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鸭短喙矮小综合征病毒单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立
1
作者 朱小丽 王劭 +5 位作者 董慧 程晓霞 江丹丹 肖世峰 陈少莺 陈仕龙 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第2期948-958,共11页
【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法,为SBDSV抗体检测及诊断试剂盒研发提供技术支撑。【方法】本研究用纯化的SBDSV M15株灭活毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠... 【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法,为SBDSV抗体检测及诊断试剂盒研发提供技术支撑。【方法】本研究用纯化的SBDSV M15株灭活毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,利用间接ELISA筛选可分泌SBDSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用筛选出的杂交瘤细胞接种小鼠制备腹水。通过间接ELISA测定单克隆抗体效价,通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和胶乳凝集(latex particle agglutination,LPA)试验鉴定单克隆抗体特性。通过中和试验测定单克隆抗体中和活性,使用试剂盒鉴定单克隆抗体亚类。运用棋盘滴定法优化反应体系,建立基于SBDSV单克隆抗体的竞争ELISA检测方法。通过检测阴性血清确定该方法的临界值。对建立的竞争ELISA检测方法进行特异性、灵敏性和重复性测定。用该方法检测临床血清样品,并与胶乳凝集抑制(latex particle agglutination inhibition,LPAI)试验结果进行比对。【结果】经间接ELISA筛选,获得3株稳定分泌SBDSV单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为D5-3、G11-23和H2-27。间接ELISA结果显示,3株杂交瘤细胞D5-3、G11-23和H2-27培养上清的抗体效价分别为1∶2~6、1∶2~5和1∶2~6,腹水的抗体效价分别为1∶10~5、1∶10~4和1∶10~6。IFA结果显示,单克隆抗体D5-3、G11-23和H2-27均具有较好的结合活性,可用于IFA检测。LPA试验结果显示,仅单克隆抗体H2-27具有致敏胶乳的特性。中和试验结果显示,3株单克隆抗体均具有中和SBDSV的能力,其中单克隆抗体H2-27的中和活性最强。单克隆抗体亚类鉴定结果显示,单克隆抗体D5-3和G11-23均为IgG1,H2-27为IgM。以纯化的SBDSV(M15株)灭活毒作为包被抗原,单克隆抗体H2-27为竞争抗体,建立了一种检测SBDSV抗体的竞争ELISA方法,当抑制率(PI)≥23.70%时,判定为SBDSV抗体阳性;PI≤15.91%时判定为阴性。该方法特异性好,与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、鸭源副黏病毒(Duck paramyxovirus,DPMV)、鸭肝炎病毒1型(Duck hepatitis virus-1,DHV-1)和鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)阳性血清均无交叉反应;敏感性高,高免血清(LPAI效价1∶2~8)1∶25600稀释时仍为阳性;批间、批内重复性好,变异系数均<6%。竞争ELISA检测结果与LPAI结果具有良好的正相关性,二者的符合率为89.10%(188/211)。【结论】本研究成功制备3株SBDSV单克隆抗体,基于单克隆抗体H2-27建立的竞争ELISA方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可高通量检测SBDSV抗体,为监测SBDSV在中国的流行情况及雏鸭母源抗体水平评价提供技术支撑。 展开更多
关键词 鸭 短喙矮小综合征病毒(SBDSV) 单克隆抗体 竞争elisa
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ELISA试验室内质控框架构建方法改进初探
2
作者 段友斌 王瑞 +6 位作者 常乐 邱昌文 李志强 陈庚瑞 杨婧涓 何清 王露楠 《中国输血杂志》 2026年第1期103-108,共6页
