番木瓜畸形花叶病毒HC-Pro蛋白的原核表达与纯化

1

作者 苏蝶 庹德财 +4 位作者 周鹏 言普 黎小瑛 朱国鹏 沈文涛 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2024年第10期3166-3171,共6页

番木瓜畸形花叶病毒(papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV, Potyvirus属)是目前威胁中国番木瓜种植的主要病原之一。辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase, HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒运动、复制、媒介传播、基因沉默... 番木瓜畸形花叶病毒(papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV, Potyvirus属)是目前威胁中国番木瓜种植的主要病原之一。辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase, HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒运动、复制、媒介传播、基因沉默抑制的多功能蛋白。为了获得HC-Pro基因的纯化蛋白,本研究通过密码子优化HC-Pro基因序列,成功构建原核表达质粒p ET-30a-HCPro,经IPTG诱导后实现HC-Pro在大肠杆菌中的原核表达,在0.5 mmol/L IPTG,20℃条件下诱导过夜时其表达量最高;破碎菌体后,SDS分析全菌、破碎上清以及沉淀中目标蛋白的表达量,结果显示重组HC-Pro蛋白主要以不可溶的包涵体形式在沉淀中表达;进一步溶解包涵体通过Ni-NTA层析柱进行纯化,在500 mmol/L浓度咪唑下可以获得分子量大小约为54 kD的HC-Pro重组蛋白;Western Blot分析纯化后的目标蛋白,结果显示54 kD处有明显的条带,与预期的HC-Pro重组蛋白大小一致。本研究成功表达并纯化获得了PLDMV重组蛋白HC-Pro,为后续抗体制备和探究其功能提供了理论基础。 展开更多

关键词 番木瓜畸形花叶病毒 hc-pro 原核表达 纯化

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甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测 被引量：7

2

作者 翟玉山 彭磊 +4 位作者 杨永庆 邓宇晴 程光远 郑艳茹 徐景升 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2016年第1期83-89,共7页

为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO... 为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。 展开更多

关键词 甘蔗条纹花叶病毒 hc-pro P3N-PIPO CP VPG 诱饵载体 酵母双杂交

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马铃薯Y病毒HC-Pro中心区域在病毒协生作用中的主导地位 被引量：4

3

作者 鲁瑞芳 李为民 +2 位作者 王海云 郭明 彭学贤 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期264-268,共5页

利用PCR方法获得了马铃薯病毒中国株系 (PVY C)HC Pro基因的 5个缺失突变体 ,构建了相应的植物表达载体。通过土壤农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导法转化了烟草品种K32 6 (Nicotinatabacumcv.K32 6 )。PCR和Southernblot分析证明... 利用PCR方法获得了马铃薯病毒中国株系 (PVY C)HC Pro基因的 5个缺失突变体 ,构建了相应的植物表达载体。通过土壤农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导法转化了烟草品种K32 6 (Nicotinatabacumcv.K32 6 )。PCR和Southernblot分析证明了HC Pro基因及其缺失突变体已整合到烟草基因组中 ,Westernblot表明它们在转基因烟草中得到了表达。侵染性试验发现HC Pro中心区域介导转基因烟草中PVY C和黄瓜花叶病毒 (CMV)、PVY C和马铃薯X病毒 (PVX)之间的协生作用 ,从而明确了PVY CHC 展开更多

关键词 马铃薯Y病毒 hc-pro基因 突变 中心区域 协生作用

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原核表达的PRSV HC-Pro基因同源dsRNA诱导番木瓜抗性的研究 被引量：3

4

作者 杨国峰 沈文涛 +2 位作者 言普 黎小瑛 周鹏 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1269-1277,共9页

