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靶向敲除棉花GhAGL16高效sgRNA的筛选
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作者 雷建峰 尤扬子 +5 位作者 张锦恩 代培红 于莉 杜正阳 李月 刘晓东 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1023-1033,共11页
【目的】AGL16是棉花MADS-box基因家族中一个重要的转录负调控因子,在抵御干旱和盐胁迫过程中发挥着重要作用。利用病毒介导的基因编辑技术(virus-induced gene editing,VIGE)筛选靶向敲除棉花GhAGL16的sgRNAs,并验证这些sgRNAs的特异性... 【目的】AGL16是棉花MADS-box基因家族中一个重要的转录负调控因子,在抵御干旱和盐胁迫过程中发挥着重要作用。利用病毒介导的基因编辑技术(virus-induced gene editing,VIGE)筛选靶向敲除棉花GhAGL16的sgRNAs,并验证这些sgRNAs的特异性,为定向创制棉花agl16突变体奠定重要基础。【方法】根据在棉花YZ-1中A亚组和D亚组上实际克隆GhAGL16的基因组序列,预测了3个能靶向敲除GhAGL16的sgRNAs;基于棉花叶皱缩病毒(cotton leaf crumple virus,CLCrV)介导的VIGE系统,构建3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体;利用qPCR检测Cas9超表达(Cas9 over-expression,Cas9-OE)植株中Cas9的表达量,确定Cas9是否稳定遗传表达;将3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体分别转化Cas9-OE棉花子叶,并通过PCR/RE方法检测3个靶点的突变情况;利用生物信息学方法分析3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构;对突变植株进行Hi-TOM高通量测序,明确基因编辑效率。同时,对转化GhAGL16-sgRNA2的突变植株进行脱靶率鉴定,检测基因编辑的特异性。【结果】成功构建了3个能同时靶向敲除GhAGL16-A亚组和GhAGL16-D亚组序列的sgRNAs。对不同Cas9-OE植株中Cas9表达量检测结果表明,Cas9在不同Cas9-OE棉株中稳定表达。用3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体转化Cas9-OE棉花子叶,PCR/RE突变检测结果表明,GhAGL16-sgRNA2可有效用于GhAGL16的靶向敲除,在棉花A亚组和D亚组靶位点上出现了不同碱基缺失的突变类型,而GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3是2个无效sgRNA。3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构分析结果表明,GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3可能存在引导序列容易与其他序列发生配对并且不易解链的现象,干扰了引导序列对目标位点的识别,导致sgRNA无效。进一步量化GhAGL16-sgRNA2对GhAGL16的编辑效率,对每一株转化CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA2的Cas9-OE植株突变检测结果表明,在转化的9株Cas9-OE植株中有6株发生了突变,突变效率为66.67%。此外,Hi-TOM高通量测序结果表明,GhAGL16-sgRNA2对GhAGL16的编辑效率为13.69%—54.42%。脱靶率鉴定结果表明,预测的4个潜在脱靶位点都没有发现脱靶现象,说明GhAGL16-sgRNA2不仅具有高效的基因编辑效率,而且具有专一的基因编辑特异性。【结论】利用CLCrV介导的VIGE系统转化Cas9-OE棉花筛选获得1个能高效敲除GhAGL16的sgRNA,为定向创制棉花agl16突变体提供了理想的sgRNA。 展开更多
关键词 棉花 ghagl16 sgRNA 突变体 VIGE 脱靶
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