由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)感染导致的家蚕血液型脓病给蚕桑产业造成巨大损失,然而BmNPV与宿主的互作机制至今仍然不明晰。前期的研究发现,BmNPC2可显著促进BmNPV感染,BmNPC2蛋白能够直接与BmNPV...由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)感染导致的家蚕血液型脓病给蚕桑产业造成巨大损失,然而BmNPV与宿主的互作机制至今仍然不明晰。前期的研究发现,BmNPC2可显著促进BmNPV感染,BmNPC2蛋白能够直接与BmNPV的囊膜蛋白GP64互作,敲除BmNPC2影响病毒粒子在晚期内体中的膜融合效率。为了鉴定BmNPC2蛋白与病毒囊膜蛋白GP64的互作关键位点,首先通过同源建模以及酵母双杂交试验,筛选出BmNPC2蛋白与囊膜蛋白GP64互作的2个关键区段。随后,将这两个区段位点的氨基酸进行逐个突变,酵母双杂交试验结果表明N95、D97、P105为关键互作位点。在敲除BmNPC2基因的BmE细胞中回补突变3个关键位点的BmNPC2蛋白后,细胞中BmNPV的病毒相对载量显著低于回补野生型BmNPC2蛋白组。以上结果表明,BmNPC2的这3个关键位点的突变显著减弱了BmNPV的感染能力,这些结果将为进一步解析BmNPV侵染家蚕的分子机制提供参考。展开更多
通过Primer Premier 5.0设计1对特异性引物,用于扩增家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的部分DNA片段,对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化,并对纯化后的双酶切DNA片段与经同样双酶切后的原核表达载体pET28a进行连接;对捕获有重组质粒pET28a-G...通过Primer Premier 5.0设计1对特异性引物,用于扩增家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的部分DNA片段,对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化,并对纯化后的双酶切DNA片段与经同样双酶切后的原核表达载体pET28a进行连接;对捕获有重组质粒pET28a-GP64的大肠埃希菌BL21(DE3)细胞进行IPTG诱导,通过SDS-PAGE对诱导产物进行电泳分析,结果表明扩增的目的片段获得了表达;通过His单抗对诱导产物进行Western Blot印迹分析,其结果表明诱导蛋白带为融合有组氨酸的目的蛋白。对原核表达的GP64截短蛋白和免疫佐剂进行充分研磨,将充分研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,以制备的GP64多抗对家蚕核型多角体病毒粒子感染的BmN细胞总蛋白进行Western Blot印迹分析,结果在杂交膜上出现一条特异杂交带、其分子量大小约为64 ku,表明制备的GP64多抗可用于其功能的进一步研究。展开更多
【目的】了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)gp64基因的遗传多态性及进化特点,掌握BmNPV在广西蚕区的流行和传播情况,揭示BmNPV种群维持遗传多样性的模式与机制。【方法】对20株广西BmNPV毒株的gp64...【目的】了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)gp64基因的遗传多态性及进化特点,掌握BmNPV在广西蚕区的流行和传播情况,揭示BmNPV种群维持遗传多样性的模式与机制。【方法】对20株广西BmNPV毒株的gp64基因进行测序分析,根据gp64基因构建遗传进化树及绘制毒株流行分布图,并比对不同毒株的致病力。【结果】广西BmNPV毒株gp64基因开放阅读框(ORF)长度存在3种情况(1590、1593和1599 bp),分别编码含529、530和532个氨基酸残基的GP64蛋白。20株广西BmNPV毒株与标准参考T3株的gp64基因核苷酸序列同源性在97.6%~99.2%,其推导氨基酸序列同源性在96.4%~99.6%。在广西BmNPV毒株gp64基因近N端分别出现GCG缺失和GCGCCG/GTGCCG插入突变,发生核苷酸替换突变的位点数目在13~28个,但大部分为同义替换,对编码蛋白的三聚体空间构象无明显影响。广西BmNPV毒株gp64基因编码蛋白的N-糖基化位点为3~4个;除GXZS株外,所有毒株的O-糖基化位点均为2个,且预测位点一致。基于gp64基因构建的遗传进化树显示,几乎所有的广西BmNPV毒株聚类于Clade Ⅰ分群,其又被分为2个主要亚群(Sub-clade Ⅰ和Sub-clade Ⅱ);而几乎所有的国外参考毒株聚类于Clade Ⅱ分群。广西蚕区的BmNPV流行分布呈集中性与分散性并存;GXUA株对四龄和五龄起蚕的半数致死量(LD_(50))分别为3.3和3.1,而GXZZ株对四龄和五龄起蚕的LD_(50)分别为5.5和5.3,说明GP64蛋白糖基化位点较少的BmNPV毒株表现出较弱的致病力。【结论】广西BmNPV毒株gp64基因在进化过程中其信号肽区出现明显变异,发生同义突变的频率较高,形成较独立的进化分群,毒株间的致病力差异可能与GP64蛋白糖基化位点不同有关,说明广西BmNPV毒株具有不同的基因型和表型,在一定程度上维持了BmNPV野生群体的遗传多样性。展开更多
文摘由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)感染导致的家蚕血液型脓病给蚕桑产业造成巨大损失,然而BmNPV与宿主的互作机制至今仍然不明晰。前期的研究发现,BmNPC2可显著促进BmNPV感染,BmNPC2蛋白能够直接与BmNPV的囊膜蛋白GP64互作,敲除BmNPC2影响病毒粒子在晚期内体中的膜融合效率。为了鉴定BmNPC2蛋白与病毒囊膜蛋白GP64的互作关键位点,首先通过同源建模以及酵母双杂交试验,筛选出BmNPC2蛋白与囊膜蛋白GP64互作的2个关键区段。随后,将这两个区段位点的氨基酸进行逐个突变,酵母双杂交试验结果表明N95、D97、P105为关键互作位点。在敲除BmNPC2基因的BmE细胞中回补突变3个关键位点的BmNPC2蛋白后,细胞中BmNPV的病毒相对载量显著低于回补野生型BmNPC2蛋白组。以上结果表明,BmNPC2的这3个关键位点的突变显著减弱了BmNPV的感染能力,这些结果将为进一步解析BmNPV侵染家蚕的分子机制提供参考。
