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沉默HLA A2表达的骨髓间充质干细胞安全性的研究 被引量:2
1
作者 姚素艳 赵刚 +2 位作者 刘建生 马万里 郑德宇 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期489-492,530,共5页
目的探讨人白细胞抗原A2(HLA A2)表达沉默后人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的安全性。方法实验分为对照组(正常培养至第8代细胞组)及实验组1和实验组2(分别为HLA A2表达沉默后第5代、第15代)。复苏HLA A2表达沉默的hBMSCs,通过观察细胞的... 目的探讨人白细胞抗原A2(HLA A2)表达沉默后人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的安全性。方法实验分为对照组(正常培养至第8代细胞组)及实验组1和实验组2(分别为HLA A2表达沉默后第5代、第15代)。复苏HLA A2表达沉默的hBMSCs,通过观察细胞的生长曲线、端粒酶活性和抑癌基因P27的表达水平、细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)和Cyclin D2的表达水平,分析细胞的安全性。并将细胞接种于裸鼠的皮下,24周后观察荷瘤组织的种类。结果实验组1、实验组2与对照组相比,细胞生长曲线没有明显的左移或右移。HLA A2表达沉默的hBMSCs在沉默HLA A2表达后,3组间的端粒酶活性没有明显差异;3组的Cyclin D2、CDK4和抑癌基因P27的表达量也没有明显变化。细胞接种于裸鼠皮下24周,只有异位成骨,而没有形成肿瘤组织。结论人BMSCs的HLA A2表达沉默后,在实验周期内,没有明显证据表明有安全性的改变。 展开更多
关键词 人白细胞抗原(hla)a2 RNA干扰 安全性 人骨髓间充质干细胞(hBMSCs) Cyclin D2 CDK4 P27
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可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化 被引量:10
2
作者 翁秀芳 陈浩 +4 位作者 吴雄文 梁智辉 韩军艳 黄亚非 龚非力 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期265-268,共4页
目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作... 目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作用下进行生物素化 ,使生物素结合到HLA A2 抗原肽复合物中的H链C端。利用特异性抗体 (mAbW6 / 32和兔抗人 β2m抗体 )及链霉亲合素进行ELISA和Westernblot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 :折叠复合物中 ,主要含有HLAH链聚合体、HLA A2 肽复合物单体及 β2m3种成分 ,其中H链聚合体与HLA A2单体可生物素化。结论 :成功地获得生物素化的HLA A2 抗原肽复合物单体 ,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础 ,也为过程复杂的HLA 展开更多
关键词 hlaa2-抗原肽复合物 生物素化 BirA酶
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人肿瘤转移相关抗原肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测及初步鉴定 被引量:8
3
作者 陈婷 万瑛 +5 位作者 汤旭东 房殿春 余松涛 熊震 罗元辉 杨仕明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第22期2120-2123,共4页
目的预测并鉴定肿瘤转移相关抗原肝素酶来源的HLA-A2.1限制性CTL表位。方法采用超基序、量化基序和分子模拟相结合的方法,对肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位进行预测,合成候选表位肽;利用T2细胞的特点,对合成的候选肽与HLA-A2.1分子进行亲... 目的预测并鉴定肿瘤转移相关抗原肝素酶来源的HLA-A2.1限制性CTL表位。方法采用超基序、量化基序和分子模拟相结合的方法,对肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位进行预测,合成候选表位肽;利用T2细胞的特点,对合成的候选肽与HLA-A2.1分子进行亲和力分析,初步验证预测结果;利用标准51Cr释放试验检测特异性CTLs诱导活性。结果在所筛选的5个候选CTL表位中,Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可在体外有效诱导肝素酶特异性CTLs的产生,对肝素酶阳性且HLA-A2阳性的KATO-Ⅲ细胞具有明显的杀伤效应。结论Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)有可能是肿瘤抗原肝素酶HLA-A2.1的限制性CTL表位。 展开更多
