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16S rRNA基因联合gyrB、grpE、recA基因对鸡源鲍氏志贺菌hn03株进行分子起源分析 被引量:3
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作者 杨霞 陈陆 +5 位作者 赵军 王新卫 常洪涛 刘红英 姚慧霞 王川庆 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期983-989,共7页
为了从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌,分别根据GenBank中登陆的相应序列针对16S rRNA、gyrB、grpE、re-cA 4基因设计4对引物,用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌4基因的部分片段并进行了克隆测序。将所获序列与Gen-Bank中同源性较高的相关序列相比... 为了从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌,分别根据GenBank中登陆的相应序列针对16S rRNA、gyrB、grpE、re-cA 4基因设计4对引物,用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌4基因的部分片段并进行了克隆测序。将所获序列与Gen-Bank中同源性较高的相关序列相比较,计算种间相似性,并构建志贺菌的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定。研究发现,从4基因的序列分析结果总体上可知鸡源志贺菌与人鲍氏志贺菌同源关系最近,同源性达99.6%~100%。几乎所有志贺菌均落入大肠杆菌的分支中,且在鉴别细菌中recA基因和gyrB基因比传统中常用的16SrRNA基因差异更显著。由此证明用细菌分类和鉴定的"金标准"16SrRNA联合gyrB、grpE、recA3个基因进行序列分析来鉴定志贺菌是一种可靠、成本较低的方法;由上述基因序列构建的系统发育树提示,该株鸡源志贺菌可能是与人志贺菌密切相关的新种或是它们的亚种。 展开更多
关键词 鸡鲍氏志贺菌 16S rRNA GYRB grpe RECA 同源性分析
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日本血吸虫SjGrpE蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备
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作者 肖非 胡智 +1 位作者 谭潇 黄泽智 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期355-360,共6页
目的分析日本血吸虫核苷酸交换因子(SjGrpE)蛋白生物学特性,表达与纯化重组SjGrpE蛋白并测定其免疫原性。方法采用生物信息学方法预测SjGrpE蛋白的氨基酸组成、分子量、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、定位、磷酸化位点、泛素化位点、糖基... 目的分析日本血吸虫核苷酸交换因子(SjGrpE)蛋白生物学特性,表达与纯化重组SjGrpE蛋白并测定其免疫原性。方法采用生物信息学方法预测SjGrpE蛋白的氨基酸组成、分子量、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、定位、磷酸化位点、泛素化位点、糖基化位点、二级和三级结构及B细胞表位。以日本血吸虫cDNA为模板,PCR扩增SjGrpE基因,将其双酶切后连接到pET28a载体得到重组质粒pET28a-SjGrpE。将pET28a-SjGrpE转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导目的蛋白表达,并用镍离子亲和层析法纯化蛋白。将重组SjGrpE蛋白免疫小鼠,分离血清并鉴定获得的抗多克隆抗体。结果SjGrpE蛋白分子量约为24.3 kDa,是一种亲水性蛋白,无跨膜区、无信号肽,定位在线粒体;该蛋白含有18个磷酸化位点和2个泛素化位点,无糖基化位点,含有5个B细胞表位。SjGrpE基因全长为660 bp,成功构建重组质粒pET28a-SjGrpE并纯化获得重组SjGrpE蛋白。重组SjGrpE蛋白能够刺激小鼠分泌高滴度抗体。结论成功制备重组SjGrpE蛋白,该蛋白具有良好免疫原性,为后续研究其作为日本血吸虫病疫苗候选分子的价值奠定了基础。 展开更多
关键词 日本血吸虫 grpe蛋白 免疫原性 生物信息学分析
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鸡毒支原体热休克蛋白GrpE粘附特性的鉴定 被引量:6
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作者 周长平 陈莹 +5 位作者 李媛 高利萍 王显兵 王莉莉 于艳超 辛九庆 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期28-33,共6页
鸡毒支原体(MG)脂质相关蛋白(LAMPs)的粘附特性在感染宿主细胞中起重要的作用,本实验室前期利用快速蛋白液相色谱和质谱鉴定MG的grp E基因编码的GrpE蛋白为热休克蛋白。为进一步鉴定GrpE蛋白是否具有粘附特性,本研究通过原核表达MG株gr... 鸡毒支原体(MG)脂质相关蛋白(LAMPs)的粘附特性在感染宿主细胞中起重要的作用,本实验室前期利用快速蛋白液相色谱和质谱鉴定MG的grp E基因编码的GrpE蛋白为热休克蛋白。为进一步鉴定GrpE蛋白是否具有粘附特性,本研究通过原核表达MG株grp E基因,并利用表达纯化的重组蛋白GrpE(rGrpE)免疫BALB/c小鼠。制备抗GrpE的单克隆抗体(MAb)。通过亚细胞定位,结果显示GrpE定位于细胞表面。通过激光共聚焦显微镜观察到rGrpE对DF-1细胞具有明显的粘附作用,而且利用抗GrpE的MAb能够特异抑制MG膜蛋白对DF-1细胞的粘附。此外,夹心ELISA和流式细胞术试验结果也表明制备的MAb能够显著抑制MG膜蛋白对DF-1细胞的粘附,并呈剂量依赖关系。上述结果表明热休克蛋白GrpE是MG的一种新的具有粘附特性的蛋白。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 热休克蛋白Grp E 粘附 鉴定
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肺炎支原体GrpE蛋白的生物信息学分析、纯化及多克隆抗体的制备 被引量:1
