鹅星状病毒ORF2蛋白多克隆抗体制备及鉴定

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作者 赵忠麒 邹蒙蒙 +5 位作者 张芸菁 何丽霞 武松山 张欣欣 杨桂君 李广兴 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第1期368-377,共10页

【目的】采用原核表达系统表达鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)ORF2蛋白,并制备其兔抗多克隆抗体,为该病毒致病机制和诊断方法研究提供物质基础。【方法】构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-ORF2,并通过PCR和双酶切对重组质粒鉴定后,... 【目的】采用原核表达系统表达鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)ORF2蛋白,并制备其兔抗多克隆抗体,为该病毒致病机制和诊断方法研究提供物质基础。【方法】构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-ORF2,并通过PCR和双酶切对重组质粒鉴定后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导蛋白表达并优化反应条件,获得GAstV ORF2蛋白。利用纯化的GAstV ORF2蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗GAstV ORF2多克隆抗体。采用间接ELISA法测定多克隆抗体效价,通过Western blotting和间接免疫荧光(IFA)法检测多克隆抗体的免疫原性和特异性;为了明确GAstV在雏鹅组织中的嗜性和定位,利用制备的多克隆抗体,通过免疫组织化学(IHC)法检测感染雏鹅肝脏和肾脏组织中的病毒分布情况。【结果】PCR和双酶切鉴定表明成功构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-ORF2,通过原核表达成功获得GAstV ORF2蛋白,纯化后蛋白浓度为1.38 mg/mL。免疫新西兰大白兔后获得兔抗GAstV ORF2蛋白多克隆抗体,其效价达1∶100000。Western blotting结果显示,多克隆抗体与纯化后GAstV ORF2蛋白出现特异性反应条带;IFA结果显示,多克隆抗体与GAstV及真核表达GAstV ORF2蛋白产生特异性反应;IHC检测结果显示,GAstV在感染雏鹅的肝脏与肾脏广泛分布,GAstV特异性表达于实质细胞与炎性细胞的胞浆内。【结论】本研究成功构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-ORF2,并进行体外诱导表达制备了兔抗GAstV ORF2蛋白多克隆抗体,该多克隆抗体效价高、特异性强,可用于GAstV感染雏鹅体内病毒抗原检测。 展开更多

关键词 鹅星状病毒(gastv) ORF2蛋白 原核表达 多克隆抗体

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鹅星状病毒Ⅰ型与Ⅱ型双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：1

2

作者 姚展杏 王超 +6 位作者 林寅盛 赵丹 张嘉家 伍辉吉 朱婉君 张济培 陈济铛 《中国家禽》 北大核心 2025年第1期64-70,共7页

为建立一种快速检测鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)Ⅰ型(GAstV-1)与Ⅱ型(GAstV-2)的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GAstV-1的ORF1a特异保守序列与GAstV-2的ORF2特异保守序列分别设计1对引物,将PCR扩增的两个片... 为建立一种快速检测鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)Ⅰ型(GAstV-1)与Ⅱ型(GAstV-2)的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GAstV-1的ORF1a特异保守序列与GAstV-2的ORF2特异保守序列分别设计1对引物,将PCR扩增的两个片段分别克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒作为阳性质粒标准品,建立检测并鉴别GAstV-1与GAstV-2的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行评估,并运用该方法对28份疑似痛风雏鹅临床样品进行检测。结果显示:建立的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR方法检测GAstV-1、GAstV-2的标准曲线相关系数均在0.99以上,批间、批内重复变异系数均小于0.7%,最低检测限度均为10 copies/μL;该方法对鸭肝炎病毒、禽流感病毒、鹅细小病毒均无特异性扩增,同时检测GAstV-1与GAstV-2未出现交叉反应;该方法检测28份临床样品的GAstV阳性率为92.8%,其中GAstV-1和GAstV-2均为阳性的有6份,仅GAstV-2阳性的有18份,仅GAstV-1阳性的有2份。研究表明,建立的荧光定量PCR检测方法可用于GAstV-1与GAstV-2的鉴别检测,并且当前引发GAstV感染的主要病原依然是GAstV-2,GAstV-1和GAstV-2混合感染情况也同时存在。 展开更多