关键词 肝素酶 表位 hla-a2.1限制性 分子模拟
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反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定 被引量:4
4
作者 段德义 张海燕 +2 位作者 徐群渊 李颖 杨慧 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期103-107,共5页
为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行... 为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。 展开更多
关键词 反义hla-a2 GDNF 基因表达 逆转录病毒载体 PARKINSON病 神经退行性疾病 人成纤维细胞 基因治疗
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HLA-A2^+供者外周血hCMV特异性CTL的定量及其表型分析 被引量:4
5
作者 查庆兵 何贤辉 +2 位作者 徐丽慧 迟晓云 曾耀英 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期247-251,共5页
目的:利用加载人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A0201(A2-NLV)四聚体,探讨四聚体染色条件的优化及其在特异性CTL表型分析中的应用。方法:取HLA-A2+供者外周血,以A2-NLV四聚体/PE在不同条件下染色,然后以... 目的:利用加载人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A0201(A2-NLV)四聚体,探讨四聚体染色条件的优化及其在特异性CTL表型分析中的应用。方法:取HLA-A2+供者外周血,以A2-NLV四聚体/PE在不同条件下染色,然后以anti-CD3-FITC和anti-CD8-APC标记,流式细胞术分析染色结果,寻找四聚体最佳染色条件,并分析特异性CTL的表型和活化抗原表达。结果:以全血样进行四聚体染色结果优于分离的PBMC。A2-NLV四聚体用量为0.3μg时,与100μL全血于4℃温育1h,特异性染色效果最佳,而与CD8-T细胞非特异性结合很低。以此优化条件进行特异性CTL表型分析,结果显示CD28阳性的A2-NLV四聚体特异性CTL的百分率较非特异性CTL低,表达CD57的百分率较非特异性CTL高,CD25分子只表达于活化的特异性CTL上。结论:通过对染色条件进行优化可明显提高四聚体染色的特异性,降低非特异性结合,优化的四聚体染色法能用于抗原特异性CTL的表型和功能分析。 展开更多
关键词 hla-a2四聚体 巨细胞病毒 CTL 四聚体染色
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西安地区供血员中HLA-A2抗原分布和HCV感染关系的初步研究 被引量:6
6
作者 李长秦 周红超 +3 位作者 徐德忠 董菁 张鹏 张景霞 《解放军预防医学杂志》 CAS 北大核心 1998年第6期415-417,共3页
用对比研究的方法分析了15例感染丙型肝炎病毒(HCV)的供血员(病例组)和15例健康供血员(对照组)中HLAⅠ类抗原分布频率。结果发现,病例组中,HLA-A2、A11、B40、B15的抗原频率分别为26.67%、33... 用对比研究的方法分析了15例感染丙型肝炎病毒(HCV)的供血员(病例组)和15例健康供血员(对照组)中HLAⅠ类抗原分布频率。结果发现,病例组中,HLA-A2、A11、B40、B15的抗原频率分别为26.67%、33.33%、6.67%、20.00%。对照组中HLA-A2、A11、B40、B15的抗原频率分别为73.33%、40.00%、6.67%、6.67%,HLA-A2抗原频率在病例组和对照组之间存在显著差异(P<0.05)。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 hla 抗原 献血员
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基于HCA587的HLA-A2限制性表位肽的体内免疫原性研究 被引量:3
7
作者 张丽洁 陈娟娟 +5 位作者 徐翠香 李艳春 韩秀蕊 杨娣娣 魏绪仓 尹艳慧 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期25-28,共4页