目的对9家血站实验室室内质控数据进行统计分析,提出改进ELISA试验室内质控框架构建方法的参考建议,并进行验证。方法1)收集9家血站室内质控数据,以某国产HBsAg ELISA检测试剂为例进行分析;2)比较血站1各批次室内质控值是否存在差异;3)... 目的对9家血站实验室室内质控数据进行统计分析,提出改进ELISA试验室内质控框架构建方法的参考建议,并进行验证。方法1)收集9家血站室内质控数据,以某国产HBsAg ELISA检测试剂为例进行分析;2)比较血站1各批次室内质控值是否存在差异;3)统计分析9家血站室内质控批次使用情况、使用批次数、使用天数、质控次数、各批次均值和变异系数;4)采用改进的ELISA试验室内质控框架构建方法,构建血站1和血站9各批次室内质控的临时框架和固定框架,并对离群值进行判定。结果1)ELISA试验各批次室内质控数据有差异(P<0.01),宜更换质控品和试剂时均更换质控框架。2)9家血站之间使用的质控品和试剂批号、每批次质控次数、相同批号质控值差异较大,宜由各实验室单独建立室内质控框架。3)改进ELISA试验室内质控框架构建方法为:使用框架平移,即预实验均值和上一批次累积变异系数构建临时框架,如该批次使用时间≥20 d且质控数据≥20点,则累积20 d至少20个点后,汇集计算在控数据累积质控均值和标准差构建固定框架。使用该方法构建的临时框架和固定框架,判定血站1和血站9室内质控26个极端离群值均为失控。218个一般离群值,除10个被临时框架判定为正常外,其余均判定为警告和失控,能够有效监控试验稳定性。结论根据不同规模血站室内质控情况的统计分析结果,结合ELISA试验的特性、试剂质控品批间的不稳定性,建议在更换质控品或试剂批号时重新构建质控图,以框架平移建立临时框架,以累计数据计算固定框架,适用于不同规模血站实验室,能够对ELISA试验过程稳定性进行有效控制。 展开更多
关键词 elisa试验 室内质控 质控框架 血站实验室
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腐败梭菌α毒素单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立
3
作者 马祎芳 赵佳慧 +4 位作者 马清龙 高鹏程 曾巧英 李学瑞 储岳峰 《中国兽医杂志》 北大核心 2026年第2期31-39,共9页
为方便临床上检测腐败梭菌血清样本,以及评价腐败梭菌疫苗对动物的免疫效果,本试验利用大肠杆菌表达系统诱导α毒素重组蛋白的表达,经纯化后免疫BALB/c小鼠,制备α毒素单克隆抗体。以筛选的单抗为捕获抗体,通过棋盘滴定法优化反应条件,... 为方便临床上检测腐败梭菌血清样本,以及评价腐败梭菌疫苗对动物的免疫效果,本试验利用大肠杆菌表达系统诱导α毒素重组蛋白的表达,经纯化后免疫BALB/c小鼠,制备α毒素单克隆抗体。以筛选的单抗为捕获抗体,通过棋盘滴定法优化反应条件,建立腐败梭菌α毒素抗体的竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,利用该方法检测绵羊血清样本的阴阳性临界值,并评估其重复性、灵敏度、特异性和符合率,同时检测牛血清样本的阴阳性临界值。结果显示,成功诱导表达和纯化出约65 kDa的目的蛋白;通过杂交瘤技术筛选获得1株稳定分泌特异性抗体的单抗8H2;竞争ELISA最佳抗原包被条件为300 ng/孔、16 h,血清稀释度为1∶1,单抗稀释度为1∶2000,封闭条件为1%牛血清白蛋白(BSA)、90 min,血清和单抗竞争时间为90 min,二抗稀释度为1∶15000、孵育30 min,显色时间为15 min;该方法检测绵羊血清样本的阳性临界值为27.19%,阴性临界值为22.59%;批间和批内变异系数均低于10%,重复性良好;标准阳性血清稀释度为1∶16时仍为阳性;与产气荚膜梭菌、布鲁氏菌和鼠伤寒沙门菌均无交叉反应,特异性良好;利用该方法检测100份绵羊血清样本,与间接ELISA的检测总符合率为89.00%(89/100);检测牛血清样本的阳性临界值为20.00%,阴性临界值为16.30%。本试验成功制备了1株腐败梭菌α毒素特异性单抗,并构建了抗体竞争ELISA检测方法,为腐败梭菌病的早期诊断和疫苗免疫效果评价提供了技术支撑。 展开更多
关键词 腐败梭菌 Α毒素 单克隆抗体 竞争elisa
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基于RdRp蛋白的兔出血症病毒感染与免疫鉴别诊断ELISA方法的建立
4
作者 朱薇 仇汝龙 +7 位作者 陈萌萌 胡波 魏后军 范志宇 葛雷 伍孟婷 宋艳华 王芳 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第1期414-422,共9页
