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链球菌GapC基因重组痘苗病毒的构建及筛选与鉴定 被引量:1
1
作者 李国华 李贞 +4 位作者 乔军 陈创夫 才学鹏 孟庆玲 丁波 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期41-45,53,共6页
为了研制链球菌性奶牛乳房炎的有效疫苗,首先用PCR方法扩增出停乳链球菌的GapC基因。其次将GapC基因连接到pSC11穿梭质粒上,构建pSC11-GapC重组穿梭质粒。然后在脂质体的介导下将pSC11-GapC转染已感染痘苗病毒的BHK-21细胞,使之与痘苗... 为了研制链球菌性奶牛乳房炎的有效疫苗,首先用PCR方法扩增出停乳链球菌的GapC基因。其次将GapC基因连接到pSC11穿梭质粒上,构建pSC11-GapC重组穿梭质粒。然后在脂质体的介导下将pSC11-GapC转染已感染痘苗病毒的BHK-21细胞,使之与痘苗病毒基因在BHK-21细胞内进行同源重组,得到GapC重组痘苗病毒,用rVV-GapC表示。最后用蓝斑法连续筛选5次rVV-GapC重组毒,再用PCR和Western blot分别检测rVV-GapC的重组和表达情况。结果显示,PCR电泳检测到目的条带,测序结果与GenBank公布的标准序列同源性99%,Western blot试验证明GapC蛋白在重组毒中进行了表达。rVV-GapC构建成功。重组痘苗病毒的构建为链球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究奠定基础。 展开更多
关键词 gapc基因 pSC11质粒 pSC11-gapc 痘苗病毒 rVV-gapc
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金黄色葡萄球菌重组GapC蛋白的GAPDH活性及免疫原性分析 被引量:9
2
作者 朱洪伟 朱战波 +3 位作者 崔玉东 张晶 刘乐锋 朴范泽 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期754-759,共6页
为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表面GapC蛋白的GAPDH活性、免疫原性及免疫保护作用,应用PCR方法扩增出S.aureus的gapC基因,插入到pQE-30载体相应位点,构建重组质粒pQE/gapC。将其导入宿主菌E.coliM15(pREP4)后,IPTG诱导... 为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表面GapC蛋白的GAPDH活性、免疫原性及免疫保护作用,应用PCR方法扩增出S.aureus的gapC基因,插入到pQE-30载体相应位点,构建重组质粒pQE/gapC。将其导入宿主菌E.coliM15(pREP4)后,IPTG诱导表达。重组蛋白纯化后进行GAPDH活性检测,并与灭活全菌体分别免疫健康家兔。然后,应用ELISA方法检测血清中IgG抗体水平及IFN-γ、IL-4细胞因子浓度,并用1.0×108CFU/mLS.aureus菌株Wood46对免疫家兔攻毒。SDS-PAGE结果显示,GapC蛋白在E.coliM15(pREP4)中获得表达;经GAPDH活性检测及WesternBlot检测,重组蛋白具有较高的GAPDH活性和抗原特异性;经ELISA检测,GapC蛋白及全菌体组兔血清中IgG抗体水平迅速升高,并在加强免疫后第28天达到最高(1:64000),加强免疫后第14d,血清中细胞因子IFN-γ和IL-4浓度与对照组相比,显著升高(P<0.05),而全菌体免疫组升高不明显(P>0.05);攻毒结果为蛋白免疫组家兔获得一定的免疫保护(4/5)。以上结果表明,表达的重组GapC蛋白具有GAPDH活性、较好的免疫原性及免疫保护力,可作为深入研究S.aureus基因工程疫苗的良好靶向。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 gapc蛋白 GAPDH活性 免疫原性 免疫保护
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金黄色葡萄球菌GapC蛋白与鼠伤寒沙门氏菌Flic融合蛋白的构建与免疫原性研究 被引量:3
3
作者 赵达 王鹤 +7 位作者 梁宏儒 胡旭 姜东君 尹辉 高佳滨 陈为宏 乔波 朱战波 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期250-254,共5页
