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生防副地衣芽孢杆菌ZYGT1811的GFP标记及其在小麦植株和根际土的定殖动态
1
作者 王艺璇 柳敬龙 +6 位作者 李惠霞 费芍丹 孙佳聪 任兴平 田晓明 刘永刚 张海英 《中国生物防治学报》 北大核心 2025年第6期1403-1411,共9页
为明确副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811对小麦茎基腐病的防治机制,本研究采用电击转化法,获得有绿色荧光的ZYGT1811-GFP标记菌株,通过测定生长曲线、拮抗活性、游动性以及生物膜形成能力,发现外源基因的导入对该原... 为明确副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811对小麦茎基腐病的防治机制,本研究采用电击转化法,获得有绿色荧光的ZYGT1811-GFP标记菌株,通过测定生长曲线、拮抗活性、游动性以及生物膜形成能力,发现外源基因的导入对该原始菌株无明显影响,采用灌根法明确了菌株ZYGT1811-GFP在小麦植株和根际土的定殖状况。结果表明,灌根6 d后,ZYGT1811-GFP在小麦根际土、根、茎、叶中定殖量达到最大,分别为3.24×10^(6)、1.76×10^(6)、9.00×10^(5)、6.47×10^(4)cfu/g,第21 d定殖量有所下降,但仍维持一定定殖量,各部位的菌群密度仍表现为根际土>根>茎>叶。本研究证实菌株ZYGT1811具有稳定的定殖能力,可为揭示副地衣芽孢杆菌防治小麦茎基腐病的机制提供理论依据。 展开更多
关键词 小麦茎基腐病 gfp 生物防治 副地衣芽孢杆菌 定殖
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SFFV启动子高效驱动mCherry-GFP-LC3B双荧光体系在红系细胞中进行自噬检测
2
作者 任久强 李静 +2 位作者 李卓 刘雪会 吕湘 《基础医学与临床》 2025年第7期866-873,共8页
目的建立由造血细胞中高活性的脾焦点形成病毒(SFFV)启动子驱动的mCherry-GFP-LC3B慢病毒表达体系,并实现红系终末分化细胞自噬流的高效动态示踪。方法构建pRSC-SFFV-mCherry-GFP-LC3B慢病毒质粒,包装慢病毒并感染人红系祖细胞系(HUDEP... 目的建立由造血细胞中高活性的脾焦点形成病毒(SFFV)启动子驱动的mCherry-GFP-LC3B慢病毒表达体系,并实现红系终末分化细胞自噬流的高效动态示踪。方法构建pRSC-SFFV-mCherry-GFP-LC3B慢病毒质粒,包装慢病毒并感染人红系祖细胞系(HUDEP-2)及小鼠胎肝来源原代红系细胞;结合血清剥夺及氯喹干预模型,利用荧光成像、Western blot及流式细胞测量术分析红系终末分化细胞的自噬动态变化。结果SFFV启动子在HUDEP-2(97%vs.60%)及原代小鼠胎肝红系细胞(83%vs.1%)中表达的阳性率均显著高于巨噬细胞病毒(CMV)启动子(P<0.01,P<0.001),且不影响正常分化。血清剥夺后,自噬溶酶体(红斑)数量增加,伴随LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高及p62蛋白下降;氯喹干预则导致自噬体(黄斑)累积(P<0.001),且抑制效应呈剂量依赖性(r^(2)=0.92)。结论SFFV驱动双荧光体系可高效实时示踪红系细胞自噬流动态,为红系分化及相关贫血性疾病的机制研究提供了高灵敏度工具。 展开更多
关键词 SFFV启动子 自噬 mCherry-gfp-LC3B双荧光 红系细胞
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基于Split-GFP系统定量分析大肠杆菌中异源表达的类胶原蛋白Scl2
3
作者 色依德·斯马依 赵晨旭 +3 位作者 张轶群 刘业学 王稳航 李玉 《天津科技大学学报》 2025年第1期13-19,27,共8页
利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达类胶原蛋白Scl2,并通过Split-GFP系统建立一种简便、快速且可定量检测Scl2的方法。结果表明,Scl2在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达,并通过His亲和标签纯化得到较高纯度的Scl2。圆二... 利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达类胶原蛋白Scl2,并通过Split-GFP系统建立一种简便、快速且可定量检测Scl2的方法。结果表明,Scl2在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达,并通过His亲和标签纯化得到较高纯度的Scl2。圆二色光谱和差示扫描量热仪分析发现,Scl2的二级结构和热稳定性与动物源Ⅰ型胶原蛋白相似,并且GFP11的融合对其几乎没有影响。GFP1-10和Scl2-GFP11结合的前20 h的结合速度较高,达到最大相对荧光强度需要约70 h。当两者结合1 h时,Scl2-GFP11蛋白质量浓度与相对荧光强度之间能够形成较好的线性关系,相关系数R2为0.9995,重复性良好。本研究利用Split-GFP系统建立了体外检测并定量分析Scl2的方法,为下一步高通量筛选研究提供了快速、简便的工具。 展开更多
