展开更多

关键词 环形泰勒虫 RT—PCR 微线体一棒状体蛋白 hiTAIL—PCR 生物信息学分析

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三种金花茶成花转变基因FT和CEN1及其启动子克隆与表达分析

6

作者 崔佳 俞璟菁 +3 位作者 张伊伊 邓诗玲 徐增富 王翊 《分子植物育种》 北大核心 2025年第11期3633-3646,共14页

金花茶组(Sect. Chrysanthae)植物具有很高的观赏价值,但其开花习性各不相同。为探究金花茶组植物成花机制,本研究以四季金花茶(Camellia perpetua)、金花茶(C. petelotii)和淡黄金花茶(C. flavida) 3种典型的金花茶为材料,克隆了控制... 金花茶组(Sect. Chrysanthae)植物具有很高的观赏价值,但其开花习性各不相同。为探究金花茶组植物成花机制,本研究以四季金花茶(Camellia perpetua)、金花茶(C. petelotii)和淡黄金花茶(C. flavida) 3种典型的金花茶为材料,克隆了控制成花转变的关键基因FLOWERING LOCUS T (FT)和CENTRORADIALIS1(CEN1)以及它们的启动子,对基因和启动子的结构特点进行分析,并通过RT-qPCR对三种金花茶不同组织中的FT和CEN1的表达进行定量分析。结果显示三种金花茶FT和CEN1编码的氨基酸序列极为相似,推测它们的功能可能相同。基因表达分析显示三种金花茶的FT基因主要在叶片中表达,在花芽、苞片中表达量较低,其中四季金花茶的CperFT基因在嫩叶及其叶柄和幼态叶的叶柄中表达量较高;三种金花茶CEN1主要在逐渐张开、显露色泽的花蕾中表达,且在花器官中表达量各不相同,在叶片、顶芽和花芽中的表达量相对较低。启动子序列分析显示,三种金花茶FT和CEN1启动子均具有不同数量的TATA-box和CAAT-box核心元件,同时激素响应、生物和非生物胁迫响应元件也存在差异。金花茶和四季金花茶的FT和CEN1启动子序列比较接近,淡黄金花茶CflaFT和CflaCEN1与它们相差较大。本研究结果表明三种金花茶开花习性的差异可能不是由FT和CEN1编码的蛋白功能差异引起的,很可能与它们的表达模式差异有关。 展开更多

关键词 金花茶 FT CEN1 启动子 hitail-pcr技术

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2个蜡梅nsLTP基因启动子的克隆及其在烟草中的瞬时表达分析 被引量：7

7

作者 马婧 刘群 +2 位作者 王晓斌 眭顺照 李名扬 《植物遗传资源学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期601-608,共8页

利用hiTAIL-PCR法得到了2个蜡梅(Chimonanthus praecox)非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein)基因家族成员CpLTP3和CpLTP4翻译起始位点上游启动子序列,长度分别为1298bp和838bp。生物信息学分析表明2个序列均存在... 利用hiTAIL-PCR法得到了2个蜡梅(Chimonanthus praecox)非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein)基因家族成员CpLTP3和CpLTP4翻译起始位点上游启动子序列,长度分别为1298bp和838bp。生物信息学分析表明2个序列均存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。在烟草叶片中的瞬时表达结果表明这两个启动子序列均具备驱动报告基因GUS表达的功能。 展开更多

关键词 蜡梅 非特异性脂转移蛋白 启动子 hitail-pcr 胁迫

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肠出血性大肠杆菌O157∶H7变种Q蛋白对志贺毒素表达的影响 被引量：1

8

作者 李嘉文 郑冬冬 +4 位作者 王宏勋 刘志国 余晓丽 周帼萍 李睿 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第15期151-155,共5页

1株肠出血性大肠杆菌O15 7∶H7变种EC169菌株,携带stx基因但不表达志贺毒素。通过高效热不对称交错聚合酶链式反应(high-efficiency thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,hiTAIL-PCR)hiTAILPCR扩增得到EC169 stx1... 1株肠出血性大肠杆菌O15 7∶H7变种EC169菌株,携带stx基因但不表达志贺毒素。通过高效热不对称交错聚合酶链式反应(high-efficiency thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,hiTAIL-PCR)hiTAILPCR扩增得到EC169 stx1及其上游核苷酸片段并克隆测序,结果表明:EC169 q基因与标准株sakai q基因相比存在6个SNP位点。通过PCR扩增O157∶H7高毒株EC150 q基因全长,并构建表达载体pkk223-q分别转化EC169和低毒株EC157。反转录荧光定量PCR实验结果表明,外源q基因在EC169和EC157重组菌中可高效表达,并引起EC157stx转录水平上调,但EC169重组菌stx转录水平不变。反向乳胶凝集实验结果亦证实EC157重组菌志贺毒素表达量提高,而EC169重组菌志贺毒素表达量不变。Q蛋白变异可能并非EC169志贺毒素不表达的主要原因。 展开更多