目的探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimurium)鞭毛蛋白融合蛋白的免疫保护作用。方法将纯化的Flic-GapC融合蛋白背部皮下接种免疫小白鼠,间隔3周免疫两次... 目的探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimurium)鞭毛蛋白融合蛋白的免疫保护作用。方法将纯化的Flic-GapC融合蛋白背部皮下接种免疫小白鼠,间隔3周免疫两次。应用间接ELISA方法测定小鼠血清中IgG抗体滴度;在二次免疫后2周,分离小鼠脾脏淋巴细胞,进行淋巴细胞增殖实验,利用Elispot方法检测IFN-γ和IL-4特异性分泌细胞;在二免后3周,用S.aureus Wood46株对免疫小鼠进行腹腔注射攻毒,观察1周并记录小鼠死亡数目。结果融合蛋白能够诱导小鼠产生特异性的免疫应答,二免后14d血清中IgG抗体滴度达到最高(1∶64 000),淋巴细胞刺激指数、分泌IFN-γ和IL-4的细胞数与对照组相比升高(P<0.05),对S.aureus的保护率达到70%。结论 Flic-GapC融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护作用,可作为S.aureus的疫苗靶向进行深入研究。 展开更多
关键词 gapc蛋白 鞭毛蛋白 融合蛋白 免疫保护作用
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停乳链球菌GapC_(1-150aa)蛋白单克隆抗体的制备及其线性表位鉴定 被引量:3
4
作者 张丽萌 周雪 +17 位作者 魏玉华 樊自尧 汤炜 代建 杨轩 张建新 杨汐静 刘道龙 王成 王健南 于永忠 吴志军 于立权 孙虎男 马金柱 宋佰芬 朱战波 崔玉东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期875-880,共6页
链球菌GapC蛋白是表达于各种链球菌的膜蛋白,具有良好的免疫原性。为研制预防链球菌感染的表位疫苗和研发以单克隆抗体(MAb)为基础的检测试剂盒,本研究利用表达的停乳链球菌GapC蛋白aa1~aa150片段制备了3株MAbs,并利用噬菌体展示... 链球菌GapC蛋白是表达于各种链球菌的膜蛋白,具有良好的免疫原性。为研制预防链球菌感染的表位疫苗和研发以单克隆抗体(MAb)为基础的检测试剂盒,本研究利用表达的停乳链球菌GapC蛋白aa1~aa150片段制备了3株MAbs,并利用噬菌体展示技术对这3株MAbs的抗原表位进行分析,获得一个线性表位1377HDILDG142。该研究不仅有助于了解链球菌GapC的免疫保护作用机制,也有助于进一步研究表位疫苗和建立检测方法。 展开更多
关键词 停乳链球菌 gapc 单克隆抗体 B细胞抗原表位
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金黄色葡萄球菌GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及其活性 被引量:2
5
作者 赵达 王鹤 +7 位作者 梁宏儒 胡旭 姜东君 高佳滨 尹辉 陈为宏 乔波 朱战波 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第2期168-171,176,共5页
目的在大肠埃希菌中融合表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白,并检测其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性。方法采用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙... 目的在大肠埃希菌中融合表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白,并检测其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性。方法采用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flic基因和S.Aureus GapC基因,通过overlap PCR将这两段基因拼接并克隆至载体pQE30a,构建重组表达质粒pQE30-flic-GapC,将重组表达质粒转化E.coli XL-blue,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析试剂盒纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析,并检测其GAPDH活性。结果重组表达质粒pQE30-flic-GapC经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达产物相对分子质量约95 000,最佳诱导表达时间为5 h,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的31.4%;纯化产物可与小鼠抗S.aureus全菌体多抗血清和抗鼠伤寒沙门菌全菌体多抗血清发生特异性反应,GAPDH活性为(0.337±0.019)。结论成功表达并纯化了具有较高生物学活性的flic-GapC融合蛋白,为S.aureus亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 鼠伤寒沙门菌 gapc蛋白 鞭毛蛋白 融合蛋白
