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金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达 被引量：3
1
作者 李磊 杨远柱 +4 位作者 刘泓 杜长青 林建中 朱咏华 刘选明 《生命科学研究》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期230-237,共8页
利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得FvGDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-FvGDH,利用Gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDESTl7-FvGDH,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过IPTG法诱导表达... 利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得FvGDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-FvGDH,利用Gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDESTl7-FvGDH,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过IPTG法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,融合蛋白相对分子质量约为53 kD,与预测的一致.最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导4 h.融合蛋白表达量较高,实现了FvGDH的高效表达,并利用Western blotting对其特异性进行鉴定.FvGDH基因高效原核表达体系的成功建立,为进一步研究FvGDH的酶促动力学奠定了基础. 展开更多
关键词 fvgdh Gateway克隆 原核表达 SDS-PAGE WESTERN BLOTTING
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