关键词 鹅星状病毒 gastv-1 gastv-2 双重荧光定量PCR 雏鹅 痛风

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鹅星状病毒研究进展

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作者 王文硕 蒋奇森 +3 位作者 周曙光 陈立功 王学静 许利军 《北方牧业》 2025年第19期8-8,共1页

2017年开始,山东、江苏、安徽、四川、黑龙江等地区鹅群流行由鹅星状病毒(GAstV)感染引起的雏鹅痛风。病鹅以精神萎靡不振、采食量显著减少,排出如石灰水样稀便为临床特征;剖检特征为肾脏肿胀,输尿管、皮下、肌肉表面、心脏、肝脏、脾... 2017年开始,山东、江苏、安徽、四川、黑龙江等地区鹅群流行由鹅星状病毒(GAstV)感染引起的雏鹅痛风。病鹅以精神萎靡不振、采食量显著减少,排出如石灰水样稀便为临床特征;剖检特征为肾脏肿胀,输尿管、皮下、肌肉表面、心脏、肝脏、脾脏、跗关节腔等部位出现白色尿酸盐沉积。近年来,关于GAstV的相关研究较多,但许多问题仍亟待解决。本文总结了GAstV的病原学、流行病学、致病机制、GAstV感染的诊断、疫苗研发现状等,以期为雏鹅痛风的科学防控提供参考。 展开更多

关键词 雏鹅痛风 流行病学 gastv 鹅星状病毒 病原学

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1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定 被引量：11

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作者 刘莉 顾玲玲 +3 位作者 张硕 谢军 朱善元 王安平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第1期368-374,共7页

【目的】利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒(Goose astrovirus 1,GAstV-1)结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a(... 【目的】利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒(Goose astrovirus 1,GAstV-1)结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1∶128000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。【结论】原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。 展开更多

关键词 1型鹅星状病毒(gastv-1) ORF2基因 原核表达 多克隆抗体

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小鹅瘟病毒、鹅星状病毒Ⅰ型与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断及病原分析 被引量：5

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作者 张晓战 邢忠玉 +10 位作者 吕楠楠 董轩志 李育林 毛天绩 梁尧涵 郭运泽 宋予震 乔宏兴 边传周 袁野 梁群超 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1183-1193,共11页

【目的】2023年4月,河南新乡某地鹅场雏鹅群急性发病,死亡率高达25%,为确定引起该鹅场雏鹅发病的病因,本研究对送检的病死雏鹅进行剖检和实验室诊断。【方法】无菌采集病死雏鹅肝脏、脾脏、肾脏和小肠等组织样品及心血和肝脏外层纤维素... 【目的】2023年4月,河南新乡某地鹅场雏鹅群急性发病,死亡率高达25%,为确定引起该鹅场雏鹅发病的病因,本研究对送检的病死雏鹅进行剖检和实验室诊断。【方法】无菌采集病死雏鹅肝脏、脾脏、肾脏和小肠等组织样品及心血和肝脏外层纤维素性渗出物,通过对心血及肝脏外层纤维素性渗出物样品进行细菌分离培养、革兰染色镜检观察、16S rRNA基因及药物敏感性试验鉴定病鹅感染细菌及感染菌株的药物敏感性情况;通过PCR/RT-PCR方法对其常见雏鹅病毒性传染病病原核酸进行检验,并对阳性病原的主要结构蛋白基因进行测序分析,确定病鹅感染的病毒性病原及其分子流行病学情况。【结果】细菌学试验结果显示,分离菌株在血平板上呈半透明圆形突起、边缘整齐、表面光滑菌落,形态学观察显示,该菌为单个和成对的革兰阴性短杆菌,符合鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的特性。16S rRNA基因扩增测序与BLAST分析进一步证实该菌为RA。药敏试验结果显示,该菌株对头孢曲松和头孢噻肟敏感,对阿莫西林、四环素和多黏菌素B耐药。常见雏鹅病毒性传染病病原核酸PCR/RT-PCR检测发现,该鹅场样品小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)和鹅星状病毒Ⅰ型(genotypeⅠGoose astrovirus,GAstV-1)核酸呈阳性,GAstV-2、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)和鹅呼肠孤病毒(Goose reovirus,GRV)核酸阴性,将致病毒株分别命名为GPV/HN-2023和GAstV-1/HN-2023。进一步对GPV/HN-2023和GAstV-1/HN-2023的主要结构蛋白基因分析发现,GPV/HN-2023与DY-16株的亲缘关系较近,属于DY-16-like毒株,且VP3蛋白存在2个特有的氨基酸位点突变D248E和V314L;GAstV-1/HN-2023与GAstV-1毒株亲缘关系较近,属于GAstV-1分支,ORF2蛋白存在3个特有的氨基酸位点突变G47R、S207G和A628T。【结论】本研究通过综合诊断方法明确了GPV、GAstV-1与RA混合感染是引起该鹅场雏鹅发病的病因,分析了致病菌RA的耐药性和病毒性致病原GPV和GAstV-1的遗传演化及变异特点,为河南地区雏鹅疫病的科学防控提供理论参考。 展开更多

