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不同碳源下毕赤酵母GS115蛋白组学分析 被引量：11
1
作者 田小梅 任建洪 房聪 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期21-29,共9页
毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染问题;并能够对目的蛋白进行类似于高等真核生物的信... 毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染问题;并能够对目的蛋白进行类似于高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等蛋白翻译后加工。但是不论是胞内表达或是分泌表达,大多数外源蛋白均面临着被降解的问题,这也是影响目的蛋白表达量的一个重要因素,同时还增加了纯化目的蛋白的难度。目的:研究毕赤酵母GS115在不同碳源培养过程中胞内外蛋白质组学的差异,指导毕赤酵母表达系统的优化。方法:利用LC-ESI-MS/MS方法分析了不同碳源的四种培养基中毕赤酵母GS115的胞内和胞外蛋白种类,利用Griffin等的计算方法计算各个蛋白的含量。结果:利用LC-ESI-MS/MS结合Griffin等的归一化非标定量法SIN得到GS115胞内胞外详尽的蛋白质种类及准确百分比含量。结论:分析不同培养基之间蛋白质组成的差异,从而为以后构建新的毕赤酵母表达体系,为外源蛋白表达系统的优化提供一定的指导意义。 展开更多
关键词 毕赤酵母(Pichia pastoris)gs115 不同碳源培养基 LC-ESI-MS/MS 蛋白质组 表达 优化
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CTLA4胞外区蛋白在GS115酵母中的表达和活性鉴定 被引量：3
2
作者 朱瑾 吴军 +4 位作者 易绍萱 陈希炜 郑峻松 罗高兴 张宁 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期575-577,共3页
目的　获取具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白。方法　构建CTLA4胞外区 (CTLA412 5)蛋白的酵母表达载体 ,在GS115酵母细胞中表达。通过硫酸铵粗分离和离子交换层析等 ,获取纯化的目的蛋白 ,并在CTLL2细胞中鉴定活性。结果　质粒在GS115... 目的　获取具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白。方法　构建CTLA4胞外区 (CTLA412 5)蛋白的酵母表达载体 ,在GS115酵母细胞中表达。通过硫酸铵粗分离和离子交换层析等 ,获取纯化的目的蛋白 ,并在CTLL2细胞中鉴定活性。结果　质粒在GS115酵母中可较高水平地表达CTLA4胞外区蛋白。经纯化后的蛋白可抑制IL 2刺激的CTLL2细胞的增殖。结论　GS115酵母可高效表达具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白。 展开更多
关键词 CTLA4胞外区蛋白 gs115酵母 表达 活性 鉴定
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黑曲霉果胶裂解酶基因在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中的表达 被引量：6
3
作者 强慧妮 杨欣伟 +6 位作者 田宝玉 柯崇榕 林伟铃 吕睿瑞 黄薇 王春香 黄建忠 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1962-1968,共7页
利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发... 利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达. 展开更多
关键词 黑曲霉 果胶裂解酶 毕赤酵母 表达
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巴斯德毕赤酵母GS115基因组研究进展 被引量：2
4
作者 王永刚 马雪青 +3 位作者 王倩 周贤婧 赵虎彪 马建忠 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期379-381,385,共4页
毕赤酵母生物表达系统已成功地表达了多种重组外源活性蛋白,广泛地被应用于能源、医疗、科学研究等方面的研究。综述了2008年以来毕赤酵母GS115基因组研究,以期从分子水平解释转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理,进而解决毕赤酵母发... 毕赤酵母生物表达系统已成功地表达了多种重组外源活性蛋白,广泛地被应用于能源、医疗、科学研究等方面的研究。综述了2008年以来毕赤酵母GS115基因组研究,以期从分子水平解释转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理,进而解决毕赤酵母发酵过程中产量低、过糖基化等瓶颈。 展开更多
关键词 毕赤酵母gs115 基因组 进展
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鸡PrP基因真核表达载体的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达 被引量：1
5