原文传递
奶牛乳房炎性乳房链球菌GapC重组蛋白的免疫保护性研究 被引量:7
6
作者 张辉 陈伟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期810-812,共3页
为研究奶牛乳房炎性乳房链球菌GapC蛋白的免疫保护性,本研究采用纯化后的GapC重组蛋白与免疫佐剂乳化后制备疫苗,免疫家兔后采用间接ELISA法检测抗体效价,并以小鼠为实验动物进行攻毒试验。结果显示,抗体效价高达1∶128 000,GapC蛋白免... 为研究奶牛乳房炎性乳房链球菌GapC蛋白的免疫保护性,本研究采用纯化后的GapC重组蛋白与免疫佐剂乳化后制备疫苗,免疫家兔后采用间接ELISA法检测抗体效价,并以小鼠为实验动物进行攻毒试验。结果显示,抗体效价高达1∶128 000,GapC蛋白免疫组对乳房链球菌的保护率较高,达70%,而全菌体免疫组的保护率仅为30%,表明GapC蛋白具有很高的免疫原性,为奶牛乳房炎的预防控制和进一步研究有效疫苗提供实验依据。 展开更多
关键词 奶牛乳房炎 乳房链球菌 gapc蛋白 免疫保护
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基于GapC基因链球菌DNA疫苗构建及其免疫效果 被引量:2
7
作者 杜海燕 张霞 +2 位作者 程振涛 周碧君 文明 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第4期32-35,共4页
应用PCR方法扩增出链球菌GapC基因后,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,经PCR和双酶切鉴定后,将重组质粒pcDNA3.1-GapC转染Vero细胞,观察目的基因表达情况,并免疫小鼠检测其血清抗体水平和攻毒保护效果,结果重组质粒pcDNA3.1-GapC经PCR和... 应用PCR方法扩增出链球菌GapC基因后,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,经PCR和双酶切鉴定后,将重组质粒pcDNA3.1-GapC转染Vero细胞,观察目的基因表达情况,并免疫小鼠检测其血清抗体水平和攻毒保护效果,结果重组质粒pcDNA3.1-GapC经PCR和双酶切后,均可得到与预期大小(1 011 bp和5 500 bp)一致的DNA片段,测序显示该片段确为链球菌GapC基因;转染Vero细胞后,荧光抗体试验观察,证实重组质粒pcDNA3.1-GapC得到有效的表达;免疫接种小鼠后,14 d即可检测到抗GapC蛋白抗体,35 d时抗体水平达到峰值,之后逐渐下降但维持较高的抗体水平,与对照组差异极显著(P<0.01);链球菌2型培养物攻击后,免疫组小鼠呈现的临床症状轻且恢复快、病变仅局限在肝脏和肾脏上,脾脏带菌量为3.05 lg,与对照组小鼠存在显著差异(P<0.05)。结果表明,成功构建了基于GapC基因的链球菌DNA疫苗,该疫苗可诱导小鼠产生高水平的血清抗体,并能减轻链球菌感染对小鼠的危害作用,具有较好的保护效果。 展开更多
关键词 链球菌 gapc基因 DNA疫苗 构建 免疫效果
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基于nrDNA GapC基因内含子序列的资源冷杉遗传多样性研究 被引量:3
8
作者 韦范 唐绍清 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期729-734,共6页