目的检测来源于HCA587的HLA-A2限制性表位肽免疫HLA-A2转基因小鼠后产生细胞应答的水平,筛选出体内具有免疫原性的HLA-A2限制性表位肽。方法将来源于HCA587的候选HLA-A2限制性肽与MHC-Ⅱ类限制性肽HBV-core128-140、不完全弗氏佐剂、Cp ... 目的检测来源于HCA587的HLA-A2限制性表位肽免疫HLA-A2转基因小鼠后产生细胞应答的水平,筛选出体内具有免疫原性的HLA-A2限制性表位肽。方法将来源于HCA587的候选HLA-A2限制性肽与MHC-Ⅱ类限制性肽HBV-core128-140、不完全弗氏佐剂、Cp G ODN1826联合应用皮下免疫HLA-A2转基因小鼠,用酶联免疫斑点实验(ELISpot)检测小鼠脾细胞表位肽特异性细胞免疫应答的水平,流式细胞术检测表位肽特异性的CD8+T细胞比例。结果在检测的4个表位肽中,p248-256诱导HLA-A2转基因小鼠产生的细胞免疫应答最强,HLA-A2-H-2Kb-p248-256四聚体染色进一步表明p248-256免疫后可产生p248-256特异性的CD8+T细胞。结论来源于HCA587的HLA-A2限制性表位肽中,p248-256具有较强的体内免疫原性。 展开更多
关键词 HCA587 hla-a2限制性表位肽 体内免疫原性
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SBT、SSOP法分析湖北土家族妇女HLA-A2超型各等位基因及与宫颈癌的关联 被引量:1
8
作者 邱小萍 张涵 +3 位作者 陶宁 谭云 魏芸 伍欣星 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期109-112,共4页
目的通过检测湖北土家族人群HLA-A2超型(包含A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802、A*6901)各等位基因,分析与宫颈癌关联的等位基因及其结构与功能特点.方法提取湖北土家族正常人群236名育龄妇女及59例原... 目的通过检测湖北土家族人群HLA-A2超型(包含A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802、A*6901)各等位基因,分析与宫颈癌关联的等位基因及其结构与功能特点.方法提取湖北土家族正常人群236名育龄妇女及59例原发性宫颈癌患者外周血DNA,采用SBT(sequence based typing)、SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide Probes)HLA基因分型技术,对HLA-A2超型各等位基因型进行分型,比较宫颈癌病例组和正常对照组中HLA-A2超型中相应等位基因型构成比的差异,并分析相关等位基因的结构特点.结果有7种HLA-A2超型等位基因HLA-A*0201(17.3%)HLA-A*0202(9.5%)HLA A*0203(1.4%)HLA-A*0204(3.8%)HLA-A*0205(3.1%)HLA-A*0206(10.8%)HLA-A*0207/0215N(9.8%),其中HLA-A*0202和HLA A*0206在正常对照组和宫颈癌病人组的构成比有显著性差异(p<0.05),HLA-A*0202(OR=0.24,95%CI=0.05~0.48)和HLA A*0206(OR=0.2,95%CI=0.67~1.07)对于宫颈癌发生的易感性有保护作用.结论湖北土家族人群HLA-A*0201所占比例最高达17.3%,HLA-A*0202和HLA-A*0206对于宫颈癌发生的易感性有保护作用. 展开更多
关键词 宫颈肿瘤 hlaa2抗原 等位基因 流行病学 分子 病例对照研究
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OVA66抗原肽与HLA-A2分子结合性和结合稳定性的研究 被引量:2
9
作者 王颖 尤强 +4 位作者 张惠珍 王树军 陈玲琳 周光炎 葛海良 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2003年第4期257-259,共3页
目的:建立利用T2细胞体外筛选肿瘤相关抗原OVA66中HLA-A2限制性抗原肽表位的实验方法。方法:应用计算机预测获得OVA66抗原中多个不同分值的九肽分子,在不同浓度(0.2μg/ml,2μg/ml,5μg/ml和20μg/ml)下与T2细胞共同孵育4h,并分别在其后... 目的:建立利用T2细胞体外筛选肿瘤相关抗原OVA66中HLA-A2限制性抗原肽表位的实验方法。方法:应用计算机预测获得OVA66抗原中多个不同分值的九肽分子,在不同浓度(0.2μg/ml,2μg/ml,5μg/ml和20μg/ml)下与T2细胞共同孵育4h,并分别在其后的0,2,4h测定T2细胞表面HLA-A2分子的平均表达强度,抗原肽与HLA-A2的亲和力以20%MFI_(max)时的抗原肽作用浓度表示;抗原肽与HLA-A2分子结合稳定性以MFI(4h)/MFI(0 h)的百分比表示。结果:经计算机预测所获得的分值不同的4种候选OVA66抗原肽表位与T2细胞表面HLA-A*0201的结合能力和结合稳定性显示出差别,并且与预测的分值不尽符合,其中L235和L238与HLA-A*0201的结合力优于L236和L237。结论:利用T2细胞可以在体外初步筛选获得与HLA-A*0201具有高亲和力的抗原肽。 展开更多
关键词 0VA66抗原肽表位 hlaa2 结合能力 结合稳定性 肿瘤
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用计算机程序预测可与HLA-A2分子结合的HCV抗原肽 被引量:2
10
作者 周红超 董明清 +4 位作者 徐德忠 闫永平 张景霞 宋宏彬 李远贵 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 1996年第4期41-46,共6页