关键词 大肠杆菌 异源表达 类胶原蛋白Scl2 Split-gfp 蛋白定量分析
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生防菌ZJY-1及ZJY-116的GFP标记及其在黄瓜根围的生态适应性 被引量：15
4
作者 张昕 张炳欣 +4 位作者 喻景权 张震 沈卫峰 陈振宇 石江 《应用生态学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期2144-2148,共5页
将具有绿色荧光蛋白(GFP)标记和氯霉素抗性的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌BrevibacillusbrevisZJY-1和Bacillus subtilisZJY-116中,用这些标记菌株处理黄瓜种子,出苗后通过定期分离计数具有上述表型的转化子,研究了2株生防菌在黄瓜根围... 将具有绿色荧光蛋白(GFP)标记和氯霉素抗性的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌BrevibacillusbrevisZJY-1和Bacillus subtilisZJY-116中,用这些标记菌株处理黄瓜种子,出苗后通过定期分离计数具有上述表型的转化子,研究了2株生防菌在黄瓜根围的定殖规律.结果表明,在整个生育期2株生防菌株均能在黄瓜根围有效定殖,并在黄瓜盛花期和盛果期出现数量高峰.盆栽试验发现,引入黄瓜根围的2株生防菌有向周边杂草迁移的特性,且在前一季寄主植物死亡后,菌株可在下一季植株根围增殖. 展开更多
关键词 质粒pRP22-gfp gfp基因 短短芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 黄瓜根围 定殖
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花粉介导法将TaPHR1∷GFP融合蛋白基因导入玉米 被引量：6
5
作者 王秀红 白建荣 +3 位作者 孙毅 刘惠民 史向远 任志强 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1732-1737,共6页
利用超声波辅助花粉介导基因转化法,将小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP构建成的融合蛋白基因(TaPHR1∷GFP)导入3个玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC中.结果表明:3个自交系的转化效果存在基因型差异,郑58是很好的转化受体材料,平均结籽穗率... 利用超声波辅助花粉介导基因转化法,将小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP构建成的融合蛋白基因(TaPHR1∷GFP)导入3个玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC中.结果表明:3个自交系的转化效果存在基因型差异,郑58是很好的转化受体材料,平均结籽穗率、每穗平均结籽数、BASTA除草剂抗性和转基因植株PCR阳性率均优于昌7-2和PH6W;对T1代植株进行Southern杂交表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因已整合到玉米基因组中;RT-PCR结果显示,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到有效转录;通过对发芽籽粒进行GFP荧光观察表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到了表达. 展开更多
关键词 玉米自交系 花粉介导转基因法 TaPHR1∷gfp融合蛋白基因 gfp(绿色荧光蛋白)
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慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响 被引量：3
6
作者 李燕 陆伟 +4 位作者 竺丽梅 邵燕 陈诚 刘巧 韩晓冬 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期883-889,共7页