作者 张天亮 吴润 +5 位作者 杨润霞 魏姣 万学瑞 刘霞 刘磊 张小丽 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期734-739,共6页
为构建鸡PrP基因的真核表达载体,并通过毕赤酵母表达系统获得鸡朊蛋白（ChPrP）,根据毕赤酵母GS115的密码子偏好性、G＋C含量等特点对目的基因PrP（25～248）进行密码子优化与基因合成,同时以特异性引物扩增获得天然未经密码子优化的目... 为构建鸡PrP基因的真核表达载体,并通过毕赤酵母表达系统获得鸡朊蛋白（ChPrP）,根据毕赤酵母GS115的密码子偏好性、G＋C含量等特点对目的基因PrP（25～248）进行密码子优化与基因合成,同时以特异性引物扩增获得天然未经密码子优化的目的片段,之后将两种目的片段分别连接于pPIC9K表达载体并转化至毕赤酵母GS115中,经PCR,选择培养基MM、MD方法鉴定表型后以甲醇进行诱导获得目的蛋白,最后以SDS-PAGE检测蛋白表达。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,成功构建了真核表达重组载体pPIC9K-PrP（25～248）,并在毕赤酵母GS115中获得鸡朊蛋白,其与未经密码子优化的目的蛋白相比,具有更高的表达量。本研究通过毕赤酵母表达系统成功获得了鸡朊蛋白,为后续研究奠定了基础,也通过密码子优化前后蛋白表达量比对,再一次证实毕赤酵母具有较高的密码子偏好性。 展开更多
关键词 鸡朊蛋白 PPIC9K 毕赤酵母gs115 真核表达
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毕氏酵母KM71和GS115发酵工艺的比较 被引量：4
6
作者 张维延 江阳 +4 位作者 许志祥 时宏珍 李新燕 强亦忠 张学光 《苏州医学院学报》 2001年第3期268-270,共3页
目的　探讨毕氏酵母菌KM71和GS1 1 5表达人可溶性FLt3配体、CD40L、IL - 1 3、IL -1 1及TNFα等外源蛋白的发酵工艺。方法　挑取KM71或GS1 1 5单个菌落在BMGY培养基中初步培养 ,在其A60 0 值达 2～ 6时 ,转入发酵罐中行高密度发酵。结果... 目的　探讨毕氏酵母菌KM71和GS1 1 5表达人可溶性FLt3配体、CD40L、IL - 1 3、IL -1 1及TNFα等外源蛋白的发酵工艺。方法　挑取KM71或GS1 1 5单个菌落在BMGY培养基中初步培养 ,在其A60 0 值达 2～ 6时 ,转入发酵罐中行高密度发酵。结果　KM71诱导表达时 ,对甲醇的需求较低 ,故添加甲醇速度应较慢 ,并应提高菌的接种浓度 ;而GS1 1 5菌株生长速度较快 ,代谢甲醇的能力较强 ,表达量相对较高。结论　KM71和GS1 1 5可用于不同性质外源蛋白的表达 ,表达量较高 ,是一种理想的表达系统。 展开更多
关键词 毕氏酵母 高密度发酵 蛋白质表达 KM71 gs115
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嗜热菌Geobacillus Kaustophilus HTA426磷酸三酯酶在毕赤酵母GS115中的表达
7
作者 詹冬玲 林禹欣 +1 位作者 任玉雪 刘洋 《吉林化工学院学报》 CAS 2013年第11期17-21,共5页
将嗜热菌Geobacillus Kaustophilus HTA426中的磷酸三酯酶基因转入毕赤酵母GS115中,整合到染色体DNA基因组上,并进行诱导表达.SDS-PAGE和Western-blot试验结果显示,重组蛋白是一个分子量约为50KD的磷酸三酯酶二聚体.酶活检测证明重组蛋... 将嗜热菌Geobacillus Kaustophilus HTA426中的磷酸三酯酶基因转入毕赤酵母GS115中,整合到染色体DNA基因组上,并进行诱导表达.SDS-PAGE和Western-blot试验结果显示,重组蛋白是一个分子量约为50KD的磷酸三酯酶二聚体.酶活检测证明重组蛋白具有较高的磷酸三酯酶活性,其最适温度为70℃,最适pH为10.0. 展开更多
关键词 嗜热菌 磷酸三酯酶 毕赤酵母gs115 表达
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汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达
8
作者 侯佩强 祝庆余 +3 位作者 吴劲松 艾宪淮 楚贻康 石长胜 《泰山医学院学报》 CAS 2002年第4期359-361,共3页
目的　研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法　采用RT PCR扩增G2基因 ,转化感受态大肠杆菌DH5α,DNA序列分析后 ,SnaBI、NotI两次酶切下G2 ,再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上 ,构建表达载体 pPIC... 目的　研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法　采用RT PCR扩增G2基因 ,转化感受态大肠杆菌DH5α,DNA序列分析后 ,SnaBI、NotI两次酶切下G2 ,再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上 ,构建表达载体 pPIC9K G2 ,SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115 ,G418筛选转化子 ,1%甲醇诱导、摇瓶培养。结果　序列分析表明 ,克隆序列与设计相符 ,12 %SDS PAGE显示重组蛋白为5 0KD ,Western Blot证实其生物学活性。 展开更多
