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基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒变异株EP402R基因质粒标准物质研制
1
作者 叶家美 穆颖 +14 位作者 张媛 张晶晶 周梦棋 史莉圆 姜怀玉 毕一鸣 邢薿文 朱远茂 赵东明 倪建强 顾小雪 翟新验 李琦 王传彬 刘玉良 《病毒学报》 2025年第6期1918-1931,共14页
针对我国目前缺乏基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)变异株EP402R基因(编码CD2v蛋白)核酸标准物质现状,本研究研制了含不同拷贝数浓度的基因Ⅱ型ASFV变异株EP402R基因强阳性、阳性和弱阳性质粒标准物质。通过分子... 针对我国目前缺乏基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)变异株EP402R基因(编码CD2v蛋白)核酸标准物质现状,本研究研制了含不同拷贝数浓度的基因Ⅱ型ASFV变异株EP402R基因强阳性、阳性和弱阳性质粒标准物质。通过分子生物学技术构建基因Ⅱ型ASFV变异株EP402R基因质粒,制备含不同拷贝数浓度的质粒标准物质。采用芯片式数字PCR(cdPCR)进行精确定值,并对其进行纯净性、特异性、均匀性及稳定性等检验和质量评估,确保其满足实际应用要求。结果表明,所研制的标准物质核酸分子拷贝数浓度分别为3.31×10^(4)拷贝/μL、3.14×10^(3)拷贝/μL和1.77×10^(2)拷贝/μL,该标准物质纯净、均匀、特异、稳定;在-20℃、4℃、25℃和37℃条件下,该标准物质可分别稳定保存至少12个月、4个月、14d和9d;经10次反复冻融后仍稳定;将该标准物质模拟运输至广州、上海和新疆后,稳定性未发生变化;基质效应和检测方法互通性评估结果显示,该标准物质在cdPCR与荧光定量PCR(qPCR)检测方法间表现出较好的一致性,在试用上与临床样本间具有良好的互通性。合作定值和试用结果显示,所制备的标准物质量值准确。综上所述,本研究所研制的标准物质具有良好的纯净性、均匀性和稳定性,定量精确,适用于不同场景下基因Ⅱ型ASFV变异株核酸检测,为ASFV变异株早期诊断和防控等提供可靠技术支撑,助力提升我国ASF诊断和防控技术水平。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 基因Ⅱ型 变异株 ep402r基因 标准物质 稳定性
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越南北部6省2020年~2021年非洲猪瘟病毒的遗传演化分析 被引量：1
2
作者 阮氏璧凤 李标 +4 位作者 袁海峰 胡庭俊 邓武黄 长英德 韦英益 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期452-457,479,共7页
非洲猪瘟病毒(ASFV)自2019年在越南被发现以来,迅速在越南全国范围内传播。为了解ASFV在越南北部的流行及其流行株的遗传变异情况,本研究采集越南北部6省的250份疑似ASFV感染病死猪的组织病料样品,采用荧光定量PCR(qPCR)方法检测ASFV,... 非洲猪瘟病毒(ASFV)自2019年在越南被发现以来,迅速在越南全国范围内传播。为了解ASFV在越南北部的流行及其流行株的遗传变异情况,本研究采集越南北部6省的250份疑似ASFV感染病死猪的组织病料样品,采用荧光定量PCR(qPCR)方法检测ASFV,进一步采用PCR扩增ASFV阳性组织样品中的B646L(p72)基因、EP402R(CD2v)基因和I73R~I329L基因的IGR区域,并测序后采用DNAStar 7.0的MegAlign软件比对分析上述3种基因序列的同源性;每个省均选取10份阳性样品的B646L基因和EP402R基因序列分别构建系统进化树,并对I73R~I329L基因的IGR区进行核苷酸差异分析。结果显示,250份组织样品均为ASFV阳性,本研究获得的所有B646L基因和EP402R基因之间的同源性均达100%,与GenBank中ASFV相应基因序列的同源性分别为95.1%~100%、66.9%~99.7%,其中B646L基因与中国ASFV分离株相应基因序列的同源性最高,与2012年乌干达ASFV分离株该基因序列的同源性最低,而与EP402R基因序列的同源性最高的是格鲁吉亚、俄罗斯ASFV分离株,同源性最低的是葡萄牙ASFV分离株。基于B646L和EP402R基因构建的遗传进化树结果均显示,本研究获得的上述基因均与中国、格鲁吉亚ASFV分离株相应基因的亲缘性更近,属于基因型II,血清型SG8。对IGR区的I73R~I329L基因进行核苷酸差异分析结果显示,在2020年采集的ASFV阳性样品属于ASFV的IGR II型变异体,至少有IGR I和IGR II型2种ASFV在越南传播。本研究揭示了越南早期ASFV的变化,对预防ASFV的传播具有重要的参考意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 B646L基因 ep402r基因 I73R~I329L基因
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非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型的双重实时荧光定量PCR检测方法建立 被引量：3
3
作者 常昊 邱英武 +10 位作者 彭杰 高琦 宋泽布 陈洋 李薇 林丽苗 曹雪珍 周庆丰 张桂红 李群辉 郑泽中 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4428-4432,共5页
随着基因Ⅰ型非洲猪瘟(GenotypeⅠASFV)在我国开始流行,使我国对ASF的诊断、预防和控制更具挑战性。本研究使用中国动物疾病预防控制中心(CADC)推荐使用的B646L引物与探针,结合针对GenotypeⅠASFV EP402R基因保守特异性区域设计引物与探... 随着基因Ⅰ型非洲猪瘟(GenotypeⅠASFV)在我国开始流行,使我国对ASF的诊断、预防和控制更具挑战性。本研究使用中国动物疾病预防控制中心(CADC)推荐使用的B646L引物与探针,结合针对GenotypeⅠASFV EP402R基因保守特异性区域设计引物与探针,建立了一种在诊断ASF的同时可对ASFV进行GenotypeⅠASFV鉴别的快速检测方法,并对其灵敏性、特异性进行检测。结果显示,该方法具有良好的灵敏性以及特异性,可有效用于ASFV的临床诊断以及GenotypeⅠASFV的监测。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 基因Ⅰ型ASFV 实时荧光定量PCR ep402r B646 L