利用番木瓜环斑病毒(PRSV)HC-Pro基因3′端824bp区段,通过OZ-LIC法构建了含有PDK内含子的发夹RNA编码结构,并选用pSP73和M-Jm109LacY分别作为宿主载体和宿主菌,构建了高效的同源dsRNA原核表达工程菌M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-H824,经IPTG... 利用番木瓜环斑病毒(PRSV)HC-Pro基因3′端824bp区段,通过OZ-LIC法构建了含有PDK内含子的发夹RNA编码结构,并选用pSP73和M-Jm109LacY分别作为宿主载体和宿主菌,构建了高效的同源dsRNA原核表达工程菌M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-H824,经IPTG诱导表达的dsRNA不被DNaseI和RNaseA降解,稳定性较好。采用喷洒dsRNA粗制品的方式对番木瓜植株进行保护性处理和治疗性处理,症状观察及ELISA、Real-time RT-PCR分析结果表明,保护性处理能有效诱发对番木瓜环斑病毒的抗性(发病率低,发病时间晚);治疗性处理(植株已接种PRSV 25d)能在处理初期引起番木瓜环斑病毒积累量发生短暂降低。 展开更多

关键词 番木瓜环斑病毒 hc-pro DSRNA 原核表达 RNA沉默

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中国大豆花叶病毒HC-Pro基因的克隆与序列分析 被引量：3

5

作者 刘宁 刘若淼 +2 位作者 马莹 王大刚 智海剑 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期549-554,共6页

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),克隆了我国6个大豆花叶病毒(SMV)分离物的HC-Pro基因全长cDNA,并测定了其全序列,探索其与病毒致病性和交叉保护作用的关系。结果表明:HC-Pro基因全长为1371nt,编码的HC-Pro蛋白为457个氨基酸,其中包... 通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),克隆了我国6个大豆花叶病毒(SMV)分离物的HC-Pro基因全长cDNA,并测定了其全序列,探索其与病毒致病性和交叉保护作用的关系。结果表明:HC-Pro基因全长为1371nt,编码的HC-Pro蛋白为457个氨基酸,其中包含与病毒移动有关的CCC基序、与蚜传相关的PTK基序等功能结构域。6个SMV分离物的HC-Pro基因核苷酸序列同源性为89.2%～99.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为95.4%～99.8%,其中SMV分离物TS216和4434仅有1个碱基差异。将序列信息与6个SMV分离物在10个鉴别寄主上的症状反应以及分离物间的交叉保护作用进行综合分析发现,HC-Pro基因同源性高的SMV分离物在鉴别寄主上的致病性反应没有明显的相似性,而HC-Pro基因同源性高、亲缘关系近的部分SMV分离物之间交叉保护作用明显。结果证明6个SMV分离物的HC-Pro基因高度同源,同源性高低与其在鉴别寄主上的致病性反应没有明显联系,但同源性高、亲缘关系近的分离物间交叉保护作用可能较强。 展开更多

关键词 大豆花叶病毒 hc-pro基因 基因克隆 序列分析

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HC-Pro基因片段介导的高抗TuMV 被引量：2

6

作者 叶艳英 曾钢 +3 位作者 曹鸣庆 马荣才 吴才君 姚磊 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期550-555,共6页

芜菁花叶病毒(turnip mosaic viruses,TuMV)是侵染重要经济作物的主要病毒之一,寄主范围十分广泛,尤其是对十字花科作物的危害最为严重。为了获得对TuMV持久稳定的高度抗性,本研究以TuMV HC-Pro基因的453 bp保守序列为靶标,构建了植物表... 芜菁花叶病毒(turnip mosaic viruses,TuMV)是侵染重要经济作物的主要病毒之一,寄主范围十分广泛,尤其是对十字花科作物的危害最为严重。为了获得对TuMV持久稳定的高度抗性,本研究以TuMV HC-Pro基因的453 bp保守序列为靶标,构建了植物表达RNAi载体pBBBTu-HC-Pro,并转化了TuMV的天然宿主拟南芥。对转基因拟南芥用北京地区流行的TuMV强致病株BJ-C4进行了抗病接种鉴定。鉴定的13个单拷贝转基因株系中有4个对TuMV的BJ-C4株表现出高度抗性,抗性比对照提高约80%以上,且抗性可以稳定遗传。经半定量和荧光定量PCR方法检测,在高抗转基因植株体内几乎检测不到病毒的累积,抗病效果明显。该载体在利用基因工程抗TuMV育种中具有广阔的应用前景。 展开更多