关键词 汉坦病毒 G2膜蛋白基因 毕赤酵母 gs115 表达 载体 基因表达 肾综合征出血热
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毕赤酵母GS115中N-乙酰转移酶在大肠杆菌中的克隆表达与性质研究
9
作者 朱海峰 吴丹 吴敬 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期179-185,共7页
为了研究P.pastoris Mpr1的生理特性,在E.coli JM109胞内中成功表达来源于P.pastoris GS115的Mpr1酶,并利用响应面分析法对诱导温度、IPTG诱导浓度、起始诱导OD进行发酵优化,酶活达到(610.3±9.5)m U/m L。酶学性质显示,Mpr1酶的最... 为了研究P.pastoris Mpr1的生理特性,在E.coli JM109胞内中成功表达来源于P.pastoris GS115的Mpr1酶,并利用响应面分析法对诱导温度、IPTG诱导浓度、起始诱导OD进行发酵优化,酶活达到(610.3±9.5)m U/m L。酶学性质显示,Mpr1酶的最适反应p H范围为7.0-7.5,最适反应温度是30℃。通过分析重组表达Mpr1菌株和对照菌株的培养过程,显示重组菌株的生长能力显著增强,原因是Mpr1降低了细胞内的ROS水平。 展开更多
关键词 N-乙酰转移酶 大肠杆菌 毕赤酵母gs115 响应面分析法 发酵优化
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酸性植酸酶phyB在毕赤酵母GS115中的表达
10
作者 唐升斌 矫庆华 谢达平 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期602-606,共5页
通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析... 通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析,该重组蛋白的相对分子质量为7.5×104,而该植酸酶在大肠杆菌DH5α表达系统中表达的相对分子质量为6.0×104,这可能是由于糖基化的结果.酶学性质检测发现,表达的植酸酶最适作用温度为65℃,比野生原始菌株的提高了10℃;诱导pH值为5.5时,蛋白的表达量最高,为10 528.6 U/mL,是野生菌株的2.8倍;最适作用pH值为2.5;在70℃条件下处理60 min,该酶的相对酶活力为40%,在75℃时处理10 min,该酶的相对酶活力为10%. 展开更多
关键词 酸性植酸酶phyB pPIC9K质粒 毕赤酵母gs115
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人线粒体DNA聚合酶γ表达纯化及活性分析
11
作者 盛彦敏 肖丽娟 +4 位作者 杨亚兰 刘禹佳 齐英 沈鑫 李庆奇 《长春中医药大学学报》 2024年第12期1342-1346,共5页
目的表达纯化人线粒体DNA聚合酶γ(Polγ),并分析其活性,以应用于核苷(酸)类抗病毒药的毒副作用检测与筛选。方法以质粒PCMV-SPORT6-POLG为模板,PCR扩增人线粒体DNA聚合酶γ基因(POLG),并克隆至pPIC9K载体中,构建高效表达载体pPIC9K-PO... 目的表达纯化人线粒体DNA聚合酶γ(Polγ),并分析其活性,以应用于核苷(酸)类抗病毒药的毒副作用检测与筛选。方法以质粒PCMV-SPORT6-POLG为模板,PCR扩增人线粒体DNA聚合酶γ基因(POLG),并克隆至pPIC9K载体中,构建高效表达载体pPIC9K-POLG,重组表达载体经酶切线性化后采用电击转化法转化GS115毕赤酵母细胞,30℃1%甲醇诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE和Western Blot鉴定和纯化,并利用掺入法对比商品Polγ酶分析其活性。结果PCR扩增的POLG基因大小约3.7 kb,测序分析结果与Gen Bank中公布的序列一致,表达的Polγ重组蛋白为可溶性蛋白,其分子量约为138 KD,重组Polγ酶具有比商品酶略低的活性。结论构建了重组高效表达载体pPIC9K-POLG,成功在酵母细胞中表达了重组Polγ酶,建立了Polγ酶的体外真核表达体系。重组酶活力约为8U·µL-1,可应用于核苷(酸)类抗病毒药物的筛选和检测。 展开更多
关键词 人线粒体DNA聚合酶γ gs115毕赤酵母 表达纯化 活性分析
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高山被孢霉Δ5脱饱和酶基因的分离与验证 被引量：4
12
作者 朱敏 刘智 +2 位作者 余龙江 朱路 程华 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第9期986-992,共7页
花生四烯酸(arachidonicacid)是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6(Mortierellaalpi... 花生四烯酸(arachidonicacid)是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6(Mortierellaalpina)中通过RT-PCR分离了可能的编码Δ5脱饱和酶完整的cDNA,其大小为1366bp,编码446个氨基酸。推导出的蛋白质含有Δ5脂酰脱饱和酶中保守的特征性结构域,包括该蛋白质N端典型的细胞色素b5结构域,以及3个保守的组氨酸盒。为验证该蛋白质的功能,将该基因片段克隆到穿梭表达载体pPIC9K中,获得的重组载体pPIC9K-D5通过电转化法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,利用G418耐受度筛选出高拷贝数的酵母转化子,在加入外源底物二高-γ-亚麻酸时,利用甲醇诱导酵母转化子表达外源基因。酵母转化子的油脂的气相色谱图谱中出现了一个花生四烯酸的特征峰,进一步对该峰进行气质联谱(GC-MS)分析,证实该峰是花生四烯酸。研究结果表明,从高山被孢霉M6中分离出Δ5脱饱和酶基因。 展开更多