通过nrDNAGapC基因内含子序列的测序和分析,揭示资源冷杉遗传多样性水平和种群分化的强弱并推断其进化历史。资源冷杉3个种群的34个个体共获得70条GapC基因内含子序列,有8个核苷酸变异位点,鉴别出12种单倍型。银竹老山、大院和舜黄山种... 通过nrDNAGapC基因内含子序列的测序和分析,揭示资源冷杉遗传多样性水平和种群分化的强弱并推断其进化历史。资源冷杉3个种群的34个个体共获得70条GapC基因内含子序列,有8个核苷酸变异位点,鉴别出12种单倍型。银竹老山、大院和舜黄山种群分别有10种、6种和7种单倍型;有7个个体得到了2种以上的单倍型。资源冷杉物种水平的单倍型多样性(h)为0.817 0,种群的在0.683 3~0.883 1之间;物种水平的核苷酸多样性(π)为0.003 90,种群的在0.002 63~0.003 82之间。种群遗传分化研究结果(Gst=0.103,p〈0.05)说明种群间存在显著的遗传分化,分子方差分析(AMOVA)结果也证明虽然大多数的核苷酸多态性(88.64%,p〈0.001)来源于种群内个体间的变异,但是仍有显著性比例存在种群间(11.36%,p〈0.05)。Tajima’s D、Fu&Li’s D、Fu&Li’s Fs中性检验结果都表明资源冷杉在物种和种群水平上都不拒绝中性进化。资源冷杉单倍型的谱系没有出现地区特异性谱系分支,核苷酸不配对分析(mismatch analysis)结果表明没有发生近期的群体扩张,资源冷杉的Nst(0.131)与Gst(0.103)没有显著性差异(p〉0.05),表明种群没有明显的地理结构。推测现存资源冷杉是相对较近的时间内片断化的产物。 展开更多
关键词 资源冷杉 gapc基因内含子 遗传多样性 遗传分化
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抗停乳链球菌GapC_(1-150aa)单克隆抗体的制备及生物活性 被引量:4
9
作者 魏玉华 张丽萌 +6 位作者 周雪 樊自尧 于永忠 吴志军 孙虎男 于立权 崔玉东 《黑龙江八一农垦大学学报》 2016年第1期53-58,87,共7页
为了深入研究停乳链球菌Gap C蛋白的抗原性,用原核表达的Gap C免疫优势片段—Gap C1-150aa蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备获得3株抗停乳链球菌Gap C1-150aa蛋白不同表位的单克隆抗体1F2、1E11和5B7。经鉴定确定,3株单抗均Ig G1... 为了深入研究停乳链球菌Gap C蛋白的抗原性,用原核表达的Gap C免疫优势片段—Gap C1-150aa蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备获得3株抗停乳链球菌Gap C1-150aa蛋白不同表位的单克隆抗体1F2、1E11和5B7。经鉴定确定,3株单抗均Ig G1亚型,其轻链均为κ链,3株单克隆抗体均能与停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的Gap C发生特异性反应而不与其他细菌蛋白发生反应,均具有显著的调理活性,并且具有一定的被动免疫保护作用。 展开更多
关键词 停乳链球菌 gapc 单克隆抗体
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金黄色葡萄球菌GapC基因的克隆和表达 被引量:4
10
作者 张晶 朱洪伟 崔玉东 《黑龙江八一农垦大学学报》 2008年第3期50-53,共4页
为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)GapC蛋白,应用PCR方法扩增出S.aureus菌株BMSA/855/23-1的gapC基因,随后将其克隆到pMD18-T载体上。重组克隆pMD-T/gapC经测序后,与GenBank上已发表的序列进行对比分析。然后,将gap... 为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)GapC蛋白,应用PCR方法扩增出S.aureus菌株BMSA/855/23-1的gapC基因,随后将其克隆到pMD18-T载体上。重组克隆pMD-T/gapC经测序后,与GenBank上已发表的序列进行对比分析。然后,将gapC基因插入到pQE-30质粒,构建重组质粒pQE30/gapC。重组质粒转化大肠杆菌E.coli M15(pREP4),IPTG诱导后,SDS-PAGE鉴定GapC融合蛋白的表达。结果表明成功扩增并克隆了S.aureus gapC,该菌株的gapC基因与GenBank上S.aureus BM10株的核苷酸序列一致性为99.3%,推导氨基酸序列一致性为99.4%。SDS-PAGE结果表明,GapC蛋白在E.coli M15(pREP4)中获得表达。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 gapc蛋白 克隆 表达
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乳房链球菌GAPC基因的克隆及原核表达 被引量:3
11
作者 褚明亮 陈创夫 +1 位作者 刘君 曹旭东 《动物医学进展》 CSCD 2008年第6期58-61,共4页