运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁... 运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁法培养MSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面标记,鉴定MSCs纯度;Lentivirus-GFP以1、10、50和100的感染复数(MOI)转染MSCs,作用48h后流式细胞术及免疫荧光法检测转染效率和表达的荧光强度;MTT法检测转染后MSCs的细胞活力.诱导MSCs-GFP向成肌细胞分化,蛋白印记法(WB)检测成肌细胞特异性蛋白desmin和α-SMA的表达.流式细胞术检测结果显示,培养的MSCs表达CD44、CD90和CD105,不表达CD34、CD45和CD188,符合干细胞特性.MOI为1、10、50和100的转染效率分别为23.45%、93.51%、95.44%和95.55%,MOI为10时,转染效率较高,且对MSCs活力无明显影响.MSCs-GFP体外经成肌细胞诱导分化后,表达特异性抗原desmin和α-SMA.表明本研究成功构建了小鼠骨髓来源MSCs的Lentivirus-GFP转染体系,有效标记了MSCs细胞,且此标记对MSCs的表型、增殖和分化能力等细胞生物学特性无明显影响. 展开更多
关键词 慢病毒(Lentivirus) 绿色荧光蛋白(gfp) 小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 转染 组织工程 green fluorescent protein (gfp) MESENCHYMAL stem cells (MSC)
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nptⅡ::mgfp5融合基因的构建及其在柑桔遗传转化中的应用 被引量：2
7
作者 刘小丰 彭爱红 +4 位作者 许兰珍 邹修平 朱世平 赵晓春 陈善春 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2013年第7期1282-1287,共6页
早期、无损伤、易于操作的阳性芽检测技术,对提高柑橘遗传转化效率是十分有利的。本文设计和构建了nptⅡ：：mgfp5融合基因,通过锦橙上胚轴转化体系研究其在柑橘遗传转化中的作用。nptⅡ：：mgfp5融合基因全长1 578 bp,编码525个氨基酸... 早期、无损伤、易于操作的阳性芽检测技术,对提高柑橘遗传转化效率是十分有利的。本文设计和构建了nptⅡ：：mgfp5融合基因,通过锦橙上胚轴转化体系研究其在柑橘遗传转化中的作用。nptⅡ：：mgfp5融合基因全长1 578 bp,编码525个氨基酸,作为表达载体p1301NG的选择标记和报告基因。通过农杆菌介导法转化锦橙上胚轴,再生培养1周后用体式荧光显微镜观察外植体的再生情况。在再生培养第9天时即观察到GFP荧光再生芽的形成,再生培养后10~15 d是GFP再生芽形成的高峰期。GUS染色和PCR分子检测结果证明,GFP荧光检测结果是真实可靠的。研究结果表明：nptⅡ：：mgfp5融合基因能够在再生培养早期筛选到阳性转化芽,有助于提高阳性转化芽的存活率,提高柑橘遗传转化效率。 展开更多
关键词 nptⅡ mgfp5融合基因 柑橘遗传转化 gfp荧光 转化效率
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基因工程疟原虫P.bzoGFP的构建及其生物特性
8
作者 范长一 巩小惠 +3 位作者 魏延钊 张雨琦 王姗姗 杜峰 《济宁医学院学报》 2025年第1期12-18,共7页
目的构建动合子阶段表达绿色荧光蛋白的基因工程疟原虫,为该阶段相关的研究提供工具虫株。方法构建含有GFP基因序列和pb25基因位点重组同源臂的打靶载体,线性化后电转染至伯氏疟原虫P.berghei。经药物筛选后使用有限稀释法进行克隆,利用... 目的构建动合子阶段表达绿色荧光蛋白的基因工程疟原虫,为该阶段相关的研究提供工具虫株。方法构建含有GFP基因序列和pb25基因位点重组同源臂的打靶载体,线性化后电转染至伯氏疟原虫P.berghei。经药物筛选后使用有限稀释法进行克隆,利用PCR进行基因型鉴定。通过观察记录感染小鼠的发病情况、疟疾血症、红内期各阶段和合子、动合子的形态发育,分析基因工程疟原虫的生物学特性。结果基因工程伯氏疟原虫P.bzoGFP,经PCR基因型鉴定与预期一致,且能在动合子阶段表达绿色荧光蛋白。P.bzoGFP与野生型疟原虫在红细胞内的形态和体外培养合子、动合子的形态均无差异,感染小鼠的生存时间无统计学差异(χ^(2)=0.309,P>0.05),体外培养动合子的转化情况无显著差别(t=0.341,P>0.05)。结论成功构建基因工程疟原虫P.bzoGFP,其生物学特性与野生型疟原虫无明显不同,能够在合子形成后有效表达GFP,无需抗体标记,可直接用于疟疾传播阻断效果的评估等此阶段相关研究。 展开更多
关键词 疟疾 gfp 基因工程 动合子
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伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的构建 被引量：2
9
作者 姜焱 侯玉峰 陈溥言 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期15-20,共6页