关键词 小鹅瘟病毒(GPV) 鹅星状病毒Ⅰ型(gastv-1) 鸭疫里默氏杆菌 混合感染 病原分析

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鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：15

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作者 白彩霞 张达 +6 位作者 赵靓 杨侃侃 王小朋 李新路 李锦春 李永东 王勇 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第3期634-638,共5页

为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、... 为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×101拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。 展开更多

关键词 鹅星状病毒 SYBR Green I荧光定量RT-PCR 检测

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基因1型鹅星状病毒VP27蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定 被引量：1

7

作者 向勇 李林林 +6 位作者 张俊勤 董嘉文 黄允真 翟颀 徐志宏 廖明 孙敏华 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期2576-2584,共9页

【目的】制备可特异性识别基因1型鹅星状病毒(Goose astrovirus genotype 1,GAstV-1)且与GAstV-2不发生交叉反应的多克隆抗体,以期为后续GAstV-1免疫检测技术的建立提供材料。【方法】通过比对GAstV-1与GAstV-2衣壳蛋白的氨基酸序列以... 【目的】制备可特异性识别基因1型鹅星状病毒(Goose astrovirus genotype 1,GAstV-1)且与GAstV-2不发生交叉反应的多克隆抗体,以期为后续GAstV-1免疫检测技术的建立提供材料。【方法】通过比对GAstV-1与GAstV-2衣壳蛋白的氨基酸序列以寻找其差异较大的区域作为靶基因。对GAstV-1 GDYJ-21-01株VP27基因密码子进行偏嗜性优化合成,构建原核表达质粒pCZN1-GAstV-1 VP27,转化大肠杆菌Top10感受态细胞以诱导表达VP27蛋白;将纯化后的VP27蛋白免疫新西兰白兔后收获抗血清以制备GAstV-1 VP27多克隆抗体,通过间接ELISA和SDS-PAGE分析该纯化抗体的效价和纯度,并利用间接免疫荧光试验(IFA)检测多克隆抗体的特异性。【结果】试验成功构建重组质粒pCZN1-GAstV-1 VP27;SDS-PAGE显示其表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA试验结果显示,纯化后的GAstV-1 VP27多克隆抗体效价高达1∶9 841 500,纯度高于85%。IFA结果显示,GAstV-1 VP27多克隆抗体可特异性识别GAstV-1,且与GAstV-2无交叉反应。临床病料组织检测结果显示,GAstV-1核酸阳性的病料组织均可出现特异性荧光,而GAstV-2核酸阳性且GAstV-1核酸阴性的病料组织未出现荧光。【结论】本研究获得了高效价且可特异性识别GAstV-1(与GAstV-2无交叉反应)的VP27多克隆抗体,为建立鉴别诊断GAstV-1的抗原免疫检测技术奠定了基础。 展开更多