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作者 唐愈菲 黄泽智 +1 位作者 赵爽 李冉辉 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第10期1140-1144,1149,共6页
目的利用生物信息学方法分析肺炎支原体GrpE蛋白的生物学特性,纯化MpGrpE蛋白并制备多克隆抗体。方法从NCBI网站获得肺炎支原体GrpE蛋白的氨基酸序列,并将其与大肠埃希菌、结核分枝杆菌、解脲脲原体、生殖支原体、鸡毒支原体和龟支原体... 目的利用生物信息学方法分析肺炎支原体GrpE蛋白的生物学特性,纯化MpGrpE蛋白并制备多克隆抗体。方法从NCBI网站获得肺炎支原体GrpE蛋白的氨基酸序列,并将其与大肠埃希菌、结核分枝杆菌、解脲脲原体、生殖支原体、鸡毒支原体和龟支原体的GrpE蛋白进行序列比对。利用生物信息学软件分析预测MpGrpE蛋白的信号肽、跨膜区、细胞定位、磷酸化和糖基化修饰、二级结构、三级结构、B细胞表位和作蛋白等生物学特性。将重组质粒pET28a-MpGrpE转化大肠埃希菌,诱导表达后通过Ni亲和层析纯化重组MpGrpE蛋白。用重组蛋白免疫小鼠,获得抗血清并测定抗体滴度。结果MpGrpE蛋白与生殖支原体GrpE蛋白同源性为73%。MpGrpE蛋白共有217个氨基酸,分子式CHNOS,理论分子质量为24.7ku,理论等电点为7.7,为不稳定的疏水性蛋白。MpGrpE蛋白无信号肽,无跨膜区,定位在胞质。该蛋白含有8个丝氨酸、4个苏氨酸和2个酪氨酸磷酸化位点,无糖基化位点。其二级结构中α螺旋占69.12%,β折叠占8.29%,无规卷曲占18.89%,β转角占3.69%。MpGrpE蛋白83.2%的三级结构为最佳状态。MpGrpE蛋白含有4个连续的B表位和4个非线性表位。MpGrpE蛋白的的互作蛋白有DnaK、GroS、GroL等。通过Ni亲和层析获得了较高纯度的MpGrpE蛋白,用该蛋白免疫小鼠能够诱导产生IgG抗体。结论生物信息学分析MpGrpE蛋白是定位在肺炎支原体胞质的一种疏水性蛋白,克隆表达的MpGrpE蛋白具有良好的免疫原性,为肺炎支原体的致病机制以及疫苗研发提供了实验基础。 展开更多
关键词 肺炎支原体 核苷酸交换因子 生物信息学 多克隆抗体
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解脲脲原体GrpE蛋白促进小鼠树突状细胞成熟并诱导Th1型免疫应答 被引量:3
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作者 郭方毅 唐艳红 +6 位作者 袁红霞 张文君 向璟 刘鹏琴 滕文友 李冉辉 代国知 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期41-49,共9页
目的:探讨解脲脲原体GrpE蛋白(Ureaplasma urealyticum GrpE,Uu-GrpE)对树突状细胞成熟的影响及其对T细胞极化的作用。方法:表达纯化Uu-GrpE蛋白并利用Western blot鉴定。分离培养小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic... 目的:探讨解脲脲原体GrpE蛋白(Ureaplasma urealyticum GrpE,Uu-GrpE)对树突状细胞成熟的影响及其对T细胞极化的作用。方法:表达纯化Uu-GrpE蛋白并利用Western blot鉴定。分离培养小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs),利用LDH试剂盒分析Uu-GrpE的细胞毒性,流式细胞术检测Uu-GrpE对BMDCs表面共刺激分子CD80和CD86以及主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(major histocompatibility complexⅡ,MHCⅡ)表达的影响,ELISA检测其刺激BMDCs后IL-12p70、TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子的表达;磁珠分选同系异体小鼠的脾脏中初始CD4^(+)T细胞(CD4^(+)Naive T细胞),通过构建BMDCs与Naive T细胞共培养体系分析Uu-GrpE刺激成熟的BMDCs(GrpE-BMDCs)对Naive T细胞增殖及极化的影响。GrpE-BMDCs经尾静脉注射免疫小鼠并利用ELISA和流式细胞术观察其所诱导的特异性体液和细胞免疫应答。结果:成功表达Uu-GrpE并分离出高纯度BMDCs,Uu-GrpE可刺激BMDCs分泌IL-12p70、TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子且无细胞毒性;同时Uu-GrpE可显著增加BMDCs表面分子CD80[平均荧光强度(mean flourscence indensity,MFI):(324.00±22.11)vs(91.03±10.95),P<0.01]、CD86[MFI:(1176.00±51.39)vs(217.00±14.93),P<0.01]和MHCⅡ[MFI:(708.70±56.32)vs(185.70±16.77),P<0.01]的表达;与单独GrpE-BMDCs组和GrpE(热变性)-BMDCs^(+)T细胞组比较,GrpE-BMDCs不仅可刺激Naive T细胞增殖[刺激指数(stimulation index):(7.25±0.21),(6.55±0.23),(6.09±0.35),P均<0.05],并且还诱导Naive T细胞分泌Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ[IL-2:(145.60±14.67)pg/ml,(55.92±3.12)pg/ml,(26.05±2.40)pg/ml,P<0.05和P<0.01;IFN-γ:(267.20±37.80)pg/ml,(146.70±20.65)pg/ml,(27.84±6.69)pg/ml,P均<0.05],而Th2型细胞因子IL-4、IL-10和IL-5则无明显改变。与PBS组和PBS^(+)BMDCs组比较,GrpE-BMDCs经过继转移后,可诱导机体产生Th1型免疫应答。结论:Uu-GrpE蛋白明显促进BMDCs成熟及活化,且进一步证明其作为解脲脲原体候选蛋白疫苗可诱导Th1型免疫应答。 展开更多
关键词 解脲脲原体 grpe 树突状细胞 免疫应答