关键词 芜菁花叶病毒 hc-pro 基因片段 RNAI 抗性

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甘蔗转HC-Pro基因的研究 被引量：4

7

作者 郭莺 阮妙鸿 +3 位作者 吴杨 刘佳 杨川毓 张木清 《热带作物学报》 CSCD 2010年第6期965-971,共7页

通过基因枪(PDS-1000He)轰击法将构建好的多功能蛋白HC-Pro的植物表达载体pHCFL与带PMI筛选标记基因的pZMLR14植物表达载体共转化导入易感花叶病甘蔗品种福农95-1702的胚性愈伤组织中,转化的愈伤经甘露糖筛选后获得抗性转化甘蔗幼苗。经... 通过基因枪(PDS-1000He)轰击法将构建好的多功能蛋白HC-Pro的植物表达载体pHCFL与带PMI筛选标记基因的pZMLR14植物表达载体共转化导入易感花叶病甘蔗品种福农95-1702的胚性愈伤组织中,转化的愈伤经甘露糖筛选后获得抗性转化甘蔗幼苗。经PCR检测、氯酚红显色、RT-PCR检测和DNA点杂交分析获得转HC-Pro的转基因植株,转化率为0.8%(HC-Pro基因)、1.7%(PMI基因)和0.4%(HC-Pro基因+PMI基因)。花叶病毒接种实验结果显示,未转基因植株的发病率为75%,而转基因植株均系统性发病,推测由于HC-Pro的大量表达抑制了甘蔗体内自身的RNA沉默机制而使病情加重。其它农艺性状调查结果显示,转基因与未转基因植株之间不存在显著差异,表明转HC-Pro和PMI基因对甘蔗的生长或其他农艺性状没有负面影响。 展开更多

关键词 RNA沉默 RNA沉默抑制子 hc-pro 共转化 PMI

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玉米矮花叶病毒HC-Pro的纯化及抗血清制备 被引量：5

8

作者 李向东 范在丰 +1 位作者 李怀方 裘维蕃 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期135-138,共4页

本实验提纯了玉米矮花叶病毒 ( MDMV)的辅助成份—蛋白酶 ( HC- Pro) ,并制备了其抗血清。MDMV HC- Pro的分子量约为 57k D,提纯产量为 0 .3mg/ 10 0 g病叶。琼脂免疫双扩散测定证明MDMV HC- Pro抗血清的效价为 1∶ 16;微量免疫沉淀法... 本实验提纯了玉米矮花叶病毒 ( MDMV)的辅助成份—蛋白酶 ( HC- Pro) ,并制备了其抗血清。MDMV HC- Pro的分子量约为 57k D,提纯产量为 0 .3mg/ 10 0 g病叶。琼脂免疫双扩散测定证明MDMV HC- Pro抗血清的效价为 1∶ 16;微量免疫沉淀法测定时其效价为 1∶ 10 2 4。该抗血清只与MDMV HC- Pro有明显的反应 ,与健康玉米汁液和 MDMV无反应。MDMV HC- Pro抗血清可以专化性地抑制 HC- Pro的蚜传活性。 展开更多

关键词 玉米 病毒 玉米矮花叶病毒 hc-pro 辅助成份-蛋白酶 蚜虫传毒 纯化 抗血清

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芜菁花叶病毒温州分离物HC-Pro基因序列分析 被引量：3