关键词 1型鹅星状病毒(gastv-1) VP27 原核表达 多克隆抗体

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Ⅱ型鹅星状病毒VP27蛋白生物信息学分析

8

作者 蒋欣芫 吴晓艳 +4 位作者 曹章 赵静 张旭 于天浩 张彦龙 《中国动物检疫》 CAS 2024年第3期96-101,共6页

为探究Ⅱ型鹅星状病毒(GAstⅤ-Ⅱ)VP27蛋白的结构和功能,运用生物信息学软件,对具有良好免疫原性的GAstⅤ-ⅡZYL02株进行分析。通过Expasy-ProtParam、PSORTⅡPrediction、ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM 2.0和SOPMA等在线软件预测分析V... 为探究Ⅱ型鹅星状病毒(GAstⅤ-Ⅱ)VP27蛋白的结构和功能,运用生物信息学软件,对具有良好免疫原性的GAstⅤ-ⅡZYL02株进行分析。通过Expasy-ProtParam、PSORTⅡPrediction、ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM 2.0和SOPMA等在线软件预测分析VP27蛋白的生物学特性,运用BepiPred-2.0、ABCpred、IEDB、ToxinPred2和VaxiJenv2.0等在线软件预测分析VP27蛋白的B细胞抗原表位,从中筛选出优势抗原表位;使用Phyre2在线软件对VP27蛋白进行建模,运用PyMOL软件准确定位预测的优势表位在模型中的分布。结果显示:VP27蛋白是不稳定的亲水蛋白,其亚细胞定位位于细胞质,无跨膜结构域和信号肽;二级、三级结构中无规卷曲平均占比为41.91%,延伸链平均占比为29.05%,α螺旋平均占比为22.41%,β转角平均占比为6.64%;共预测出26条B细胞抗原表位,筛选出4条B细胞优势抗原表位,分别位于26~41aa(FGIPQADSRSRYNANI)、48~57 aa(RGRTSTSFTL)、111~126 aa(TSTGGQITELRNRLNI)、174~189 aa(PVLINWSVSDSQEQYN);三级结构定位发现,4条优势B细胞表位均位于该蛋白表面。结果表明,GAstⅤ-ⅡVP27蛋白有多处可诱导体液免疫的潜在位点。本研究运用生物信息学分析方法预测了GAstⅤ-ⅡVP27蛋白的理化性质和结构,对进一步深入研究VP27蛋白功能,研发相应疫苗具有重要指导意义。 展开更多

关键词 鹅星状病毒 VP27蛋白 抗原表位 生物信息学 疫苗研发

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新型鹅星状病毒衣壳蛋白原核表达及多克隆抗体制备

9

作者 高冬生 张菡 +7 位作者 王海燕 张晓战 赵盼盼 于彤彤 宋幸辉 乔宏兴 李庆东 彭志锋 《河南农业科学》 北大核心 2024年第4期137-142,共6页

为了研制针对新型鹅星状病毒(GAstV)的血清学检测方法和高效抗体,克隆新型GAstV HNZZ-4毒株的ORF2基因序列,构建pET-32a-Cap重组质粒,进行衣壳蛋白(Cap)原核表达;用重组Cap蛋白免疫兔只制备多克隆抗体,并采用Western blot和免疫过氧化... 为了研制针对新型鹅星状病毒(GAstV)的血清学检测方法和高效抗体,克隆新型GAstV HNZZ-4毒株的ORF2基因序列,构建pET-32a-Cap重组质粒,进行衣壳蛋白(Cap)原核表达;用重组Cap蛋白免疫兔只制备多克隆抗体,并采用Western blot和免疫过氧化物酶单层试验鉴定制备的多克隆抗体的反应原性。结果表明,重组质粒pET-32a-Cap经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切后,得到大小约5000 bp和750 bp的2个与预期一致的条带;阳性重组质粒测序结果显示,成功构建了重组表达载体pET-32a-Cap;pET-32a-Cap原核表达获得了分子质量约为27.5 ku的GAstV重组Cap蛋白;制备的兔抗GAstV Cap多克隆抗体能够与重组Cap蛋白发生特异性反应,且能特异性结合感染LMH细胞的GAstV。综上,制备的兔源抗新型GAstV Cap多克隆抗体保留了抗原性,特异性较好。 展开更多