本文设计了一个具有查找HLA分子结合多肽功能的“Findingepitope”程序,并针对HLA-A2分子特异的多肽结合基序(peptidebindingmotif)建立了一个计算机评分系统。对HCV1型丙型肝炎病毒... 本文设计了一个具有查找HLA分子结合多肽功能的“Findingepitope”程序,并针对HLA-A2分子特异的多肽结合基序(peptidebindingmotif)建立了一个计算机评分系统。对HCV1型丙型肝炎病毒株中的HCV-1和HCV-H两条氨基酸序列分析后发现,报道的HI-A-A2分子结合的HCV抗原均包含于查找的结果中,且绝大多数(11/12)评分≥144分。提示该程序可作为一种较为灵敏的能预测与HLA-A2分子结合的HCV抗原的方法。 展开更多
关键词 hla-a2分子 丙型肝炎病毒 多肽 基序 计算机
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肝癌相关肿瘤抗原HLA-A2限制性CTL表位的预测 被引量:7
11
作者 董海龙 隋延仿 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第6期492-494,共3页
目的 :预测肝癌肿瘤抗原的HLA A2限制性CTL表位 .方法 :选择与肝癌相关的肿瘤抗原MAGE 1,MAGE 3 ,MAGE 8,p5 3及AFP为研究目标 ,采用SYFPEITHI基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法进行HLA A 0 2 0 1限制性CTL表位预测 ... 目的 :预测肝癌肿瘤抗原的HLA A2限制性CTL表位 .方法 :选择与肝癌相关的肿瘤抗原MAGE 1,MAGE 3 ,MAGE 8,p5 3及AFP为研究目标 ,采用SYFPEITHI基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法进行HLA A 0 2 0 1限制性CTL表位预测 .结果 :共预测出与肝癌相关的肿瘤相关抗原的 3 5个HLA A2限制性CTL表位 .结论 :两种预测方法结果的一致性较好 ,所预测的 3 5个肿瘤抗原HLA A2限制性CTL表位经实验筛选、鉴定后 ,可望用于新型肝癌治疗性多肽疫苗的设计研究 。 展开更多
关键词 抗原 肝细胞肿瘤 肝细胞癌 hla-a2抗原 T淋巴细胞 细胞毒性 表位
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siRNA沉默HLA-A2表达的hMSCs对人异体T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2功能的影响 被引量:4
12
作者 郑仕杰 于洋 +3 位作者 单伟 郑德宇 秦书俭 包翠芬 《解剖科学进展》 CAS 2011年第2期147-150,153,共5页
目的探讨应用siRNA技术下调HLA-A2表达的人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stemcells,hMSCs)对人异体T淋巴细胞分泌功能的调节作用。方法从成人骨髓中分离和培养hMSCs,并且通过免疫细胞化学检测其表面标志;利用人工合成HLA-A2靶向... 目的探讨应用siRNA技术下调HLA-A2表达的人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stemcells,hMSCs)对人异体T淋巴细胞分泌功能的调节作用。方法从成人骨髓中分离和培养hMSCs,并且通过免疫细胞化学检测其表面标志;利用人工合成HLA-A2靶向小分子干扰RNA转染至第3代hMSCs,然后将转染前后的hMSCs,与经植物血凝素(PHA)刺激的人异体T淋巴细胞共同培养。用ELISA分别检测各培养上清液中T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2的水平。结果原代培养3d后,约70%hMSCs贴壁生长,7d后细胞迅速增殖,进入对数生长期,14d左右进入平台期,第3代细胞多呈梭形生长,形态比较均一,hMSCs表面抗原CD44、CD166阳性。HLA-A2靶向小分子干扰RNA转染3天后,可见少量细胞死亡,免疫荧光染色可见细胞核和部分胞浆呈阳性表达。转染HLA-A2靶向小分子干扰RNA的和未转染的hMSCs均能抑制人T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2,转染后的hMSCs抑制作用强于未转染的hMSCs(<0.05)。结论体外沉默HLA-A2基因表达可增强hMSCs抑制PHA刺激人T淋巴细胞分泌因子。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 hla-a2基因 SIRNA干扰 人T淋巴细胞
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HLA-A2表达沉默的MSCs对兔桡骨缺损修复的影响 被引量:1
13
作者 李宁 郑仕杰 +3 位作者 秦书俭 李霞 邓桂 梁届东 《热带医学杂志》 CAS 2013年第7期824-827,F0004,共5页