9

作者 施曼玲 李桂新 陶小荣 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期26-30,共5页

　从浙江温州盘菜上获得芜菁花叶病毒温州分离物（TuMV-WZ）,病毒提纯后,经电镜观察,可发现大量长约700nm的线形粒子。利用免疫捕捉RT-PCR,通过特异性引物对TuMV-WZ的HC-Pro基因进行PCR扩增,经电泳可见1.5kb的特异条带。PCR扩增产物经... 　从浙江温州盘菜上获得芜菁花叶病毒温州分离物（TuMV-WZ）,病毒提纯后,经电镜观察,可发现大量长约700nm的线形粒子。利用免疫捕捉RT-PCR,通过特异性引物对TuMV-WZ的HC-Pro基因进行PCR扩增,经电泳可见1.5kb的特异条带。PCR扩增产物经过纯化后进行序列测定,序列长度为1449个核苷酸,编码482个氨基酸。其核苷酸序列与已报道的TuMV的其他分离物（Canada,UKl和Japanese）同源率分别为83.9％、96.5％和94.0％,氨基酸同源率分别为97.3％、98.8％和99.0％。 展开更多

关键词 温州分离物 序列分析 芜菁花叶病毒 hc-pro基因 盘菜

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MDMV HC-Pro在玉米叶片中的积累及免疫定位 被引量：5

10

作者 李向东 范在丰 +1 位作者 李怀方 裘维蕃 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期310-314,共5页

本文以感病自交系 Mo17、掖 10 7和抗病自交系黄早四为材料 ,研究了玉米矮花叶病毒(MDMV)和 MDMV辅助成份—蛋白酶 (HC- Pro)在叶片中的积累动态和细胞内定位。结果表明 ,在接种后 3d,MDMV就在掖 10 7和 Mo17接种叶的上位叶积累到了相... 本文以感病自交系 Mo17、掖 10 7和抗病自交系黄早四为材料 ,研究了玉米矮花叶病毒(MDMV)和 MDMV辅助成份—蛋白酶 (HC- Pro)在叶片中的积累动态和细胞内定位。结果表明 ,在接种后 3d,MDMV就在掖 10 7和 Mo17接种叶的上位叶积累到了相当高的程度 ,6d后达到高峰 ;而MDMV在黄早四中的浓度一直低于在掖 10 7和 Mo17中的浓度。在接种掖 10 7和 Mo176d后 ,MDMV HC- Pro在上位叶中的积累到达高峰 ,而在黄早四植株中 MDMV HC- Pro直到第 9d才到最高 ,而且浓度一直低于感病自交系掖 10 7和 Mo17。麦二叉蚜从发病植株上获毒后的传毒效率变化与MDMV、MDMV HC- Pro在叶片中的积累动态一致。通过胶体金标记对 MDMV HC- Pro进行免疫定位 ,发现在细胞质中、与质膜相联系的风轮状内含体、片层凝集状内含体、细胞质高密度物质和病毒粒子周围有金标记 ,说明在这些部位有 MDMV HC- Pro的存在。 展开更多

关键词 玉米叶片 辅助成份-蛋白酶 玉米矮花叶病毒 介体 hc-pro 免疫定位

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甘蔗线条花叶病毒HC-Pro基因的分子变异分析 被引量：3

11

作者 贺振 李文凤 +1 位作者 张志想 李世访 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期29-36,共8页

为了解析甘蔗线条花叶病毒Sugarcane streak mosaic virus(SCSMV)不同分离物HC-Pro基因的分子变异规律,本研究利用RT-PCR法扩增获得SCSMV HC-Pro基因的序列,通过生物信息学分析,分别从重组、系统发生、选择压力等方面研究SCSMV HC-Pro... 为了解析甘蔗线条花叶病毒Sugarcane streak mosaic virus(SCSMV)不同分离物HC-Pro基因的分子变异规律,本研究利用RT-PCR法扩增获得SCSMV HC-Pro基因的序列,通过生物信息学分析,分别从重组、系统发生、选择压力等方面研究SCSMV HC-Pro基因的分子变异特征。共测定了44条SCSMV HC-Pro基因序列,相似性最低值为70%;HC-Pro基因重组频率较低,仅发现3个重组位点,其中一个系首次报道;与先前报道相比,部分新测定云南蔗区的SCSMV分离物在HC-Pro基因上形成一个新组-第Ⅲ组;HC-Pro基因处于很强的负选择压力作用,未发现正向选择作用位点。本研究结果进一步证明SCSMV HC-Pro基因具有高度的遗传多样性。 展开更多