在构建了含伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上 ,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶BamHI和BstpI缺失掉gE基因 5’端 363bp,同时把绿色荧光蛋白 (GFP)基因表达盒插入到缺失部... 在构建了含伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上 ,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶BamHI和BstpI缺失掉gE基因 5’端 363bp,同时把绿色荧光蛋白 (GFP)基因表达盒插入到缺失部分 ,并在下游引入一个多克隆位点 ,构建了缺失转移载体pgEI GFP。用DOTAP转染试剂盒将pgEI GFP转染了感染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 ,并以蚀斑法得到纯化的缺失了gE gI重组病毒株。小鼠试验证实了缺失株的毒力有所下降。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒上海株 PRV-SH gE^-/gI^-/gfp^+缺失株 构建 转移载体质粒 绿色荧光蛋白(gfp)表达盒
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绿色荧光蛋白(GFP)在分子遗传学上的研究进展 被引量：4
10
作者 杨秀芹 刘娣 祖延涛 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2001年第7期36-38,共3页
作为一种新型、方便的报告基因 ,来自多管水母属的绿色荧光蛋白 (GFP)具有很多理想特性。如当受到蓝光或紫外光照射时 ,能够发出明亮的绿色荧光 ,且这种荧光不需要外源底物和辅因子 ,因此 ,它的表达可用于监测活的生物体中的基因表达和... 作为一种新型、方便的报告基因 ,来自多管水母属的绿色荧光蛋白 (GFP)具有很多理想特性。如当受到蓝光或紫外光照射时 ,能够发出明亮的绿色荧光 ,且这种荧光不需要外源底物和辅因子 ,因此 ,它的表达可用于监测活的生物体中的基因表达和蛋白质定位 。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 gfp gfp突变体 分子遗传学 报告基因 应用
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GFP-FABD2和GFP-MBD标记蛋白对拟南芥悬浮细胞培养及应激响应能力的影响
11
作者 时兰春 王伯初 +2 位作者 杨兴艳 张运刚 王益川 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期931-939,共9页
以转GFP-FABD2和GFP-MBD基因的拟南芥为材料,研究了GFP-FABD2和GFP-MBD这两种细胞骨架标记蛋白对拟南芥愈伤组织诱导、悬浮细胞培养及应激响应能力的影响.结果表明:(1)GFP-MBD标记蛋白延长愈伤的出愈时间,改变愈伤形态,使转基因拟南芥... 以转GFP-FABD2和GFP-MBD基因的拟南芥为材料,研究了GFP-FABD2和GFP-MBD这两种细胞骨架标记蛋白对拟南芥愈伤组织诱导、悬浮细胞培养及应激响应能力的影响.结果表明:(1)GFP-MBD标记蛋白延长愈伤的出愈时间,改变愈伤形态,使转基因拟南芥种子的出愈量减少为野生型的59%、悬浮细胞的长短轴比缩小为1.20±0.21、第7天细胞活力下降为0.66±0.09,影响细胞的生长曲线.(2)GFP-FABD标记蛋白虽对愈伤生长影响不大,但却使悬浮细胞的长短轴比显著增加为2.49±1.18、第7天细胞的活力下降为0.87±0.06,造成悬浮细胞生长曲线的改变.(3)通过调整培养条件的激素水平,以上两种细胞骨架标记蛋白对悬浮细胞生长的影响可以得到修复.(4)检测优化条件下培养的GFP-FABD2或GFP-MBD悬浮细胞对温度、渗透压、机械应力等环境改变的应激响应能力,结果未发现与野生型有明显区别. 展开更多
关键词 gfp-FABD2 gfp-MBD 拟南芥 悬浮细胞 应激响应
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鸡α-珠蛋白基因5′端MAR调控GFP基因在COS7细胞中表达的研究
12
作者 孙丽翠 贺俊崎 +6 位作者 郑君芳 王雅梅 张松 张玉国 仲飞 刘朋朋 齐顺章 《首都医科大学学报》 CAS 2007年第4期479-483,共5页