为建立区别兔出血症病毒(RHDV)感染与疫苗免疫的诊断ELISA方法,本研究通过原核表达系统表达RHDV1和RHDV2 RdRp蛋白,成功纯化获得这两种可溶性RdRp蛋白,并以RdRp蛋白作为包被抗原,建立检测抗RdRp血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,经纯... 为建立区别兔出血症病毒(RHDV)感染与疫苗免疫的诊断ELISA方法,本研究通过原核表达系统表达RHDV1和RHDV2 RdRp蛋白,成功纯化获得这两种可溶性RdRp蛋白,并以RdRp蛋白作为包被抗原,建立检测抗RdRp血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,经纯化和酶切后,获得不含标签蛋白的RdRp蛋白,约为57 ku。经Western blot验证,2种RdRp蛋白均与RHDV1或RHDV2感染血清发生特异性反应且无型别间差异。因此,选择RHDV2-RdRp作为包被抗原,包被浓度为2.5μg·mL^(-1);最佳血清稀释度为1∶100,孵育时间为37℃60 min;酶标抗体的最佳稀释度为1∶10000;临界值为0.225。经验证,该ELISA方法具有较好的特异性和敏感性;其批内、批间重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的稳定性。通过对RHDV攻毒后样本及基因工程疫苗免疫后血清样本进行检测。结果显示,RHDV感染后可以诱导机体产生针对RdRp蛋白的血清抗体,而基因工程疫苗免疫后血清检测为阴性。本研究基于RHDV-RdRp蛋白所建立的ELISA方法可以对基因工程疫苗免疫和RHDV感染进行区分,为筛查RHDV的临床感染提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp) 间接elisa
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基于牛病毒性腹泻病毒核心蛋白C间接ELISA抗体检测方法的建立
5
作者 贾东鹭 阮武营 +11 位作者 刘飞飞 李星仪 杨澳飞 尹波 陈慧敏 陈建 魏颖 何雷 余祖华 马雪连 丁轲 陈松彪 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期63-70,共8页
为建立基于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C的间接ELISA检测方法,通过PCR扩增出BVDV C基因,克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-C,经IPTG诱导表达纯化后免疫BABL/c小鼠制备多克隆抗体,以C蛋白为包被抗原,建立间接ELISA检... 为建立基于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C的间接ELISA检测方法,通过PCR扩增出BVDV C基因,克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-C,经IPTG诱导表达纯化后免疫BABL/c小鼠制备多克隆抗体,以C蛋白为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,pET-32a-C重组质粒构建成功,重组C蛋白大小约为30 k Da,能够以可溶形式表达,30℃、0.8 mmol/L IPTG诱导6 h可溶性表达最佳;该蛋白免疫BABL/c小鼠后制备血清抗体效价为1∶128000,能够特异性识别C蛋白。该ELISA检测方法的最适条件为:0.5μg/m L抗原37℃包被2 h,10 g/L BSA溶液37℃封闭3 h,1∶16000稀释血清孵育2 h,二抗孵育40 min,避光显色10 min,阴阳性临界值判定标准为0.224,具有良好的特异性和重复性。利用本方法对未免疫接种的疑似BVDV感染的牛血清进行检测,与RT-qPCR核酸检测方法相比,二者阳性符合率达94.73%。上述结果表明,基于C蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为BVDV临床诊断及开发基于C蛋白的间接ELISA检测试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 核心蛋白C 原核表达 多克隆抗体 间接elisa
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牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立
6
作者 赵嘉豪 李树凡 +4 位作者 薛凤 王君 张灿 刘文华 徐守振 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期56-62,共7页
