【背景】家禽卵泡发育具有独特的等级卵泡发育特性,受自分泌、旁分泌、生长因子和多种功能基因的共同调控。颗粒细胞是卵泡内数量最多的功能细胞,颗粒细胞的存活直接决定了卵泡的生长发育和成熟。铁死亡是一种新发现细胞程序性死亡方式...【背景】家禽卵泡发育具有独特的等级卵泡发育特性,受自分泌、旁分泌、生长因子和多种功能基因的共同调控。颗粒细胞是卵泡内数量最多的功能细胞,颗粒细胞的存活直接决定了卵泡的生长发育和成熟。铁死亡是一种新发现细胞程序性死亡方式,与卵泡发育密切相关。泛素特异性肽酶18(ubiquitin specific peptidase 18,USP18)在铁死亡过程中发挥重要的调控作用,但其在蛋鸭卵巢颗粒细胞中的功能尚不清楚。【目的】通过探究USP18在蛋鸭卵泡颗粒细胞铁死亡过程中的分子调控机制,为家禽产蛋性状的遗传改良提供理论基础和分子靶点。【方法】选取300日龄高、低产蛋鸭各4只,采集等级前卵泡组织,实时荧光定量PCR和Western blotting检测高、低产蛋鸭等级前卵泡组织中USP18表达水平;分离等级前颗粒细胞,设计USP18干扰片段并转染卵巢颗粒细胞,采用CCK-8试剂盒、Calcein-AM/PI细胞双染法检测USP18对颗粒细胞活力的影响,活性氧检测试剂盒和酶联免疫吸附法分析USP18对颗粒细胞内氧化应激水平的影响;利用线粒体膜电位试剂盒、脂质过氧化荧光探针、铁离子FerroOrange探针、普鲁士蓝试剂盒检测USP18对颗粒细胞铁死亡的影响;通过免疫荧光、免疫共沉淀和Western blotting分析USP18与谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白间的互作关系及GPX4蛋白表达水平。【结果】高产蛋鸭等级前卵泡组织中USP18表达量显著高于低产蛋鸭(P<0.01);敲降USP18显著降低颗粒细胞活力(P<0.01),抑制颗粒细胞存活(P<0.05),促进ROS积累(P<0.01),提高丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量(P<0.01),抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性(P<0.01);敲降USP18显著提高颗粒细胞内脂质过氧化水平(P<0.05),降低线粒体膜电位(P<0.05),增强线粒体膜通透性(P<0.01),提高细胞内铁离子水平和铁沉积(P<0.01),促进铁死亡抑制因子A长链酰基辅酶A合成酶4(acyl-coA synthetase long chain family member 4,ACSL4)和GPX4表达并抑制铁死亡驱动因子转铁蛋白受体1(transferrin receptor protein 1,TFR1)表达(P<0.01);免疫共沉淀和免疫荧光证实USP18可与GPX4互作;Western blotting和免疫共沉淀结果显示敲降USP18提高GPX4泛素化水平并促进GPX4蛋白降解。【结论】USP18在高产蛋鸭等级前卵泡组织中高表达;敲降USP18显著提高了蛋鸭卵巢颗粒细胞内氧化应激水平并诱发铁死亡;USP18可与GPX4蛋白发生互作,敲降USP18提高GPX4泛素化水平并促进GPX4蛋白降解。综上所述,USP18通过抑制GPX4泛素化降解调控蛋鸭卵巢颗粒细胞铁死亡。展开更多
文摘【背景】家禽卵泡发育具有独特的等级卵泡发育特性,受自分泌、旁分泌、生长因子和多种功能基因的共同调控。颗粒细胞是卵泡内数量最多的功能细胞,颗粒细胞的存活直接决定了卵泡的生长发育和成熟。铁死亡是一种新发现细胞程序性死亡方式,与卵泡发育密切相关。泛素特异性肽酶18(ubiquitin specific peptidase 18,USP18)在铁死亡过程中发挥重要的调控作用,但其在蛋鸭卵巢颗粒细胞中的功能尚不清楚。【目的】通过探究USP18在蛋鸭卵泡颗粒细胞铁死亡过程中的分子调控机制,为家禽产蛋性状的遗传改良提供理论基础和分子靶点。【方法】选取300日龄高、低产蛋鸭各4只,采集等级前卵泡组织,实时荧光定量PCR和Western blotting检测高、低产蛋鸭等级前卵泡组织中USP18表达水平;分离等级前颗粒细胞,设计USP18干扰片段并转染卵巢颗粒细胞,采用CCK-8试剂盒、Calcein-AM/PI细胞双染法检测USP18对颗粒细胞活力的影响,活性氧检测试剂盒和酶联免疫吸附法分析USP18对颗粒细胞内氧化应激水平的影响;利用线粒体膜电位试剂盒、脂质过氧化荧光探针、铁离子FerroOrange探针、普鲁士蓝试剂盒检测USP18对颗粒细胞铁死亡的影响;通过免疫荧光、免疫共沉淀和Western blotting分析USP18与谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白间的互作关系及GPX4蛋白表达水平。【结果】高产蛋鸭等级前卵泡组织中USP18表达量显著高于低产蛋鸭(P<0.01);敲降USP18显著降低颗粒细胞活力(P<0.01),抑制颗粒细胞存活(P<0.05),促进ROS积累(P<0.01),提高丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量(P<0.01),抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性(P<0.01);敲降USP18显著提高颗粒细胞内脂质过氧化水平(P<0.05),降低线粒体膜电位(P<0.05),增强线粒体膜通透性(P<0.01),提高细胞内铁离子水平和铁沉积(P<0.01),促进铁死亡抑制因子A长链酰基辅酶A合成酶4(acyl-coA synthetase long chain family member 4,ACSL4)和GPX4表达并抑制铁死亡驱动因子转铁蛋白受体1(transferrin receptor protein 1,TFR1)表达(P<0.01);免疫共沉淀和免疫荧光证实USP18可与GPX4互作;Western blotting和免疫共沉淀结果显示敲降USP18提高GPX4泛素化水平并促进GPX4蛋白降解。【结论】USP18在高产蛋鸭等级前卵泡组织中高表达;敲降USP18显著提高了蛋鸭卵巢颗粒细胞内氧化应激水平并诱发铁死亡;USP18可与GPX4蛋白发生互作,敲降USP18提高GPX4泛素化水平并促进GPX4蛋白降解。综上所述,USP18通过抑制GPX4泛素化降解调控蛋鸭卵巢颗粒细胞铁死亡。