目的探讨沉默人白细胞抗原-A2(HLA-A2)基因后的骨髓间充质干细胞(MSCs)对兔桡骨缺损修复的影响。方法将HLA-A2沉默后的MSCs经体外诱导成骨后,与羟基磷灰石(HA)复合培养,形成MSCs/HA复合体,并植入骨缺损中。将日本大耳白兔24只分为2组:HL... 目的探讨沉默人白细胞抗原-A2(HLA-A2)基因后的骨髓间充质干细胞(MSCs)对兔桡骨缺损修复的影响。方法将HLA-A2沉默后的MSCs经体外诱导成骨后,与羟基磷灰石(HA)复合培养,形成MSCs/HA复合体,并植入骨缺损中。将日本大耳白兔24只分为2组:HLA-A2沉默后的MSCs/HA复合体修复桡骨缺损为实验组(n=12),自体MSCs/HA复合体修复桡骨缺损为对照组(n=12)。于术后2、4、8周比较两组饮食与伤口的愈合情况、X线检测、HE染色结果,综合评价HLA-A2沉默后的MSCs/HA复合体对桡骨缺损修复的影响。结果实验组和对照组的伤口无明显渗出、红肿,愈合好;X线结果显示,2、4周骨缺损处有纤维骨痂形成,8周骨缺损处密度增高,骨痂形成;两组细胞钙结节数量、X线评分、组织学评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HLA-A2沉默后的MSCs免疫原性低,不影响其成骨能力及骨缺损的愈合,为同种异体骨缺损修复提供了新的依据。 展开更多
关键词 hlaa2表达沉默 骨髓间充质干细胞 骨缺损
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加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定 被引量:1
14
作者 张彩娥 邓云华 +6 位作者 吴雄文 梁智辉 翁秀芳 卢小玲 夏芳珍 钟茂华 陆盛军 《中国皮肤性病学杂志》 CAS 北大核心 2006年第9期519-522,共4页
目的制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体。方法以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体。利用H... 目的制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体。方法以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体。利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Westernblot和ELISA鉴定折叠产物的构象。以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体。结果该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性。结论成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体。 展开更多
关键词 hla-a2 shla-a2/HPV6E7四聚体 尖锐湿疣 细胞毒性T细胞
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通过两步离子交换层析建立保留HLA-A2二聚体构象的纯化方法 被引量:1
15
作者 杨敬 翁秀芳 +1 位作者 梁智辉 吴雄文 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期301-306,311,共7页
目的建立两步离子交换层析纯化方法以获得浓缩的高纯度HLA-A2二聚体。方法收集转染有HLA-A2-IgG1 Fc重组基因的7A2D细胞上清,并进行ELISA和Western blot鉴定7A2D细胞表达的HLA-A2二聚体,检测其浓度;应用SPA亲和层析和两步法离子交换层... 目的建立两步离子交换层析纯化方法以获得浓缩的高纯度HLA-A2二聚体。方法收集转染有HLA-A2-IgG1 Fc重组基因的7A2D细胞上清,并进行ELISA和Western blot鉴定7A2D细胞表达的HLA-A2二聚体,检测其浓度;应用SPA亲和层析和两步法离子交换层析技术分别纯化HLA-A2二聚体,并比较2种方法纯化HLA-A2二聚体的效率。结果7A2D细胞可表达正确构象的HLA-A2二聚体,Western blot检测显示融合蛋白的分子量与预期大小一致,7A2D细胞上清中HLA-A2二聚体的浓度为4.4μg/mL。SPA亲和层析法中pH3.0的洗脱条件使大部分的HLA-A2二聚体发生了变性反应,纯化后构象正确的HLA-A2二聚体纯度为(10.4±1.3)%,回收率仅为(7.3±1.1)%;两步离子交换层析后HLA-A2二聚体纯度为(72.9±4.6)%、回收率为(51.9±6.5)%,均显著高于SPA亲和层析法。结论建立了一种纯化条件相对温和的两步法离子交换层析纯化方法,经过该方法制备获得的高纯度与较高浓度的HLA-A2二聚体可保持正确的空间构象,达到纯化与浓缩的目的。 展开更多
关键词 两步离子交换层析 hla-a2二聚体 纯化方法 空间构象
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人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白表达载体的构建及其表达 被引量:1