关键词 花生四烯酸 高山被孢霉 △D5脱饱和酶基因 巴斯德毕赤酵母gs115
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超耐热酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母细胞中的表达 被引量：30
13
作者 郭建强 李运敏 +2 位作者 岳丽丽 邱阳生 矫庆华 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期237-242,共6页
用PCR方法扩增来源于极端嗜热厌氧古菌Pyrococcus furiosus中的超耐热酸性α-淀粉酶的结构基因，将该结构基因引入载体pPIC9K中，将重组质粒pPIC9K—Amy转化大肠杆菌DH5α细胞，测序结果表明，克隆到的α-淀粉酶结构基因为1305bp，其编... 用PCR方法扩增来源于极端嗜热厌氧古菌Pyrococcus furiosus中的超耐热酸性α-淀粉酶的结构基因，将该结构基因引入载体pPIC9K中，将重组质粒pPIC9K—Amy转化大肠杆菌DH5α细胞，测序结果表明，克隆到的α-淀粉酶结构基因为1305bp，其编码的成熟肽为435个氨基酸。将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母GS115细胞，得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下，超耐热酸性α-淀粉酶在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外，该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导，随着诱导培养时间的增加，在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升，在诱导培养7d后酶活力达到最大值。该酶最适反应温度为90-100℃，最适反应pH值为4．5—5．5。该酶具有非常好的温度稳定性，在100℃条件下热处理5h。仍具有60％以上的酶活力。该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。 展开更多
关键词 超耐热酸性α-淀粉酶 激烈热球菌Pyrococcus furiosus pPIC9K质粒 毕赤酵母gs115
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合成嗜热酸性淀粉酶的毕赤酵母表达 被引量：3
14
作者 柯涛 熊蓝 +4 位作者 张乃群 马向东 惠丰立 牛秋红 杨果 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期30-35,共6页
把密码子优化后的超耐热酸性α-淀粉酶的基因BD5088,引入载体pPIC9K中,将正确构建的重组质粒pPIC9K-BD5088转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,重组超耐热酸性α-淀粉酶PrBD5... 把密码子优化后的超耐热酸性α-淀粉酶的基因BD5088,引入载体pPIC9K中,将正确构建的重组质粒pPIC9K-BD5088转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,重组超耐热酸性α-淀粉酶PrBD5088在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外。该酶受甲醇的严格调控和诱导,在诱导培养5 d后酶活力达到最大值,表达量可达到约200 mg/L。与原核表达产物ErBD5088相比,PrBD5088的酶学性质发生了一定的改变。其最适反应温度由80℃增加到90℃。最适反应pH值仍为pH5.6,但范围更宽,在pH值5.0～6.5之间,其相对酶活在90%以上,在pH4.0～8.0范围内酶活性保留50%以上。而ErBD5088则只在pH5.0～7.0范围内能维持活性的50%以上。且PrBD5088的温度稳定性远高于ErBD5088。PrBD5088在100℃条件下热处理1 h仍具有80%以上的酶活力,而ErBD5088相同条件下的半衰期只有20 min。此外,Ca2+和Zn2+对维持rBD5088活性和稳定性会产生轻微促进作用,该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。SDS-PAGE测得该酶的分子量为56 ku,高于原核表达的酶蛋白。重组α-淀粉酶PrBD5088不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象。本实验结果表明O-连接糖基化可适当提高PrBD5088的热稳定性、最适温度和酸性pH条件下酶活性。 展开更多
关键词 超耐热酸性α-淀粉酶 THERMOCOCCUS sp. 糖基化 密码子优化 毕赤酵母gs115
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毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白 被引量：4
15