目的研究鸡α-珠蛋白基因5′端核基质结合区(matrix association region,MAR)的基因表达调控作用。方法采用PCR方法扩增鸡α-珠蛋白基因5′端1 600 bp长度的MAR,并将该MAR连接在pCMV/GFP载体CMV启动子上游和GFP报告基因下游,构建含2个MA... 目的研究鸡α-珠蛋白基因5′端核基质结合区(matrix association region,MAR)的基因表达调控作用。方法采用PCR方法扩增鸡α-珠蛋白基因5′端1 600 bp长度的MAR,并将该MAR连接在pCMV/GFP载体CMV启动子上游和GFP报告基因下游,构建含2个MAR的真核表达载体pGFP/2MAR。采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS7细胞,用荧光显微镜和流式细胞术对荧光表达进行观察、定量。结果荧光显微镜观察pGFP/2MAR在转染48 h后荧光表达量明显高于pCMV/GFP的荧光表达量;流式细胞仪分析表明,在COS7细胞中pCMV/GFP和pGFP/2MAR的荧光表达量分别为17.9%和33.6%。结论该MAR确实能提高GFP在真核细胞中的表达量。 展开更多
关键词 PCR 鸡α-珠蛋白基因5'端MAR pgfp/2MAR gfp 流式细胞仪
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M细胞靶向融合肽SAM-GFP的原核表达、纯化及靶向性质鉴定
13
作者 吴静 张乐乐 +5 位作者 张富蕊 刘昆梅 李润乐 汤锋 刘菁 郭乐 《中国生物制品学杂志》 2025年第7期796-801,共6页
目的 原核表达M细胞靶向融合肽SAM-GFP,纯化后进行靶向性质鉴定,以期为M细胞靶向性幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础。方法 采用基于PCR的精确合成(PCR-based accurate synthesis,PAS)法合成GFP基因,克隆至载体pCzn1-SAM中,构建重组质... 目的 原核表达M细胞靶向融合肽SAM-GFP,纯化后进行靶向性质鉴定,以期为M细胞靶向性幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础。方法 采用基于PCR的精确合成(PCR-based accurate synthesis,PAS)法合成GFP基因,克隆至载体pCzn1-SAM中,构建重组质粒pCzn1-SAM-GFP。将重组质粒转化至感受态E.coli Arctic Express,经IPTG诱导表达后,通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,获得融合蛋白SAM-GFP,并进行12%SDS-PAGE、Western blot及荧光显微镜鉴定。利用小鼠回肠袢模型,通过免疫荧光染色法验证融合蛋白SAM-GFP的M细胞靶向性。结果 重组质粒pCzn1-SAMGFP经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。融合蛋白SAM-GFP相对分子质量约54 900,主要以可溶性形式表达,纯化后纯度达94.5%,可与鼠抗6×His/GFP单克隆抗体特异性结合,荧光显微镜下可见绿色荧光。SAM-GFP能被小肠M细胞特异性摄取。结论 成功表达并纯化了具有M细胞靶向功能的融合蛋白SAM-GFP,为后续幽门螺杆菌口服疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 M细胞靶向肽 原核表达 融合蛋白
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GFP标记的球孢白僵菌在玉米中的定殖 被引量：19
14
作者 隋丽 徐文静 +7 位作者 张正坤 杨芷 王志慧 杜茜 汪洋洲 陈日曌 李启云 路杨 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期848-857,共10页
为明确球孢白僵菌在玉米中的定殖分布规律以及不同施用方式和处理浓度对玉米生长发育的影响,本文利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的球孢白僵菌,在激光扫描共聚焦显微镜下观测了球孢白僵菌在玉米根部、茎部和叶部的定殖情况,同时检测了不同接... 为明确球孢白僵菌在玉米中的定殖分布规律以及不同施用方式和处理浓度对玉米生长发育的影响,本文利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的球孢白僵菌,在激光扫描共聚焦显微镜下观测了球孢白僵菌在玉米根部、茎部和叶部的定殖情况,同时检测了不同接种方式在球孢白僵菌不同处理浓度下对玉米生长指标的影响。结果表明,球孢白僵菌在玉米不同组织部位上的定殖有着明显的差异,各球孢白僵菌接种处理中,均以叶部定殖的白僵菌孢子数最多,而茎部均未观测到孢子定殖;玉米根部仅在浸种和灌根处理中可见少量孢子。球孢白僵菌不同接种方式对其在玉米中定殖率的影响差异较大,灌根处理定殖率最高,为76.7%;其次为浸种处理,为73.3%;茎部注射处理及叶面喷施处理定殖率较低,分别为43.3%和36.7%。研究表明,不同施用方式及接种浓度球孢白僵菌孢悬液对玉米生长指标有一定的影响,球孢白僵菌可通过不同接种方式在玉米植株中定殖并扩散,对玉米的生长发育有一定的促进作用,其中以1×106～1×107孢子/mL球孢白僵菌孢悬液浸种或灌根,对玉米苗的促进生长作用最明显。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白(gfp) 球孢白僵菌 玉米 定殖