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鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的三重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4
4
作者 宋影影 刘英楠 +6 位作者 刘建奇 谢振华 于婉琪 吕璐 钟秋萍 宋庆庆 陈鸿军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期939-945,共7页
为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L、EP402R、MGF360-13L基因序列,分别设计PCR引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,并进行重复性试验、特异性试验、敏感性试验... 为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L、EP402R、MGF360-13L基因序列,分别设计PCR引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,并进行重复性试验、特异性试验、敏感性试验与临床样品检测,建立三重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示,以B646L、EP402R和MGF360-13L重组质粒为标准品绘制的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数(R^(2))分别为0.995、0.997和0.997;建立的方法与多种猪常见病原不存在交叉反应,特异性良好;对B646L、MGF 360-13L与EP402R基因的检测下限均为10^(2.5) copies/μL,变异系数均<2%,该方法灵敏度高;当临床样品稀释至10^(-5)时,即滴度为10^(2.5)TCID_(50)/mL时仍能检测到病毒粒子,具有较高的临床使用价值。本研究建立了一种高效、灵敏、特异的ASFV分子检测方法,对ASF风险预警具有重要意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 B646L ep402r MGF360-13L TAQMAN探针 荧光定量PCR
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非洲猪瘟病毒CD2v重组蛋白真核表达及单克隆抗体的制备
5
作者 王雨佳 迟立超 +3 位作者 徐黎晖 李宝春 梁臻妮 陈西钊 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第2期151-157,共7页
本研究目的为表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白作为抗原,制备鼠源性CD2v单克隆抗体。以ASFV-SY18分离株为模板合成EP402R基因,构建pcDNA3.1-His真核表达载体,通过Expi-CHO表达系统获得重组CD2v蛋白,应用细胞融合技术制备杂交瘤细胞并筛选出单... 本研究目的为表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白作为抗原,制备鼠源性CD2v单克隆抗体。以ASFV-SY18分离株为模板合成EP402R基因,构建pcDNA3.1-His真核表达载体,通过Expi-CHO表达系统获得重组CD2v蛋白,应用细胞融合技术制备杂交瘤细胞并筛选出单克隆抗体细胞株。实验结果显示,截短EP402R基因成功克隆至表达载体,构建出pcDNA3.1-CD2v-His质粒,转染至CHO细胞后收获重组蛋白,使用镍亲和层析法纯化带有His标签的CD2v蛋白。经SDS-PAGE及Western blot确认,CD2v蛋白大小为55 kDa且与免疫小鼠血清反应良好。共筛选出3株杂交瘤细胞株分别命名为2D6、4B2及4G12。间接ELISA鉴定3株杂交瘤细胞所制备的腹水效价均高达1∶12800,Western blot及间接免疫荧光实验证明3株单克隆抗体均可特异性识别重组CD2v蛋白。本研究成功制备了CD2v重组蛋白及其特异性单克隆抗体,为开发竞争性ELISA诊断方法及ASFV野毒鉴定奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 真核表达 单克隆抗体 ep402r基因 CD2v重组蛋白
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非洲猪瘟病毒CD2v胞外区蛋白的真核表达及其单克隆抗体的制备与功能分析 被引量：1
6
作者 魏泽良 涂凯 +7 位作者 张萌萌 王学军 陈国江 冯健男 王升启 石艳春 王晶 郑源强 《军事医学》 CAS CSCD 2023年第5期346-352,共7页
目的利用真核表达系统制备非洲猪瘟病毒(ASFV)CD2v分子N端胞外区融合蛋白,并作为抗原免疫和筛选特异性识别CD2v单克隆抗体。方法以pcDNA3.1-CD2v-HA质粒(含ASFV-BA71v株EP402R基因全长编码序列和HA标签)为模板,扩增CD2v蛋白胞外区碱基序... 目的利用真核表达系统制备非洲猪瘟病毒(ASFV)CD2v分子N端胞外区融合蛋白,并作为抗原免疫和筛选特异性识别CD2v单克隆抗体。方法以pcDNA3.1-CD2v-HA质粒(含ASFV-BA71v株EP402R基因全长编码序列和HA标签)为模板,扩增CD2v蛋白胞外区碱基序列,构建真核表达载体pcDNA3.1-N-CD2v-His,通过Expi-293表达系统获得重组N-CD2v-His蛋白。将纯化后的蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤细胞技术制备特异识别CD2v分子单克隆抗体,对获得的抗体经酶联免疫吸附实验(ELISA)、Western印迹以及间接免疫荧光等方法进行鉴定。结果N-CD2v-His融合蛋白基因被成功构建到真核表达载体上,转染Expi-293F细胞收获重组蛋白,纯蛋白经SDS-PAGE分析发现,N-CD2v-His融合蛋白条带呈高度糖基化修饰的梯状分布。用该融合蛋白免疫小鼠,经杂交瘤细胞筛选,获得2株高亲合活性单克隆抗体,2株抗体经间接ELISA、Western印迹及免疫荧光实验等检测均能特异识别糖基化修饰的CD2v全长蛋白。结论成功制备了抗CD2v特异性单克隆抗体,为进一步开发新型ASFV抗原检测或治疗方法奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 单克隆抗体 CD2v蛋白 真核表达系统 ep402r基因 抗体鉴定
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