关键词 甘蔗线条花叶病毒 hc-pro基因 分子变异

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西瓜花叶病毒HC-Pro基因的克隆与原核表达 被引量：2

12

作者 张建新 刘起丽 吴云锋 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期101-104,共4页

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒（WMV）陕西分离物HC-Pro基因，大小为1371bp．将HC—Pro基因克隆到pMD18-T SimpleVector，测序分析发现与其它国家HC—Pro核苷酸同源性为90．7％～94．8％．将HC—Pro基因定向插入EcoRⅠ／SalⅠ切开的... 利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒（WMV）陕西分离物HC-Pro基因，大小为1371bp．将HC—Pro基因克隆到pMD18-T SimpleVector，测序分析发现与其它国家HC—Pro核苷酸同源性为90．7％～94．8％．将HC—Pro基因定向插入EcoRⅠ／SalⅠ切开的pET30a中，构建了原核表达载体pET30-WHC，转化大肠杆菌BL21．经IPTG诱导2～8h后，成功表达了分子量约为57kD的HC-Pro蛋白．通过不同时间诱导发现，加入IPTG2h后蛋白开始表达，继续诱导到8h后表达量变化不大．以诱导的蛋白为抗原免疫家兔，制备了HC-Pro蛋白的抗血清，ELISA法测其效价为1／6400，Westernblot分析能与HC-Pro发生血清学反应． 展开更多

关键词 西瓜花叶病毒 hc-pro 原核表达 抗血清

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马铃薯Y病毒N株HC-pro基因的序列分析与表达 被引量：2

13

作者 王睿 吴云锋 +3 位作者 郝兴安 付宏岐 杨栋 樊兵 《中国病毒学》 CSCD 2005年第3期320-322,共3页

马铃薯Ｙ病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯Ｙ病毒属(Potyvirus)的典型成员,是烟草、马铃薯和辣椒等茄科作物病毒病的主要病原之一,分布于世界各地.近年烟草上的 PVY在全国范围内特别是陕西、黄淮和东北烟区流行呈上升趋势,且以PVY坏死... 马铃薯Ｙ病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯Ｙ病毒属(Potyvirus)的典型成员,是烟草、马铃薯和辣椒等茄科作物病毒病的主要病原之一,分布于世界各地.近年烟草上的 PVY在全国范围内特别是陕西、黄淮和东北烟区流行呈上升趋势,且以PVY坏死株系（PVY-N)为主,重病田发生率达40%以上,并常与烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒混合侵染,严重影响烟草品质造成巨大的经济损失. 展开更多

关键词 hc-pro基因 马铃薯Y病毒 序列分析 表达

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芜菁花叶病毒两分离物的CP基因及HC-Pro基因的比较 被引量：1

14

作者 施曼玲 周雪平 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期689-693,共5页

芜菁花叶病毒杭州分离物(HZWT)和昆明分离物(YNQC)在7种寄主上的致病性相似.利用IC-RT-PCR对两分离物的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度均为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度均为1... 芜菁花叶病毒杭州分离物(HZWT)和昆明分离物(YNQC)在7种寄主上的致病性相似.利用IC-RT-PCR对两分离物的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度均为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸.两分离物的CP和HC-Pro基因的核苷酸同源率分别为99.3%和94.5%,氨基酸同源率分别为100%和98.7%.HZWT和YNQC的CP基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率为89.2%～99.3%,氨基酸同源率分别为88.5%～99.7%;HC-Pro基因与TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为80.6%～97.0%,氨基酸同源率分别为95.0%～99.6%. 展开更多