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GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究 被引量：16
15
作者 朱道圩 米银法 +2 位作者 陈延惠 王静毅 刘中杰 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2003年第2期145-148,共4页
用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、... 用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、较为疏松愈伤组织中游离的原生质体,悬浮到质量分数为13%甘露醇的洗液(CPW13)中,置于45℃水浴中热激5min,再放在冰浴中迅速冷却;加入质粒,轻轻混匀后静止10min;逐滴加入质量分数40%PEG6000介导转化,终浓度为100g·L-1,在室温下放置20min;逐滴加入CPW13稀释转化后的原生质体,以避免PEG浓度剧烈变化造成细胞膜破裂. 展开更多
关键词 软枣猕猴桃 愈伤组织 原生质体 瞬间表达 gfp基因 PEG介导法 遗传转化 绿色荧光蛋白 报告基因
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利用GFP和抗性双类型标记监测联合固氮菌在玉米根际的定殖 被引量：12
16
作者 董越梅 安千里 +1 位作者 李久蒂 朱至清 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 2000年第1期61-65,共5页
将来自质粒pKRP10、pKRP11和pKRP12的氯霉素、卡那霉素和四环素抗性基因分别插入质粒GFPmut2中gfp基因下游的PstI位点 ,得到gfp和不同抗性基因共存的重组质粒 ,转化Enterobactergergoviae 5 7- 7野生型菌株和耐铵工程菌E7后 ,得到既有... 将来自质粒pKRP10、pKRP11和pKRP12的氯霉素、卡那霉素和四环素抗性基因分别插入质粒GFPmut2中gfp基因下游的PstI位点 ,得到gfp和不同抗性基因共存的重组质粒 ,转化Enterobactergergoviae 5 7- 7野生型菌株和耐铵工程菌E7后 ,得到既有抗生素抗性又在蓝光下呈现亮绿荧光的菌株 .用它们接种玉米后 ,利用这两种选择标记双重筛选重新分离到的细菌确定了接种菌在玉米幼苗根表面的定殖数目 ,同时用荧光显微镜观测了它们在玉米根表和土壤中的分布 .确证了GFP与抗生素抗性双标记定量环境中微生物的可靠性和GFP标记用于原位监测细菌分布的优越性 .图版 1图 1表 2参 展开更多
关键词 联合固氮菌 工程菌监测 gfp 抗性 双标记基因
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GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析 被引量：10
17
作者 院海英 吴祥辉 +2 位作者 东锐 崔百明 黄先忠 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期881-885,共5页
以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得... 以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础. 展开更多
关键词 gfp蛋白 拟南芥 小拟南芥 转基因
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Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定 被引量：19
18
作者 何飞 谭颖徽 杨峥嵘 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1197-1200,共4页
目的　构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体。方法　利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1 IRES EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP +... 目的　构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体。