关键词 大肠杆菌O157∶H7 Q蛋白 反转录荧光定量PCR 志贺毒素 hitail-pcr

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苹果树腐烂病菌VmSom1基因克隆与序列分析 被引量：1

9

作者 王怡霖 赵涛 +5 位作者 孙庚午 刁雨菲 冯军利 于涛 何邦令 刘会香 《山东农业大学学报（自然科学版）》 北大核心 2020年第5期785-791,共7页

苹果树腐烂病(Valsa canker of apple)是由苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali)引起的重要枝干病害,危害严重,明确病菌致病机制对有效防控病害十分重要和必要。在众多研究方法中,分离和克隆致病相关基因进而研究基因功能是揭示病菌致病机制的基... 苹果树腐烂病(Valsa canker of apple)是由苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali)引起的重要枝干病害,危害严重,明确病菌致病机制对有效防控病害十分重要和必要。在众多研究方法中,分离和克隆致病相关基因进而研究基因功能是揭示病菌致病机制的基础。本论文在已建立的苹果树腐烂病菌农杆菌介导的遗传转化体系(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation ATMT)基础上,经过表型筛选,发现了V23菌株。该菌株生长速率明显减慢,菌落表面较为湿润,菌丝生长弱,致病性完全丧失且不产生子实体。通过侧翼序列扩增和Blast及基因序列分析,确定了T-DNA插入突变基因位于苹果树腐烂病菌第12号染色体69537和69547之间;系统进化分析显示,该基因的氨基酸序列与Som1基因编码的camp-dependent protein kinase pathway protein聚为一类,因此将该基因命名为VmSom1。它是一个转录调控因子,其基因大小为2723 bp,含有5个外显子和4个内含子,为单拷贝,编码824 aa的氨基酸,包含LisH结构域和NLS结构域,理论蛋白分子量约87.82 k Da,等电点pI为6.39,亲水性较强。本研究为下一步该基因功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 苹果树腐烂病菌 hitail-pcr VmSom1基因 生长发育 致病性

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转MSTN干扰载体细胞株的获得及外源基因整合情况的研究

10

作者 刘丹 佟慧丽 +3 位作者 李树峰 常淑伟 杨翠翠 严云勤 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期906-912,共7页

转基因细胞株的建立能够为转基因体细胞克隆技术奠定重要基础。该实验利用MSTN干扰载体,转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,获得5个相应的转基因单克隆细胞株。采用Realtime PCR和高效热不对称互交式PCR(hiTAIL-PCR)技术检测细胞克隆中MSTN表... 转基因细胞株的建立能够为转基因体细胞克隆技术奠定重要基础。该实验利用MSTN干扰载体,转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,获得5个相应的转基因单克隆细胞株。采用Realtime PCR和高效热不对称互交式PCR(hiTAIL-PCR)技术检测细胞克隆中MSTN表达载体的拷贝数及其在牛基因组中的整合位点。结果表明,荧光定量PCR有效检测到5个细胞克隆中质粒的拷贝数分别为2.26±0.32、1.52±0.25、25.68±1.02、8.43±0.73和6.72±0.10。hiTAIL-PCR对整合位点的检测结果表明,质粒片段在插入到基因组的过程中进行了重组,其与基因组的结点处有2或4个共同的碱基序列。该研究探索MSTN干扰载体在牛胎儿成纤维细胞中的整合机制,以期获得遗传背景清楚的转基因细胞作为体细胞核移植的重要材料,为高产转基因肉牛新品种的培育提供重要的理论和实验基础。 展开更多

关键词 MSTN 转基因细胞株 拷贝数 整合位点 REAL-TIME PCR hitail-pcr

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假单胞菌(Pseudomonas sp.)AT39突变体库的构建及反式茴脑利用相关基因(tao)的克隆

11

作者 蒋琼 黄罗冬 +1 位作者 华燕飞 申佩弘 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期325-330,共6页

