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类半胱氨酸蛋白酶FpMca3参与假禾谷镰孢的致病力
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作者 陈琳琳 苏增青 +5 位作者 姬小雅 刘新月 刘家瑶 张时雨 邢小萍 李洪连 《生物技术通报》 北大核心 2025年第11期272-281,共10页
【目的】探究类半胱氨酸蛋白酶FpMca3在假禾谷镰孢致病过程中的生物学功能,为解析病原菌致病的分子机制提供依据,并为病害防控提供潜在的药物靶标。【方法】利用PCR和RT-PCR扩增假禾谷镰孢中的FpMcas基因,通过RT-qPCR分析FpMca3在病原... 【目的】探究类半胱氨酸蛋白酶FpMca3在假禾谷镰孢致病过程中的生物学功能,为解析病原菌致病的分子机制提供依据,并为病害防控提供潜在的药物靶标。【方法】利用PCR和RT-PCR扩增假禾谷镰孢中的FpMcas基因,通过RT-qPCR分析FpMca3在病原菌侵染阶段的表达。借助生物信息手段分析FpMca3的结构域、系统进化关系和序列相似度。利用split-PCR方法构建FpMca3的敲除盒,并通过PEG介导的原生质体转化方法转化假禾谷镰孢野生型菌株。利用潮霉素抗性筛选和PCR检测获得FpMca3缺失突变体(Δfpmca3)。构建pKNTG-FpMca3重组载体,导入Δfpmca3突变体中,获得FpMca3回补的菌株(Δfpmca3-C)。在PDA培养基上测定假禾谷镰孢不同菌株的生长速率,在CMC培养液中测定分生孢子的产生,利用无菌水刺激分生孢子萌发测定萌发率。通过小麦胚芽鞘和大麦叶片接种以及盆栽试验测定假禾谷镰孢不同菌株的致病力。利用原核表达和蛋白纯化检测FpMca3蛋白的完整性。【结果】根据在假禾谷镰孢基因组中鉴定到的4个包含Peptidase_C14结构域的候选metacaspase蛋白,在假禾谷镰孢基因组中仅扩增到FpMca1、FpMca2和FpMca3的基因和开放阅读框序列。蛋白序列分析发现FpMca1和FpMca2是真菌中保守的Ⅰ型metacaspase,FpMca3与细菌的metacaspase结构域类似,是真菌中一种新型半胱氨酸蛋白酶。FpMca3在假禾谷镰孢侵染阶段诱导表达,对其基因缺失和回补菌株的表型测定发现,假禾谷镰孢野生型、Δfpmca3和Δfpmca3-C菌株的菌丝生长、分生孢子产生和萌发无显著差异,而与野生型和回补菌株相比,Δfpmca3对大麦叶片和小麦胚芽鞘的致病力显著降低,引起的小麦茎基腐病症状明显减轻。原核表达获得的FpMca3具有两条蛋白带,暗示其具有自切酶活性。【结论】类半胱氨酸蛋白酶FpMca3参与假禾谷镰孢的致病力,且具有自切酶活性。 展开更多
关键词 假禾谷镰孢 半胱氨酸蛋白酶 fpmca3 致病力
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