关键词 芜菁花叶病毒 hc-pro基因 CP基因 青菜 乌塌菜

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芜菁花叶病毒欧亚分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析 被引量：5

15

作者 施曼玲 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期383-389,共7页

16个芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）欧亚分离物分别来自奥地利、丹麦、德国、匈牙利、尼泊尔和英国6国。利用免疫捕获反转录PCR（Immunocapture RT-PCR，IC-RT-PCR）对16个分离物的HC-Pro（Helper component pro-teinase）... 16个芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）欧亚分离物分别来自奥地利、丹麦、德国、匈牙利、尼泊尔和英国6国。利用免疫捕获反转录PCR（Immunocapture RT-PCR，IC-RT-PCR）对16个分离物的HC-Pro（Helper component pro-teinase）基因进行PCR扩增，扩增产物克隆后进行序列测定，HC-PrD基因序列长度均为1374个核苷酸，编码458个氨基酸。16个分离物的HC—PrD基因核苷酸序列同源性为79．5％～99．8％，所编码的氨基酸同源性为94．1％～99．8％。对16个分离物及GenBank上已报道的其它14个TuMV的HC-Pro基因核苷酸的系统进化树分析表明：在16个TuMV欧亚分离物中，除了来自亚洲的分离物N23属Asian-BR组，其余15个来自欧洲的分离物都属于world-B组，其中分离物H1归属world-wide亚组，另外14个分离物则归属NewWorld亚组。 展开更多

关键词 芜菁花叶病毒 hc-pro基因 序列分析

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HC-Pro 3个参与抑制RNA沉默氨基酸位点的鉴定

16

作者 王洁 刘金亮 +4 位作者 阴筱 高瑞 刘红梅 李向东 刘焕庭 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期267-273,共7页

马铃薯Y病毒属病毒编码的辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是第一个被鉴定的RNA沉默抑制因子。本研究通过定点突变的方法获得了马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)HC-Pro的3个突变体,利用农杆菌共浸润的方法分析了这... 马铃薯Y病毒属病毒编码的辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是第一个被鉴定的RNA沉默抑制因子。本研究通过定点突变的方法获得了马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)HC-Pro的3个突变体,利用农杆菌共浸润的方法分析了这些突变对HC-Pro抑制RNA沉默活性的影响。与野生型HC-Pro处理相比,Phe6、Asn11缺失突变体的处理中绿色荧光减弱,而Ile250-Gly251-Asn252(IGN)基序中的Ile和Gly分别突变为Asp和Glu的处理中观察不到绿色荧光。该结果表明Phe6、Asn11和IGN2503个位点均参与调控HC-Pro的抑制RNA沉默活性。 展开更多

关键词 hc-pro 定点突变 抑制RNA沉默 农杆菌共浸润

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芜菁花叶病毒分离物NBXC的CP和HC-Pro基因克隆与序列分析 被引量：1

17

作者 施曼玲 《科技通报》 2007年第1期41-45,共5页

从浙江宁波雪菜上获得病毒分离物NBXC,病毒提纯后,电镜下可观察到大量长约740 nm的线形粒子。间接ELISA检测结果证实NBXC是芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,TuMV)的分离物。利用IC-RT-PCR对病毒分离物NBXC的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增... 从浙江宁波雪菜上获得病毒分离物NBXC,病毒提纯后,电镜下可观察到大量长约740 nm的线形粒子。间接ELISA检测结果证实NBXC是芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,TuMV)的分离物。利用IC-RT-PCR对病毒分离物NBXC的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,分别得到约0.8 kb和1.4 kb的两条条带,与预期的TuMV CP和HC-Pro基因大小吻合。扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度为1374个核苷酸,编码458个氨基酸。NBXC的CP和HC-Pro基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为90.0%～98.3%和82.2%～96.9%,氨基酸同源率分别为95.8%～99.3%和95.6%～99.3%。从CP和HC-Pro基因核苷酸序列同源性来看,NBXC与TuMV芸薹属分离物有更近的亲缘关系,而与萝卜属分离物亲缘关系较远。 展开更多