生物转化反式茴脑生成的苯丙素类芳香物质被视为天然原料,能广泛应用于食品加工、香料生产及医药等领域。以能代谢反式茴脑的假单胞菌(Pseudomonas sp.)AT39为出发菌株,采用转座子(pTnMod-RKm’)插入突变构建了含有6137个突变体的突变体... 生物转化反式茴脑生成的苯丙素类芳香物质被视为天然原料,能广泛应用于食品加工、香料生产及医药等领域。以能代谢反式茴脑的假单胞菌(Pseudomonas sp.)AT39为出发菌株,采用转座子(pTnMod-RKm’)插入突变构建了含有6137个突变体的突变体库,筛选出44株反式茴脑代谢受影响的突变株。检测突变菌及野生菌的反式茴脑利用能力,发现突变菌AT39-15的反式茴脑代谢能力是野生菌的14%。利用hiTAIL-PCR技术对突变菌AT39-15转座子侧翼序列扩增,获得插入突变的基因,测序结果显示基因大小为1047 bp,基因序列与恶臭假单胞菌(Pseudomonas sp.)JYR-1的反式茴脑氧化酶基因(tao)一致性达100%。研究结果为下一步构建基因工程菌提供了基因资源。 展开更多

关键词 反式茴脑 突变体库 hitail-pcr TAO

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茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆及功能分析 被引量：2

12

作者 刘平 任秋婧 +5 位作者 康馨 张媛媛 林晓蓉 李斌 高雄 陈忠正 《茶叶科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期569-579,共11页

咖啡碱是茶叶中重要的功能物质,N-甲基转移酶(NMT)是其生物合成的关键酶。本研究以英红9号茶树新梢为材料,利用hiTAIL-PCR克隆NMT1基因启动子,并采用PlantCARE等在线软件分析其顺式作用元件。根据其元件组成,设计5'递减的启动子与GU... 咖啡碱是茶叶中重要的功能物质,N-甲基转移酶(NMT)是其生物合成的关键酶。本研究以英红9号茶树新梢为材料,利用hiTAIL-PCR克隆NMT1基因启动子,并采用PlantCARE等在线软件分析其顺式作用元件。根据其元件组成,设计5'递减的启动子与GUS基因一起组建了融合载体转入烟草,利用GUS染色和定量PCR方法,分析了克隆的启动子功能及其对环境因子的响应。结果表明,克隆的NMT1基因启动子长767 bp,含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。以5'递减的NMT1启动子替换pBI121中的CaMV35S启动子,构建出与GUS融合的pA、pB、pC、pD载体。在烟草叶片中进行瞬时表达,不同长度的NMT1启动子均具驱动GUS表达功能,且长度越长驱动能力越强。以含全长NMT1启动子载体pA对烟草转基因,转基因烟草各组织均检测到GUS基因的表达且表达量叶>茎>根,叶片中的表达量为根部的3倍。对转基因烟草进行不同程度光照、温度、模拟干旱和脱落酸处理后,除40℃温度条件外,其他处理的叶片中GUS基因表达在处理前后均存在显著变化,表明NMT1启动子功能受外界环境因子的胁迫影响。 展开更多

关键词 茶树 N-甲基转移酶 hitail-pcr 启动子 GUS基因

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小金海棠MxYSL5启动子克隆技术的比较 被引量：1

13

作者 陈竹 王忆 +2 位作者 殷丽丽 张新忠 韩振海 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期95-101,共7页

分别利用3种基于PCR技术的染色体步移法克隆了小金海棠MxYLS5基因的启动子,并比较了这三个体系的扩增产物。3种体系都可以获得特异性扩增产物,但扩增条带的长度和数量均不同,其中利用Genome Walking Kit扩增出来的条带特异性较好长度最... 分别利用3种基于PCR技术的染色体步移法克隆了小金海棠MxYLS5基因的启动子,并比较了这三个体系的扩增产物。3种体系都可以获得特异性扩增产物,但扩增条带的长度和数量均不同,其中利用Genome Walking Kit扩增出来的条带特异性较好长度最长,而且特异性引物和简并引物的设计及退火温度的设置对3种体系的扩增产物起着关键的作用。基于PCR技术的染色体步移法为小金海棠MxYLS5基因启动子的克隆提供了一个稳定可靠的技术手段。 展开更多

关键词 启动子克隆 染色体步移 TAIL-PCR hitail-pcr 小金海棠

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大丽轮枝菌致病缺陷型T-DNA插入突变体的筛选与鉴定 被引量：3

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作者 崔伟业 周雷 +3 位作者 单柳颖 张君 戴小枫 郭维 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期29-37,共9页

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hiTAIL-PCR(High-efficiency thermal ... 【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hiTAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析。【结果】与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低。Southern杂交表明其中1个突变体中T-DNA为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入。生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低。Blast比对分析明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因。【结论】筛选和鉴定T-DNA插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础。 展开更多