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作者 熊敏 杨敬宁 +1 位作者 李青 吴雄文 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期1-4,共4页
目的构建并表达了人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP(scHLA-A2)融合蛋白表达载体,为进一步制备HLA-A2四聚体及其功能研究奠定了基础。方法应用重叠延伸PCR(overlap-PCR)对编码HLA-A2的cDNA序列进行一个碱基的同义突变,并将β2m和HLA-A2胞外... 目的构建并表达了人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP(scHLA-A2)融合蛋白表达载体,为进一步制备HLA-A2四聚体及其功能研究奠定了基础。方法应用重叠延伸PCR(overlap-PCR)对编码HLA-A2的cDNA序列进行一个碱基的同义突变,并将β2m和HLA-A2胞外段亚单位两段编码序列的cDNA通过一疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行前后拼接,并利用引物所带的BSP编码序列,构建单链β2m-HLA-A2-BSP融合基因,将测序正确的β2m-HLA-A2-BSP融合基因插入原核表达载体pET-22b中,转化BL21(DE3)细菌,SDS-PAGE检测其表达,融合蛋白于体外抗原肽存在条件下稀释复性后由Western blot鉴定其空间构象。结果经DNA序列分析表明:同义突变与预期结果一致,β2m和HLA-A2-BSPl、inker的连接顺序、方向及序列完全正确,表达载体转化BL21(DE3)细菌后可表达β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白,SDS-PAGE显示该融合蛋白分子量为45 kD,与理论值一致,将融合蛋白与特异性抗原肽在体外进行稀释复性后经Western blot鉴定表明该复合物能与HLA-Ⅰ类分子特异性结合的单克隆抗体W6/32结合。结论人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白的构建及其表达获得成功,经体外复性可获得HLA-Ⅰ类分子天然构象。 展开更多
关键词 重叠延伸聚合酶链式反应 β2m-hla-a2-BSP融合蛋白 同义突变
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Survivin-△Ex3蛋白HLA-A2.1限制性CTL表位的基因疫苗抗肿瘤效果初探 被引量:1
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作者 陈英利 葛存兴 +5 位作者 刘思岐 张婷婷 隋广宇 曹明月 常亚娟 刘欣宇 《生物医学工程研究》 2014年第2期120-124,共5页
预测并合成survivin-△Ex3 HLA-A2.1限制性CTL表位的基因疫苗,探讨携带表位基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗对小鼠移植肝癌模型的保护作用。将表位基因序列连接,构建pVAX1-STEsEGFP真核表达载体,转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫... 预测并合成survivin-△Ex3 HLA-A2.1限制性CTL表位的基因疫苗,探讨携带表位基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗对小鼠移植肝癌模型的保护作用。将表位基因序列连接,构建pVAX1-STEsEGFP真核表达载体,转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗。实验动物分为未免疫对照组、口服沙门氏菌组、pVAX1质粒转染的减毒鼠伤寒沙门氏菌组;口服pVAX1-Survivin-△3(T34A)–EGFP质粒转染的的减毒鼠伤寒沙门氏菌组和口服pVAX1-STEs–EGFP质粒转染的的减毒鼠伤寒沙门氏菌组。结果表明:在5组肿瘤模型小鼠中,肿瘤瘤块平均直径分别为:15.11±2.43 mm、13.70±2.97 mm、13.05±1.77 mm、7.46±2.61 mm、9.05±2.18 mm;表位疫苗组与其他组相比,有显著性差异(P<0.01)。说明小鼠口服携带survivin-△Ex3 HLA-A2.1限制性CTL表位的基因疫苗后,能抑制小鼠肝癌细胞的增殖和扩散。 展开更多
关键词 survivin-△Ex3 hla-a2 1 限制性 CTL表位 基因疫苗 肝癌
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可溶性HLA-A2-肽组装复合物的研制及初步鉴定
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作者 孟晓静 林来兴妹 +2 位作者 孟民杰 胡志明 王小宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期538-540,共3页