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Expression analysis of heat-shock protein gene Hsp845 in the Antarctic psychrotrophic bacterium Psychrobacter sp.Gunder temperature and salinity stress
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作者 CHE Shuai ZHANG Liang +1 位作者 ZHANG Zheng LIN Xuezheng 《Advances in Polar Science》 2016年第1期14-20,共7页
Abstract Heat shock proteins (Hsps), produced by organisms under high temperature stimulation, play important roles in protein folding, translocation, and refolding/degradati0n. In this study, we investigated the ex... Abstract Heat shock proteins (Hsps), produced by organisms under high temperature stimulation, play important roles in protein folding, translocation, and refolding/degradati0n. In this study, we investigated the expression level of the GrpE Hsp gene Hsp845 of Psychrobacter sp. G under different temperature and salinity stresses by quantitative real-time PCR and western blotting, respectively. At both transcriptional and translational levels, Hsp845 gene expression was induced by high temperature (30~C) and inhibited by low temperatures (0~C and 10~C). Hsp845 expression was also induced both by the absence of salt (0%0) and high salinity (90%0 and 120%o) at the transcriptional level, but was only induced by high salinity (90%0 and 120%o) at the translational level. In a combined stress treatment, Hsp845 was more sensitive to high temperature than to salinity at both transcriptional and translational levels. The increase in the translational-level expression of Hsp845 lagged behind that at the transcriptional level, and Hsp845 maximum expression was also higher at the transcriptional than at the translational level. In the absence of salt, transcriptional- and translational-level expressions exhibited opposite patterns, suggesting that the underlying mechanism requires further study. 展开更多
关键词 PSYCHROBACTER Hsp845 grpe stress response qRT-PCR western blotting
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肺炎链球菌热休克蛋白Grp E的表达、纯化及热稳定性研究
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作者 张宏鹏 赵沙沙 +5 位作者 龙小滨 吴爽 白垒 罗淼 黄爱龙 汪德强 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1448-1451,共4页
目的:肺炎链球菌可引起细菌性肺炎和脑膜炎、发热性菌血症等多种疾病。对肺炎链球菌热休克蛋白Grp E进行克隆表达,纯化及热稳定性测定,以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。方法:利用PCR技术扩增Grp E基因,构建重组质粒p W28-Grp... 目的:肺炎链球菌可引起细菌性肺炎和脑膜炎、发热性菌血症等多种疾病。对肺炎链球菌热休克蛋白Grp E进行克隆表达,纯化及热稳定性测定,以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。方法:利用PCR技术扩增Grp E基因,构建重组质粒p W28-Grp E,并在大肠杆菌(escherichia coli,E.coli)B834中表达,Ni2+-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化Grp E蛋白,Hiload Superdex 75凝胶层析柱分析在溶液中的聚集状态,热稳定性(thermal shift assay,TSA)法测定热稳定性。结果:1成功构建重组质粒p W28-Grp E,在表达菌E.coli B834中可溶性表达。2获得高纯度(95.0%以上)Grp E蛋白,发现该蛋白在溶液中以二聚体形式存在。3测定Grp E蛋白在p H 6.0、20 mmol/L盐浓度缓冲液中有较高热稳定性。结论:利用经典的蛋白质克隆表达纯化技术,获得了高表达量高纯度的Grp E蛋白,并初步测定其热稳定性为下一步蛋白晶体培养、三维结构解析及感染机制研究提供重要基础。 展开更多
关键词 肺炎链球菌 热休克蛋白Grp E 蛋白质表达纯化 热稳定性
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