关键词 大丽轮枝菌 致病力 T-DNA hitail-pcr 侧翼序列分析

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转BtCry1Ac欧洲黑杨的外源基因插入位点分析及特异性检测 被引量：3

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作者 张磊 胡建军 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第10期45-52,共8页

【目的】分析转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因插入位点,从而进一步完善抗虫转基因杨树的背景信息,推进抗虫转基因杨树的安全评价及应用。【方法】以转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12、n222为试验材料,使用高效热不对称交错PCR法(hiTAIL-PCR)分离... 【目的】分析转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因插入位点,从而进一步完善抗虫转基因杨树的背景信息,推进抗虫转基因杨树的安全评价及应用。【方法】以转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12、n222为试验材料,使用高效热不对称交错PCR法(hiTAIL-PCR)分离外源基因插入位点侧翼序列,比对毛果杨基因组序列确定插入位点。根据插入位点处的侧翼序列设计2对特异性PCR检测引物,建立转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因特异性PCR检测方法,并利用实时荧光定量PCR技术分析插入位点周边基因表达情况。【结果】PCR及半定量PCR结果表明,转基因欧洲黑杨株系的BtCry1Ac基因稳定表达。通过比对毛果杨基因组序列确定转基因杨n12 T-DNA插入基因组Chr15的10162773位点即Potri.015G076600第2个内含子,其碱基组成AT含量为65%;n222整合位点为基因组Chr01基因间隔区41596184位点,其碱基组成AT含量为69%。特异性PCR检测显示,n12能扩增出709 bp(转基因)和1159 bp(非转基因)特异性条带,n222及其与丹红杨杂交子代能扩增出1265 bp(转基因)和1827 bp(非转基因)特异性条带,而对照仅能扩增非转基因特异性片段。n12 T-DNA插入造成插入位点的丝氨酸蛋白激酶(SPK)Potri.015G076600基因表达量上调4.3倍,而附近的共济失调毛细血管扩张症突变蛋白(ATM)Potri.015G076700表达量下调20倍,从而可能调节杨树生长速度。n222插入位点上下游基因异黄酮-7-O-β-葡萄糖苷6″-O-丙二酰转移酶(IBG)Potri.001G395700和光敏色素互作因子解旋酶(PIF)Potri.001G395800表达量均上调。【结论】转BtCry1Ac欧洲黑杨T-DNA偏好插入富含AT区域,同时T-DNA载体边界序列缺失,并引起插入位点附近基因表达量变化。建立转BtCry1Ac欧洲黑杨特异性检测方法,为转BtCry1Ac欧洲黑杨的管理与监测提供参考。 展开更多

关键词 欧洲黑杨 抗虫基因 BtCry1Ac 转基因 hitail-pcr 侧翼序列 事件特异性检测

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芸薹生链格孢致病缺陷突变体的筛选及初步分析 被引量：1

16

作者 张晓斐 刘伟阳 +2 位作者 卢凯 张敏 徐后娟 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期2635-2639,共5页

芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire)引起的黑斑病是十字花科蔬菜生产上的重要病害之一,在全球主产区都有报道。目前关于该病菌的致病机理的研究还较少。因此,查找和鉴定芸薹生链格孢致病相关基因,不仅有助于... 芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire)引起的黑斑病是十字花科蔬菜生产上的重要病害之一,在全球主产区都有报道。目前关于该病菌的致病机理的研究还较少。因此,查找和鉴定芸薹生链格孢致病相关基因,不仅有助于认识该类病原真菌致病的分子机制,还有助于发现病害防治新靶标。本研究从本实验室已构建的芸薹生链格孢转化子库中筛选得到了7株致病性缺陷的突变菌株。进一步利用Hi TAIL-PCR技术对插入位点的侧翼序列进行了扩增,并通过生物学分析方法进行了初步分析。相关研究结果将有助于对芸薹生链格孢致病机理的认识,为发现病害防治新靶标提供理论基础。 展开更多

关键词 芸薹生链格孢 致病缺陷 hitail-pcr

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‘南通小方柿’cDNA文库构建及DkGA2ox2调控因子的筛选 被引量：2

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作者 叶夏林 曹丽芳 +2 位作者 董雨菡 侯应军 渠慎春 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2022年第21期7082-7090,共9页