为了重组表达乳房链球菌表面脱氢酶GAPC基因,为免疫学研究提供目标蛋白,用PCR方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出GAPC基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a(+)-GAPC。用BL21(DE3)/pET系统表达Trix-GAPC融合... 为了重组表达乳房链球菌表面脱氢酶GAPC基因,为免疫学研究提供目标蛋白,用PCR方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出GAPC基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a(+)-GAPC。用BL21(DE3)/pET系统表达Trix-GAPC融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果表明,PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中乳房链球菌(AF421900.1)GAPC的基因序列同源性为99%。SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET-32a(+)-GAP总蛋白中出现一条分子质量为55ku的新蛋白带。Western blot分析显示,GAPC蛋白可与乳房链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。该研究已成功表达了GAPC,为GAPC在细菌致病中作用的研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。 展开更多
关键词 乳房链球菌 表面脱氢酶gapc 原核表达
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新疆南疆地区奶牛乳房链球菌gapC基因原核表达载体的构建 被引量:2
12
作者 张辉 焦海宏 陈伟 《塔里木大学学报》 2012年第2期7-13,共7页
为获得乳房链球菌(Streptococcus uberis)gapC基因的原核表达载体,通过PCR方法扩增出新疆南疆地区奶牛乳房链球菌临床分离株的gapC基因,并克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a(+)-gapC,将重组质粒转化宿主菌E.coli BL2... 为获得乳房链球菌(Streptococcus uberis)gapC基因的原核表达载体,通过PCR方法扩增出新疆南疆地区奶牛乳房链球菌临床分离株的gapC基因,并克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a(+)-gapC,将重组质粒转化宿主菌E.coli BL21进行重组蛋白的表达。实验结果表明,IPTG诱导5~9 h均可获得大量重组蛋白。重组蛋白分子量约为54.0 kD,介于43 kD~66.2 kD之间,与预期大小一致,说明表达载体构建成功。通过优化最佳诱导条件,获得乳房链球菌gapC基因重组蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L IPTG诱导6 h即可获得大量重组蛋白,为进一步确定蛋白的免疫保护性和制备疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 乳房链球菌 gapc基因 原核表达
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3种奶牛乳房炎链球菌的gapC基因原核表达及其免疫原性研究 被引量:3
13
作者 王凤 汤德元 +2 位作者 宋立 宁宜宝 张纯萍 《养殖与饲料》 2013年第6期10-15,共6页
为研究引起奶牛乳房炎的病原菌停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因工程疫苗及其生物免疫活性,试验采用PCR方法扩增出停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因cDNA序列,克隆到pMD18-T载体上,将重组质粒pMD18-T-TRgapC、... 