目的:诱导表达HLA-A2的两个亚基-重链(HC)和轻链β2m,并将其纯化产物和特异性肽段结合为HLA-A2-肽复合体。方法:将HC工程菌和β2m工程菌经0.5 mmol/L IPTG诱导5 h。经超声破菌及专利技术处理获得精制包涵体,再复性、 超滤浓缩后,用DEAE ... 目的:诱导表达HLA-A2的两个亚基-重链(HC)和轻链β2m,并将其纯化产物和特异性肽段结合为HLA-A2-肽复合体。方法:将HC工程菌和β2m工程菌经0.5 mmol/L IPTG诱导5 h。经超声破菌及专利技术处理获得精制包涵体,再复性、 超滤浓缩后,用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进行纯化。然后,将HC、β2m与两条特异性肽段分别结合,用Superdex 75凝胶过滤纯化,并用其天然结构的单克隆抗体(mAb)W6/32进行初步鉴定。结果:HC工程菌和β2m工程菌诱导表达的水平分别为43%和47%,HC和β2m纯化后的纯度均达到95%。两条特异性肽段与HC和β2m可组装成HLA-A2-肽复合体,纯化的HLA-A2-肽复合物在4℃可保存2个月左右,并可与mAb W6/32特异性结合。结论:HLA-A2的HC工程菌和轻链β2m工程菌均具有较高的表达水平,与相应的特异性肽段可形成稳定的可溶性HLA-A2-肽复合物,为进一步研究细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的识别和应答奠定了基础。 展开更多
关键词 hlaa2重链HC Β2微球蛋白 hlaa2—肽组装复合体 表达 纯化
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TIL识别的HLA-A2限制性人黑色素瘤特异抗原肽的研究
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作者 葛海良 李美星 +2 位作者 金姝 陈影 张勇 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期924-927,共4页
目的探讨TIL识别的人黑色素瘤HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽特性。方法通过亲和层析柱从三种肿瘤细胞系(624-Mel、Chap-Mel和JY)中纯化HLA-A2蛋白和结合的多肽分子,经弱酸高温处理和离心超滤后,应用反相-高效液相色谱层析(RT-HPLC)分离各多... 目的探讨TIL识别的人黑色素瘤HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽特性。方法通过亲和层析柱从三种肿瘤细胞系(624-Mel、Chap-Mel和JY)中纯化HLA-A2蛋白和结合的多肽分子,经弱酸高温处理和离心超滤后,应用反相-高效液相色谱层析(RT-HPLC)分离各多肽组份,并将其各组份与T2细胞共同孵育、进行重建TIL识别的人黑色素瘤特异表位试验,鉴定肽分子生物活性,通过质谱分析所获活性肽分子特性,参照活性肽序列,制备人工合成肽加以进一步证实。结果从RT-HPLC层析的624-Mel的肽组份,经特异表位鉴定发现3个活性峰(P19、P25和P31)。其中P31,TIL杀伤率达67%,质谱分析表明肽分子量为948,氨基酸序列为H+Ala Lue Trp Lue Phe Phe Gly Val Lue OH-的9肽分子。经特异表位测定表明人工合成肽具有纯化活性肽的生物活性特征。结论分离鉴定的这一9肽分子是一种TIL识别的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽,为肿瘤防治、合成肽疫苗的研究奠定了可靠的实验基础。 展开更多
关键词 TIL hla-a2限制性 肿瘤抗原肽 疫苗
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肝癌相关肿瘤抗原AFP新的HLA-A2/A24限制性CTL表位的预测及分析
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作者 张秀敏 王军伟 +2 位作者 李增山 郭风 隋延仿 《现代肿瘤医学》 CAS 2009年第10期1839-1842,共4页
目的:预测肝癌肿瘤抗原AFP新的HLA-A2/A24限制性CTL表位,为肝癌CTL表位肽的筛选及鉴定提供依据。方法:选择与肝癌密切相关的肿瘤抗原AFP为研究目标,采用NetCTL1.2Server远程预测系统进行HLA-A2/A24限制性CTL表位预测。结果:共预测出与... 目的:预测肝癌肿瘤抗原AFP新的HLA-A2/A24限制性CTL表位,为肝癌CTL表位肽的筛选及鉴定提供依据。方法:选择与肝癌密切相关的肿瘤抗原AFP为研究目标,采用NetCTL1.2Server远程预测系统进行HLA-A2/A24限制性CTL表位预测。结果:共预测出与肝癌相关的肿瘤相关抗原AFP的8个HLA-A2限制性CTL表位,13个HLA-A24限制性CTL表位。结论:应用NetCTL1.2Server法预测CTL表位是一种高效准确的预测方法。所预测的肿瘤抗原AFP的HLA-A2/24限制性CTL表位经实验筛选、鉴定后,可为肝癌治疗性疫苗的制备选择合适的CTL表位提供依据。 展开更多
关键词 甲胎蛋白 hlaa2/a24抗原 细胞毒性T淋巴细胞表位 预测
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