方法　利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1 IRES EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP +E86和PA3 17,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;“乒乓球”法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT PCR法分别检测细胞荧光和Delta1mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能。结果　酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1 IRES EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9 7×10 5CFU ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化。结论　逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达。 展开更多
关键词 Delta gfp IRES 逆转录病毒 基因转移 基因表达
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农杆菌介导稻瘟病菌绿色荧光蛋白(GFP)遗传转化研究 被引量：14
19
作者 张俊华 刘烨 +4 位作者 韩雨桐 潘春清 王中业 张淋淋 崔凯旋 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1-7,共7页
稻瘟病是水稻生产中的主要病害,抗病品种选育和利用是控制稻瘟病最有效措施。研究稻瘟病菌与水稻品种互作机制是培育抗病品种的基础。GFP(Green fluorescent protein)基因因其具有片段小、易与多种不同蛋白质N端或C端融合等特点,广泛应... 稻瘟病是水稻生产中的主要病害,抗病品种选育和利用是控制稻瘟病最有效措施。研究稻瘟病菌与水稻品种互作机制是培育抗病品种的基础。GFP(Green fluorescent protein)基因因其具有片段小、易与多种不同蛋白质N端或C端融合等特点,广泛应用于病菌与寄主植物互作研究中。研究以p BGg Hg作为转化载体,根癌农杆菌C58C1作为转化介体,转化稻瘟病菌的强致病菌株py1022。研究发现,250μg·m L-1潮霉素B能完全抑制稻瘟病菌生长,利用根癌农杆菌介导稻瘟病菌遗传转化的最佳条件为:稻瘟病菌分生孢子浓度为1×105个·m L-1,共培养时间为4 d,共培养AS浓度为200μmol·m L-1,共培养温度为28℃。随机挑取8个转化子分别进行PCR扩增后测序、荧光显微镜下观察、致病力及稳定性测定,结果表明GFP成功转化到稻瘟病菌中,可为稻瘟病菌与水稻品种的互作机制研究提供技术支撑。 展开更多
关键词 稻瘟病菌 农杆菌介导遗传转化 绿色荧光蛋白(gfp)
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双荧光mRFP-eGFP-LC3体系在细胞自噬中的作用 被引量：12
20
作者 黄桢钧 刘彬 +1 位作者 刘本荣 刘少军 《贵阳医学院学报》 CAS 2015年第10期1029-1032,共4页
目的:探讨双荧光mRFP-e GFP-LC3(ptf LC3)体系在细胞自噬中的作用。方法:采用不同浓度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)处理人胚肾细胞(HEK293),蛋白印迹法检测不同浓度雷帕霉素组中自噬标记蛋白(LC3蛋白)的表达及LC3-II/LC3-... 目的:探讨双荧光mRFP-e GFP-LC3(ptf LC3)体系在细胞自噬中的作用。方法:采用不同浓度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)处理人胚肾细胞(HEK293),蛋白印迹法检测不同浓度雷帕霉素组中自噬标记蛋白(LC3蛋白)的表达及LC3-II/LC3-I比值;单荧光GFP-LC3质粒和双荧光mRFP-e GFP-LC3质粒转染HEK293细胞,雷帕霉素(200 nmol/L)处理3 h,采用荧光显微镜统计,并比较两种方法转染后HEK293细胞内LC3亮点的变化。结果:不同浓度雷帕霉素处理HEK293细胞,LC3-II蛋白和LC3-II/LC3-I比值均增加;转染GFP-LC3质粒时,雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色亮点的数量增加;转染mRFP-e GFP-LC3质粒时,雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色和红色亮点数量均增加。结论:双荧光mRFP-e GFP-LC3体系优于单荧光GFP-LC3体系,更能全面完整地反映细胞自噬水平,能够反映细胞内自噬流的变化,是自噬定量分析的可靠方法。 展开更多
关键词 雷帕霉素 自噬 人胚肾细胞 LC3 单荧光gfp-LC3质粒 双荧光mRFP-e gfp-LC3
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