为研究引起奶牛乳房炎的病原菌停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因工程疫苗及其生物免疫活性,试验采用PCR方法扩增出停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因cDNA序列,克隆到pMD18-T载体上,将重组质粒pMD18-T-TRgapC、pMD18-T-WRgapC和pMD18-T-RFgapC经双酶切鉴定、测序及序列分析后,再将gapC基因亚克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,构建停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因原核表达质粒pET-28-TRgapC、pET-28-WRgapC和pET-28-RFgapC;将构建好的原核表达质粒转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳、纯化、复性后经Western blot检测,得到了约38 ku的条带,与预期大小相符。说明这3种蛋白有一定的免疫原性。 展开更多
关键词 奶牛乳房炎 停乳链球菌 无乳链球菌 乳房链球菌 gapc基因 原核表达 免疫原性
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链球菌GaPc基因检测及其序列分析
14
作者 杜海燕 李霞云 +3 位作者 程振涛 文明 周碧君 王开功 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第5期70-73,共4页
根据已发表的猪链球菌2型3-磷酸甘油醛脱氢酶(Gapc)基因保守区域设计并合成1对特异性引物,对10株不同来源链球菌Gapc基因进行PCR扩增,并选择PCR产物进行克隆并测序分析,结果在10株不同来源链球菌菌株中有8株可扩增出与预期大小(1011 bp... 根据已发表的猪链球菌2型3-磷酸甘油醛脱氢酶(Gapc)基因保守区域设计并合成1对特异性引物,对10株不同来源链球菌Gapc基因进行PCR扩增,并选择PCR产物进行克隆并测序分析,结果在10株不同来源链球菌菌株中有8株可扩增出与预期大小(1011 bp)相一致的DNA片段;选取4株细菌PCR产物进行克隆测序,发现其片段大小为1009或1012bp,与GenBank参考菌株Gapc基因序列的核苷酸同源性为85.3%~98.3%,氨基酸同源性为87.2%~99.4%;生物学软件分析结果显示Gapc基因在链球菌属细菌中相对保守,且具有较多的潜在抗原表位。本研究为链球菌检测技术和核酸疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 链球菌 gapc基因 检测 序列分析
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GAPC2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量:1
15
作者 田霞 代其林 +4 位作者 龚元亚 孙英坤 谢琳 杨娟 王劲 《吉林农业(学术版)》 2011年第4期63-64,共2页
研究采用PCR法以拟南芥cDNA为模板扩增GAPC2基因片段,克隆至原核表达载体PET28a(+)上,经0.25、0.5mM IPTG分别在37℃和20℃诱导后,再使用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达水平。结果表明:原核表达载体PET28a(+)-GAPC2构建正确,并且能在... 研究采用PCR法以拟南芥cDNA为模板扩增GAPC2基因片段,克隆至原核表达载体PET28a(+)上,经0.25、0.5mM IPTG分别在37℃和20℃诱导后,再使用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达水平。结果表明:原核表达载体PET28a(+)-GAPC2构建正确,并且能在大肠杆菌BL21中成功表达,其融合蛋白分子量为37KD。 展开更多
关键词 gapc2 大肠杆菌BL21 IPTG 融合蛋白
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奶牛乳房炎链球菌GapC蛋白的生物信息学分析与重组表位疫苗设计 被引量:4
16
作者 孔智翔 刘祥 +5 位作者 殴莎莎 刘成艳 同韩虎 陈春琳 陈琛 吴三桥 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第4期824-831,共8页