本研究利用酵母单杂技术筛选DkGA2ox2基因上游转录因子,为进一步研究其表达调控机制提供理论基础。利用HiTAIL-PCR技术获得启动子序列,连入诱饵载体,转化进诱饵菌株。利用Gateway技术构建‘南通小方柿’cDNA文库,再共转化诱饵菌株,筛选... 本研究利用酵母单杂技术筛选DkGA2ox2基因上游转录因子,为进一步研究其表达调控机制提供理论基础。利用HiTAIL-PCR技术获得启动子序列,连入诱饵载体,转化进诱饵菌株。利用Gateway技术构建‘南通小方柿’cDNA文库,再共转化诱饵菌株,筛选得到转录因子。通过HiTAIL-PCR共获得1205 bp启动子序列。构建的文库库容为1.4×107,插入片段大小在750~2000 bp间,重组率100%。初步筛选出HB蛋白、FLL3蛋白和EIN3/EIL1蛋白3个候选蛋白,为探索DkGA2ox2基因上游调控机制提供了理论支撑。 展开更多

关键词 DkGA2ox2 hitail-pcr GATEWAY技术 CDNA文库 酵母单杂

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芋头过氧化物酶基因克隆 被引量：4

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作者 莫俊杰 梁钾贤 +2 位作者 胡汉桥 黄红 陈妤 《广东农业科学》 CAS 2016年第9期37-43,共7页

根据芋头的密码子使用频率,用i CODEHOP设计简并引物扩增芋头过氧化物酶基因序列,待芋头过氧化物酶基因非侧翼序列扩增成功后,依据其序列合成hiTAIL-PCR引物扩增芋头过氧化物酶基因的两侧序列。结果从芋头基因组DNA中克隆出1 165 bp序列... 根据芋头的密码子使用频率,用i CODEHOP设计简并引物扩增芋头过氧化物酶基因序列,待芋头过氧化物酶基因非侧翼序列扩增成功后,依据其序列合成hiTAIL-PCR引物扩增芋头过氧化物酶基因的两侧序列。结果从芋头基因组DNA中克隆出1 165 bp序列,经同源性分析为过氧化物酶基因的部分序列;再利用hiTAIL-PCR技术可以扩增出芋头过氧化物酶基因的两侧序列,扩增序列为689 bp,测序结果能与1 165 bp序列拼接到一起,长1 854 bp。与已知的过氧化物酶进行序列比对,发现两侧还有氨基酸的编码序列,因此进行第2次hiTAIL-PCR,扩增出165 bp芋头过氧化物酶基因的侧翼序列,拼接后得到2 019bp。用Softberry上的基因预测软件分析后,发现包含过氧化物酶4个外显子,同源性分析表明,此过氧化物酶基因为含血红素的第三类过氧化物酶。 展开更多

关键词 芋头 过氧化物酶基因 hiTAIL—PCR 克隆

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高效TAIL-PCR的改良及在洋葱中的应用 被引量：6

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作者 缪军 霍雨猛 +5 位作者 杨妍妍 修景润 刘冰江 张一卉 霍凤梅 吴雄 《山东农业科学》 2009年第10期1-4,共4页

高效TAIL-PCR是一种完全依赖PCR的方法,它利用5'端带尾巴的高简并倍数的LAD引物在未知序列上创造结合位点;LAD0引物是LAD系列简并引物5'端的部分序列,利用其可以保证PCR扩增中结合未知序列端的引物浓度;利用巢式PCR可提高扩增... 高效TAIL-PCR是一种完全依赖PCR的方法,它利用5'端带尾巴的高简并倍数的LAD引物在未知序列上创造结合位点;LAD0引物是LAD系列简并引物5'端的部分序列,利用其可以保证PCR扩增中结合未知序列端的引物浓度;利用巢式PCR可提高扩增产物特异性。本研究将该技术应用于洋葱的未知侧翼序列分离,建立了洋葱的高效TAIL-PCR技术体系。 展开更多

关键词 高效TAIL—PCR 特异性引物 简并引物 侧翼序列分离 洋葱

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天山雪莲rbcS基因启动子的克隆及序列分析 被引量：2

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作者 张亚敏 杨晶 +1 位作者 王爱英 祝建波 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期146-152,共7页

以天山雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)为材料,根据已获得的天山雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组序列设计引物,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)扩增到rbcS基因5′上游启动子序列,长为1 668bp。... 以天山雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)为材料,根据已获得的天山雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组序列设计引物,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)扩增到rbcS基因5′上游启动子序列,长为1 668bp。用PlantCare和PLACE软件序列分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CA AT-box,包含多个胁迫诱导元件,如光诱导元件、赤霉素、低温诱导元件,昼夜节律调控元件等。构建pBI-PsikrbcS-GUS植物表达载体,并成功将其转化进入农杆菌。sikrbcS基因启动子的克隆与分析为进一步研究雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的表达调控奠定了基础。 展开更多

关键词 天山雪莲 RBCS 热不对称交错PCR 高效TAIL-PCR 启动子 序列分析

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