作者 孙怡 徐梅倩 +1 位作者 高兴春 何国声 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期296-299,共4页
建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（Hypodermotin A，HA）的技术，并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上，构建了重组转移质粒pPIC9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后，用组氨酸缺陷培养基和G... 建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（Hypodermotin A，HA）的技术，并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上，构建了重组转移质粒pPIC9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后，用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0．5％甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白，培养3d后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测，所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western—blotting表明，该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示，该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明，甲醇浓度在0．5％～1％、溶氧量在70％以上、诱导2～3d的情况下表达产量最高，达1500mg／L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆痛疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。 展开更多
关键词 皮蝇素A 毕赤酵母gs115 表达 优化 质粒pPIC9k
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黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在毕赤酵母中的高效表达 被引量：3
16
作者 王丹丹 周晨妍 +5 位作者 李同彪 张振群 王亚杰 梁真真 张青 路丹荣 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期200-203,280,共5页
将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2（成熟肽碱基）插入表达载体p PIC9K中,SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经MD平板、G418梯度和摇瓶复筛筛选出多克隆阳性转化子。选择28h的种子,每隔24h补加1.5%的甲醇,发酵96h后,比酶活可达13210... 将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2（成熟肽碱基）插入表达载体p PIC9K中,SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经MD平板、G418梯度和摇瓶复筛筛选出多克隆阳性转化子。选择28h的种子,每隔24h补加1.5%的甲醇,发酵96h后,比酶活可达13210U/mg;SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为23.0ku;重组酶最适作用温度为45℃,最适作用p H为5.0,在温度35--40℃、p H5--7条件下有良好的稳定性,Ca2＋对酶的激活作用最明显。 展开更多
关键词 黑曲霉 木聚糖酶 毕赤酵母gs115 诱导表达
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黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达 被引量：7
17
作者 朱龙宝 汤斌 +4 位作者 陶玉贵 葛飞 魏胜华 陈涛 李婉珍 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期973-977,共5页
为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体... 为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl。经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌。用终体积分数1%的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90 000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致。酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高。 展开更多
关键词 黑曲霉 Β-葡萄糖苷酶 毕赤酵母 基因克隆 分泌表达
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构建铜锌超氧化物歧化酶毕赤酵母转化子及其高表达分析 被引量：3
