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非洲猪瘟病毒衣壳五邻体顶点蛋白(H240R)原核表达及免疫原性研究 被引量：1
1
作者 王国强 张怡青 +8 位作者 李果 苏运芳 李玉林 尚立芝 毕胜利 樊志浩 李生涛 张振强 王云龙 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2021年第9期2038-2044,共7页
【目的】原核表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)次要衣壳五邻体顶点蛋白(H240R),并研究其免疫原性。【方法】运用生物信息学软件初步预测分析H240R蛋白的理化性质、二级和三级结构。目的基因序列密码子优化后全基因合... 【目的】原核表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)次要衣壳五邻体顶点蛋白(H240R),并研究其免疫原性。【方法】运用生物信息学软件初步预测分析H240R蛋白的理化性质、二级和三级结构。目的基因序列密码子优化后全基因合成,利用基因重组技术构建重组载体pET28a/H,通过原核系统表达目的蛋白,筛选最优的诱导温度和诱导时间。目的蛋白(包涵体)通过含2M尿素洗涤缓冲液洗涤和亲和层析进行纯化。利用梯度透析对纯化的目的蛋白进行复性,Western和Dot-ELISA鉴定复性的目的蛋白。复性蛋白和佐剂ISA201乳化后免疫小鼠,评价H240R蛋白免疫原性及其在小鼠体内诱导的抗体消长规律。【结果】生物信息学分析显示H240R蛋白分子量约为27 kDa,等电点为9.40,无跨膜结构域,抗原指数较高。成功构建大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET28a/H,在不同温度诱导条件下H240R蛋白均以包涵体形式表达。包涵体蛋白经过洗涤和亲和层析纯化后,纯度达85%以上。大约65%纯化蛋白可通过梯度透析进行复性。Western显示His抗体可以和融合蛋白结合显色,表明目的蛋白表达正确,Dot-ELISA显示阳性血清和复性的目的蛋白反应,表明复性的H240R蛋白具有正确的构象。复性蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠产生抗体,二免后10 d达到平台期,可以稳定持续30 d左右。【结论】ASFV衣壳五邻体顶点蛋白H240R在原核系统中以包涵体形式表达,纯化复性的目的蛋白具有良好的免疫原性,并且可以和阳性血清反应。这些可为进一步研究H240R蛋白的结构和功能,以及ASFV亚单位疫苗研制提供参考和思路。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 衣壳蛋白 五邻体顶点蛋白h240r 包涵体
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非洲猪瘟病毒H240R蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定
2
作者 张宁 丁培阳 +5 位作者 任东娜 陈艺兰 李雪洋 常泽杰 李青梅 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2022年第8期1-6,共6页
为制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)H240R蛋白单克隆抗体,首先构建原核表达质粒pET-29b-H240R,再进行蛋白表达与纯化,随后免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备、间接ELISA方法筛选获得单克隆抗体。结果显示,共获得4株杂交瘤细胞株,腹水效价... 为制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)H240R蛋白单克隆抗体,首先构建原核表达质粒pET-29b-H240R,再进行蛋白表达与纯化,随后免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备、间接ELISA方法筛选获得单克隆抗体。结果显示,共获得4株杂交瘤细胞株,腹水效价均高于1∶40000;亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体(12D6、21G3、8G7)重链亚类为IgG2b,13D2重链亚类为IgG1,轻链亚类均为k。Western blot和Dot blot鉴定结果表明,21G3、13D2株单克隆抗体识别的抗原表位为线性表位,而12D6和8G7识别的是构象表位。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,4株单克隆抗体均能特异性识别HEK293T细胞中表达的H240R蛋白。制备了ASFV H240R蛋白单克隆抗体,为H240R蛋白的表位和功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 h240r蛋白 单克隆抗体
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非洲猪瘟病毒H240R蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：5
3
作者 李佳佳 东梦珂 +5 位作者 郑南南 吴宏举 张昂克 张改平 万博 杜永坤 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2021年第3期101-106,共6页