为设计奶牛乳房炎链球菌GapC蛋白的多表位串联疫苗,进一步提高GapC蛋白的免疫效果,采用DNAMAN、MEGA软件分析GapC的同源性与系统发生,结果显示,不同种类链球菌亲缘关系均较近,尤其是与奶牛乳房炎有关的链球菌亲缘关系更近。利用在线软... 为设计奶牛乳房炎链球菌GapC蛋白的多表位串联疫苗,进一步提高GapC蛋白的免疫效果,采用DNAMAN、MEGA软件分析GapC的同源性与系统发生,结果显示,不同种类链球菌亲缘关系均较近,尤其是与奶牛乳房炎有关的链球菌亲缘关系更近。利用在线软件预测GapC为亲水性蛋白,存在多个酶切位点;采用Signal P 4.1与TMHMM Server v.2.0软件预测GapC无信号肽和跨膜结构,定位于细胞表面;SOPMA服务器预测GapC二级结构中含无规则卷曲30.36%,α-螺旋33.93%,β-转角12.50%,β-片层23.21%。采用Swiss-Model预测的GapC三级结构与二级结构相符。利用ABCpred和Bepi Pred方案,预测GapC存在5个B细胞表位。运用神经网络与量化矩阵法预测GapC具有1个CTL表位。使用MHC-Ⅱ类分子结合肽在线程序预测显示GapC具有1个Th表位。采用DNASTAR Protean软件重组GapC抗原表位,设计获得抗原性较好的GapC重组表位多肽。 展开更多
关键词 奶牛乳房炎 链球菌 gapc蛋白 蛋白结构 细胞表位
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乳房链球菌GapC蛋白的表达及其B细胞抗原表位的预测与鉴定 被引量:5
17
作者 王汉青 张雪静 +3 位作者 张欢 陈晓萌 张宝江 苏艳 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期148-159,共12页
乳房链球菌Streptococcus uberis的GapC蛋白是一种位于该菌表面的具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白,其参与细胞活动,表现出多种生物学活性,此外还具有良好的抗原性。文中旨在对乳房链球菌GapC蛋白可能的B细胞抗原表位进行预测,分析和... 乳房链球菌Streptococcus uberis的GapC蛋白是一种位于该菌表面的具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白,其参与细胞活动,表现出多种生物学活性,此外还具有良好的抗原性。文中旨在对乳房链球菌GapC蛋白可能的B细胞抗原表位进行预测,分析和验证候选表位肽的免疫原性。利用S. uberis分离株RF5-1克隆gapC基因,构建重组表达质粒pET-28a-GapC,诱导表达GapC重组蛋白,并以纯化蛋白免疫家兔,获得抗GapC多抗。利用生物信息学软件预测并分析GapCB细胞抗原表位的三维结构和空间位置及对GapC蛋白及表位的同源性比较。结果表明,表达纯化了44kDa的GapC蛋白具有良好的反应性。利用表位预测软件筛选并合成针对S.uberisGapC蛋白的6个线性和3个构象优势B细胞表位多肽,三维结构的分析显示,筛选的多肽具有良好的抗原表位形成条件。以纯化的S.uberis GapC蛋白免疫家兔制备多抗,通过间接ELISA对抗原表位进行鉴定。ELISA检测结果显示,9条抗原表位肽均可不同程度地与抗GapC多抗反应,其中表位^(266)AANDSYGYTEDPIVSSD^(282)与多抗反应水平显著高于其他表位。研究结果为深入了解S.uberis GapC蛋白的免疫学特性和利用其有效抗原表位奠定了基础。 展开更多
关键词 乳房链球菌 gapc蛋白 原核表达 B细胞表位 表位多肽
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小麦TaGAPC定点突变体基因载体构建及其原核表达 被引量:2
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作者 郭子平 翟清华 +2 位作者 曾令锋 邓西平 杨淑慎 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2016年第1期46-50,共5页
为了研究催化活性半胱氨酸Cys154、Cys158残基对小麦细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Ta GAPC)蛋白酶活性的影响,利用重叠延伸PCR法分别将这2个位点的半胱氨酸突变成丝氨酸,并分别连入p ET28a(+)原核表达载体。在25℃条件下,Ta GAPC及其定点... 为了研究催化活性半胱氨酸Cys154、Cys158残基对小麦细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Ta GAPC)蛋白酶活性的影响,利用重叠延伸PCR法分别将这2个位点的半胱氨酸突变成丝氨酸,并分别连入p ET28a(+)原核表达载体。在25℃条件下,Ta GAPC及其定点基因Ta Cys154S/Ta Cys158S经0.25 mmol/L IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示,目标重组蛋白均为可溶性且大小约为40 k Da,与预测结果一致。在此基础上,经超声波破菌及镍柱纯化获得3种纯化重组蛋白。这为后续Ta GAPC及其定点突变体蛋白酶活性测定及活性位点分析提供试验材料。 展开更多