关键词 芜菁花叶病毒 hc-pro基因 CP基因 雪菜

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马铃薯Y病毒N株系HC-Pro基因在毕赤酵母中分泌表达与鉴定

18

作者 杨栋 吴云锋 王睿 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期159-163,共5页

以克隆载体pGEMT-PVY-NHC为模板,用PCR方法获得HC-Pro基因,构建表达载体pPIC9K-HC,将重组质粒经SalI单酶切后电转化PachiapichiaGS115菌株,筛选出对G418有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检... 以克隆载体pGEMT-PVY-NHC为模板,用PCR方法获得HC-Pro基因,构建表达载体pPIC9K-HC,将重组质粒经SalI单酶切后电转化PachiapichiaGS115菌株,筛选出对G418有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵液上清,在66kD处有1个特异条带表达,目的条带蛋白占上清液总蛋白的40%。Westernblot鉴定表明,表达蛋白可以和HC抗体发生结合反应。 展开更多

关键词 hc-pro基因 毕赤酵母 表达

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马铃薯Y病毒属病毒HC-Pro蛋白功能研究进展 被引量：5

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作者 赵慧 王道文 《生物工程进展》 CSCD 1999年第6期53-57,共5页

马铃薯Ｙ病毒属病毒基因组编码的ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白（蚜传辅助因子）具有多种功能，在病毒生活史各个环节中起重要作用。ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白具有蛋白酶活性，作为蚜传辅助因子参与病毒蚜传过程，调节病毒在宿主体内的转移，并在病毒复制... 马铃薯Ｙ病毒属病毒基因组编码的ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白（蚜传辅助因子）具有多种功能，在病毒生活史各个环节中起重要作用。ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白具有蛋白酶活性，作为蚜传辅助因子参与病毒蚜传过程，调节病毒在宿主体内的转移，并在病毒复制、宿主症状表达及增强异源病毒复制等方面发挥作用。本文对ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白的既定、预测功能作一综述。深入了解ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白的功能不仅在理论上有助于明确病毒生活周期。 展开更多

关键词 马铃薯Y病毒属 hc-pro蛋白 蛋白酶 病毒 酶活性

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利用GATEWAY^(TM)技术快速构建番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体 被引量：1

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作者 高艳梅 翟金玲 黄惜 《热带作物学报》 CSCD 2009年第4期505-509,共5页

通过RT-PCR扩增番木瓜环斑PRSV病毒HC-pro基因,序列比对结果表明,克隆到的该基因片段与已知的海南或华南地区已克隆的HC-pro基因只有约92%的同源性,说明PRSV病毒具有较大的变异性。为了培育番木瓜转基因抗病植株,利用pWATERGATE载体和GA... 通过RT-PCR扩增番木瓜环斑PRSV病毒HC-pro基因,序列比对结果表明,克隆到的该基因片段与已知的海南或华南地区已克隆的HC-pro基因只有约92%的同源性,说明PRSV病毒具有较大的变异性。为了培育番木瓜转基因抗病植株,利用pWATERGATE载体和GATEWAYTM技术,成功构建了番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体。具体步骤如下:①设计带特异性重组序列attB的HC-pro基因PCR的引物;②利用该引物进行RT-PCR扩增HC-pro基因;③通过BP反应,将扩增得到的HC-pro基因序列插入入门载体pDONR201中;④通过LR反应将HC-pro基因序列从pDONR201重组到目标载体pWATERGATE中,得到PRSVHC-pro基因的RNAi表达载体。 展开更多

关键词 番木瓜环斑病毒 GATEWAYTM技术 RNAI hc-pro基因

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