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的急性、高热、严重出血、致死率极高的动物传染病,给我国养殖业造成严重的经济损失。本研究将非洲猪瘟病毒H240R基因克隆至pET-28a(+)载体中,成功构建了pET-28a(+)-H240R原核表达载体,将重组... 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的急性、高热、严重出血、致死率极高的动物传染病,给我国养殖业造成严重的经济损失。本研究将非洲猪瘟病毒H240R基因克隆至pET-28a(+)载体中,成功构建了pET-28a(+)-H240R原核表达载体,将重组载体转化入BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,成功获得了H240R重组蛋白,将其纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔,分离血清并分析其反应特异性。ELISA检测结果显示,血清抗体效价达到1∶256000。Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明,制备的兔源多克隆抗体能够同时与原核和真核表达的H240R蛋白反应。本研究成功制备针对ASFV H240R蛋白的多克隆抗体,该多克隆抗体具有良好的反应活性及特异性,为建立针对ASFV抗原、抗体的免疫学检测方法提供了新的思路。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 h240r蛋白 原核表达 多克隆抗体
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H240R和MGF505-7R基因缺失非洲猪瘟病毒的构建及其生长特性的初步研究 被引量：2
4
作者 周仕君 宋洁 +3 位作者 李帅 刘佳 李江南 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期423-428,共6页
为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响,本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1000 bp的同源臂,分别克隆至pBS-EGFP及pBS-Mcherry载体中,构建同源臂质粒pBS-GFP-H240R和pBS-Mch... 为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响,本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1000 bp的同源臂,分别克隆至pBS-EGFP及pBS-Mcherry载体中,构建同源臂质粒pBS-GFP-H240R和pBS-Mcherry-MGF505-7R,采用PCR和测序鉴定正确。根据CRISPR/Cas9系统sgRNA设计原则设计分别靶向H240R和MGF505-7R基因的小向导RNA(sgRNA),并克隆至pX330载体中,构建重组质粒pX330-sgH240R和pX330-sgMGF505-7R,经测序鉴定正确后,将线性化的同源臂质粒pBS-GFP-H240R与pX330-sgH240R共转染猪肺泡巨噬细胞(PAM),再以ASFV感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建H240R基因缺失病毒ASFV-ΔH240R;采用上述类似的方式构建MGF505-7R基因缺失病毒ASFV-Δ7R;在ASFV-ΔH240R的基础上,将线性化的同源臂质粒pBS-Mcherry-MGF505-7R与pX330-sgMGF505-7R共转染PAM后,再以ASFV-ΔH240R感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建双基因缺失病毒ASFV-ΔH240R-Δ7R。上述3株基因缺失病毒均采用PCR和测序鉴定正确后,均以MOI 1感染PAM,24 h后于荧光显微镜观察;同时采用红细胞吸附试验测定不同培养时间的病毒载量即半数红细胞吸附量(HAD50),并绘制各病毒的生长曲线。结果显示,ASFV-ΔH240R、ASFV-Δ7R及ASFV-ΔH240R-Δ7R感染的PAM分别出现绿色荧光、红色荧光及红绿色双色荧光,而ASFV-WT感染的细胞无荧光,表明正确构建各基因缺失病毒。生长曲线测定结果显示,ASFV-Δ7R和亲本病毒生长曲线基本一致,ASFV-ΔH240R复制水平显著低于亲本病毒(P<0.001),ASFV-ΔH240R-Δ7R复制水平显著高于ASFV-ΔH240R(P<0.01),但仍低于亲本株。表明MGF505-7R基因与病毒的复制无关,但H240R基因与病毒的复制有关,在ASFV-ΔH240R的基础上缺失MGF505-7R基因则可部分恢复病毒的复制能力。本研究构建了3株基因缺失ASFV并测定其生长曲线,为进一步研究ASFV基因功能提供了数据参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 h240r MGF5050-7R 基因缺失病毒
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非洲猪瘟病毒H240R蛋白拮抗宿主炎症反应信号通路的活化及其作用机制 被引量：7
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作者 ZHOU PING-PING DAI JING-WEN ZHANG KE-HUI 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1352-1352,共1页
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起猪的一种以发热和广泛出血为特征的高度致死性传染病,是养猪业的“头号杀手”。ASFV为一种大的双链DNA病毒,病毒粒子直径为260 nm~300 nm,病毒基因组为170 kb~194 kb,编码超过160种蛋白。A... 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起猪的一种以发热和广泛出血为特征的高度致死性传染病,是养猪业的“头号杀手”。ASFV为一种大的双链DNA病毒,病毒粒子直径为260 nm~300 nm,病毒基因组为170 kb~194 kb,编码超过160种蛋白。ASFV感染的靶细胞主要是巨噬细胞。研究表明,ASFV感染猪巨噬细胞可诱导低水平促炎性细胞因子的表达,然而其分子机制尚不清楚。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 h240r 信号通路 作用机制 炎症反应
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