关键词 Ta gapc 重叠延伸PCR 定点突变 原核表达 蛋白纯化
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GAPC和AT2G36580在油菜不同组织器官中的表达差异及其与雄性不育的关系 被引量:1
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作者 周锦 董彩华 +3 位作者 刘学群 覃瑞 石磊 刘胜毅 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期157-161,共5页
基于油菜纯合双显性雄性核不育恢复系的芯片表达谱分析结果,本文选择与糖代谢途径相关的两个基因GAPC和AT2G36580,采用荧光定量PCR方法对其在根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊、角果中的表达模式进行分析。结果表明,GAPC和AT2G36580在根、茎... 基于油菜纯合双显性雄性核不育恢复系的芯片表达谱分析结果,本文选择与糖代谢途径相关的两个基因GAPC和AT2G36580,采用荧光定量PCR方法对其在根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊、角果中的表达模式进行分析。结果表明,GAPC和AT2G36580在根、茎、叶、花和角果中均有表达,其中在根中表达量最高,花中表达量最低;GAPC在不育株花蕾发育的减数分裂至单核期被显著抑制,三核期表达量上升,而在可育株花蕾减数分裂至单核期表达量较高,四分体至单核期表达量最高(是减数分裂期的5.06倍),三核期表达量下降;AT2G36580在不育株花蕾发育中一直被抑制,但在可育株花蕾减数分裂至单核期表达量较高,四分体至单核期表达量最高(是减数分裂期的1.69倍),三核期表达量显著下降。进一步对雌雄蕊中的表达量进行分析表明,这两个基因均在可育植株雄蕊中表达量高,分别是不育株雌蕊(参照)的9.11倍和4.47倍,在雌蕊中表达量比参照显著低;与参照比,在不育株雌雄蕊中表达被显著抑制。初步结果表明GAPC和AT2G36580在油菜恢复系J10中具有相似的表达模式,可能是通过影响雄蕊发育过程中的糖代谢而参与花蕾发育的调控,与不育有密切关系。 展开更多
关键词 甘蓝型油菜 细胞核雄性不育 gapc AT2G36580 荧光定量PCR 糖代谢
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基于金黄色葡萄球菌FnBPA和停乳链球菌GapC的多表位疫苗免疫原性研究 被引量:7
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作者 马骏 王然 +8 位作者 刘硕 王欣 段旭阳 陈晶 杨思宇 王丽 刘慧婷 范钊伟 崔玉东 《黑龙江八一农垦大学学报》 2021年第1期60-67,114,共9页
金黄色葡萄球菌和链球菌是奶牛乳腺炎的重要致病菌,为了研究预防金黄色葡萄球菌和链球菌感染的奶牛乳腺炎新型疫苗,以金黄色葡萄球菌FnBPA的1个CD4^(+)T细胞表位和两个B细胞表位构建了FTB1B2表位疫苗,以停乳链球菌GapC的1个CD4^(+)T细... 金黄色葡萄球菌和链球菌是奶牛乳腺炎的重要致病菌,为了研究预防金黄色葡萄球菌和链球菌感染的奶牛乳腺炎新型疫苗,以金黄色葡萄球菌FnBPA的1个CD4^(+)T细胞表位和两个B细胞表位构建了FTB1B2表位疫苗,以停乳链球菌GapC的1个CD4^(+)T细胞表位和两个B细胞表位构建了GTB1B2表位疫苗,再以GSGSGS作为Linker,串联FTB1B2与GTB1B2构建了表位疫苗FG;串联了FnBPA的CD4^(+)T细胞表位FT和GapC的CD4^(+)T细胞表位GT构建了表位疫苗FGT。通过免疫接种BALB/c小鼠评价疫苗的免疫原性。结果显示,FT、GT和FGT仅能诱导细胞免疫应答,并不能显著抑制金黄色葡萄球菌或停乳链球菌在肝、脾、肺、肾各器官的定殖数;FG诱导细胞和体液免疫应答能力显著高于GT、FGT和GST,显著低于FTB1B2和GTB1B2;FG免疫小鼠各器官细菌定殖数显著低于FT、GT、FGT和GST,显著高于FTB1B2和GTB1B2,但能够同时抑制金黄色葡萄球菌和停乳链球菌在各器官的定殖。结果表明,研究构建的FG表位疫苗能够诱导良好的免疫应答,并能同时抑制攻毒小鼠器官中金黄色葡萄球菌和停乳链球菌的定殖。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 停乳链球菌 FnBPA gapc 表位疫苗
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