关键词 鹅星状病毒 衣壳蛋白 原核表达 多克隆抗体

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鹅星状病毒辽宁株分离鉴定及遗传变异分析与抗原表位预测 被引量：1

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作者 周慧 高慎阳 +8 位作者 李冰 董筱萍 孙弋雅 刘英姿 甄志刚 赵岩 刘丽颖 车立忱 周铁忠 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期2243-2250,共8页

从辽宁某鹅场无菌采集病死雏鹅肝脏、肾脏等病料,通过鹅胚接种、核酸检测、电镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对所分离的毒株进行遗传变异分析和抗原表位预测。经过接种病料鹅胚的病变特征观察、病毒PCR核酸扩增和序列分析以及透射... 从辽宁某鹅场无菌采集病死雏鹅肝脏、肾脏等病料,通过鹅胚接种、核酸检测、电镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对所分离的毒株进行遗传变异分析和抗原表位预测。经过接种病料鹅胚的病变特征观察、病毒PCR核酸扩增和序列分析以及透射电镜形态鉴定,确认成功分离到1株GAstV(goose astrovirus),暂命名GAstV/LN/202101(简称LN202101)。针对编码衣壳蛋白保守结构域N和P2 Capsid domain的核苷酸序列对该毒株进行遗传进化树和同源性分析,结果显示该毒株与江西株JX01(MZ576222.1)等近2年发现的毒株亲缘关系较近,在同一簇分支,且属于GAstV-Ⅱ型;但同源性已表现出差异。以HAstV(human astrovirus)已验证表位为参考,依据抗原抗体结合模型,结合生信方法推测以下4段序列可能为GAstV的抗原表位:453~467aa(PQADSRSRYNANITF)、508~513aa(VCNTLA)、525~553aa(TAVLRVNTSTTSTGGQITELRNRLNIADG)和585~597aa(DSNPGETFQSFKM)。结果表明,GAstV辽宁流行株与国内其他地区为同一来源,但已发生变异;辽宁株衣壳蛋白部分抗原优势表位较多,可以作为近2年流行毒株的代表。该研究结果为进一步明确该病毒遗传进化特点和抗原特征,开发相应亚单位疫苗和抗体等生物防控制品奠定了基础。 展开更多

关键词 鹅星状病毒 辽宁分离株 变异分析 抗原表位

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鹅星状病毒RT-PCR检测方法的建立 被引量：8

11

作者 李阳 刘英姿 +5 位作者 李阁锦 曹祁峰 王家英 舒秀伟 周铁忠 高慎阳 《现代畜牧兽医》 2021年第4期1-4,共4页

为建立一种鉴定鹅星状病毒(GAstV)的RT-PCR方法,试验根据GenBank中GAstV ORF1b基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD18-T-GAstV,以其作为标准品建立GAstV的RT-PCR检测方法。通过对GAstV及其他4种病毒进行检测,优化其反应条件并进... 为建立一种鉴定鹅星状病毒(GAstV)的RT-PCR方法,试验根据GenBank中GAstV ORF1b基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD18-T-GAstV,以其作为标准品建立GAstV的RT-PCR检测方法。通过对GAstV及其他4种病毒进行检测,优化其反应条件并进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。结果显示,除GAstV外,鹅细小病毒(GPV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸡病毒性关节炎(AVAV)、坦布苏病毒(TmuV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的RT-PCR检测方法的最低检出限可达5.5×103,敏感性较高;重复性试验显示其重复性良好。利用该方法对10份人工模拟病料进行检测限LOD分析,阳性样品10倍系列稀释浓度。结果表明,最低检出限可达1.21×103copies/μL。研究表明,成功建立了一种鉴定GAstV的RT-PCR方法,且该方法具有快速、廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点,可用于GAstV的临床诊断。 展开更多

关键词 鹅星状病毒 RT-PCR ORF1b基因 检测

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