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作者 迟春萍 隋红 +4 位作者 刘畅 时成波 王艳芳 郭立君 李校堃 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1763-1768,共6页
设计铜锌超氧化物歧化酶酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的铜锌超氧化物歧化酶基因真核表达载体;通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot... 设计铜锌超氧化物歧化酶酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的铜锌超氧化物歧化酶基因真核表达载体;通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,高拷贝基因比低拷贝高2～8倍,表达活性高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,相对分子质量为40 000左右,低糖基化,均为分泌表达。West-ern blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0,30℃,1.5%甲醇诱导浓度诱导72h上清的目的蛋白表达最好。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定。本研究为中试工艺研究奠定了基础。 展开更多
关键词 毕赤酵母gs115 Cu Zn-SOD 电转化法 高拷贝 真核表达
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重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂发酵条件优化 被引量：3
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作者 李晓红 柳倩 +1 位作者 王蓓 梅晓宏 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期160-165,169,共7页
在获得含高拷贝猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂基因的重组菌株GS115基础上,通过分析甘油加入量、甲醇添加量、山梨醇与甲醇添加比例、诱导初始p H、诱导时间、培养基类型对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kw PMEI1)表达量的影响,优化了摇瓶发酵条... 在获得含高拷贝猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂基因的重组菌株GS115基础上,通过分析甘油加入量、甲醇添加量、山梨醇与甲醇添加比例、诱导初始p H、诱导时间、培养基类型对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kw PMEI1)表达量的影响,优化了摇瓶发酵条件。结果表明:甘油加入量3%(v/v)、甲醇添加量1%(v/v)、山梨醇溶液(100%,w/v)和甲醇(分析纯)以体积比为1∶1的比例添加、p H5.5、在BMMY培养基中诱导表达5 d为最佳条件。该重组蛋白kw PMEI1的表达量最高可达700.302 mg/L。 展开更多
关键词 果胶甲酯酶抑制剂 毕赤酵母gs115 发酵条件 优化
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无指盘臭蛙皮肤抗菌肽Odorgrin A真核表达载体的构建与转化 被引量：2
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作者 田汶佳 刘炯宇 江建平 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期222-227,共6页
根据无指盘臭蛙(Odorrana grahami)皮肤抗菌肽Odorgrin A的氨基酸序列,合成了以酵母偏爱密码子编码的Odorgrin A基因片段.目的片段从合成质粒上用XhoΙ和EcoRΙ双酶切下后,与经同样限制酶酶切的pPIC9K载体连接而成表达载体pPIC9K-Odo A.... 根据无指盘臭蛙(Odorrana grahami)皮肤抗菌肽Odorgrin A的氨基酸序列,合成了以酵母偏爱密码子编码的Odorgrin A基因片段.目的片段从合成质粒上用XhoΙ和EcoRΙ双酶切下后,与经同样限制酶酶切的pPIC9K载体连接而成表达载体pPIC9K-Odo A.PCR扩增、酶切及测序检测的结果表明表达载体构建成功.线性化的pPIC9K-OdoA经电击法转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115宿主菌,营养缺陷型筛选、遗传霉素抗性筛选、PCR扩增和测序检测的结果表明,表达载体pPIC9K-Odo A成功地转化并整合入酵母基因组.用甲醇对具遗传霉素G418高抗性的Odorgrin A重组酵母菌进行诱导表达,取酵母发酵液上清经SDS-PAGE电泳检测,结果初步表明,整合进酵母基因组的抗菌肽Odorgrin A基因已获得分泌表达,表达产物相对分子质量为3×103～4×103,与理论值相近. 展开更多
关键词 抗菌肽 Odorgrin A PPIC9K 毕赤酵母gs115 转化 无指盘臭蛙
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