为了制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体及建立抗原捕获ELISA检测方法,采用大肠杆菌原核表达的BVDV Erns截短蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后利用细胞融合和杂交瘤筛选,选用效价高的单克隆抗体,通过条件优化建立BVDV抗原捕获ELISA检测方法... 为了制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体及建立抗原捕获ELISA检测方法,采用大肠杆菌原核表达的BVDV Erns截短蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后利用细胞融合和杂交瘤筛选,选用效价高的单克隆抗体,通过条件优化建立BVDV抗原捕获ELISA检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行了验证,并与IDEXX商品化试剂盒及RT-PCR进行临床样品符合。结果显示,获得2株效价较高的Ig G1型单克隆抗体杂交瘤细胞2B3、2B10,轻链均为κ链。选用效价更高的2B10单克隆抗体作为检测抗体,家兔源BVDV多克隆抗体作为捕获抗体,建立的BVDV抗原捕获ELISA与临床常见病原(牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛支原体)无交叉反应,最低可检测102.53TCID50的BVDV病毒液,批内和批间变异系数均低于5%,与IDEXX试剂盒和RT-PCR的总体符合率分别为91.76%~93.33%和94.12%~96.67%。结果表明,基于2B10单克隆抗体建立的BVDV抗原捕获ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为BVDV的检测和防控提供了借鉴和技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 Erns蛋白 单克隆抗体 elisa
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动物源弯曲杆菌免疫显性抗原鉴定及间接ELISA检测方法的建立
7
作者 杨欢 王策 +6 位作者 王玉飞 赵晶 张会强 曹易博 姬钰浩 邓兴梅 张辉 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第3期1418-1433,共16页
【目的】筛选胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)血清免疫显性抗原,初步建立动物弯曲杆菌病血清学ELISA诊断方法。【方法】利用生物信息学分析软件对候选抗原进行分析筛选,用pET-28a(+)原核表达载... 【目的】筛选胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)血清免疫显性抗原,初步建立动物弯曲杆菌病血清学ELISA诊断方法。【方法】利用生物信息学分析软件对候选抗原进行分析筛选,用pET-28a(+)原核表达载体构建重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白。通过SDS-PAGE和His标签抗体Western blotting检测蛋白表达情况。制备兔源弯曲杆菌多克隆抗体并将其作为Western blotting一抗验证抗原与多克隆抗体反应原性。建立间接ELISA检测方法,优化抗原包被浓度、封闭液及封闭时间、一抗和二抗稀释度及反应时间等反应条件,确定临界值,评价其特异性、灵敏性、重复性。【结果】利用生物信息学分析软件筛选出胎儿弯曲杆菌抗原SapA、空肠弯曲杆菌抗原FlaA。原核表达纯化后,Western blotting检测SapA蛋白大小为101 ku,FlaA蛋白大小为59 ku。制备的胎儿弯曲杆菌兔多克隆抗体血清效价为1∶64000,空肠弯曲杆菌兔多克隆抗体效价为1∶128000。Western blotting结果表明,抗原SapA、FlaA特异性识别弯曲杆菌多克隆抗体,具有良好的反应原性。以纯化的SapA蛋白作为包被抗原,确定的最优包被浓度为2.5μg/mL,封闭液为5%BSA,封闭时间30 min,一抗、二抗稀释度分别为1∶500和1∶8000,孵育时间分别为30和90 min。以纯化的FlaA蛋白作为包被抗原,确定最优包被浓度为0.4μg/mL,封闭时间1 h,其余条件与前者一致。二者与结核分枝杆菌(MTB)、副结核分枝杆菌(MAP)及布鲁氏菌(Brucella)均无交叉反应,特异性强。SapA间接ELISA方法的灵敏性最低达到1∶6400,FlaA间接ELISA方法的灵敏性达到1∶12800。批内和批间重复性试验变异系数均<10%,证明其重复性好。【结论】本研究成功鉴定了胎儿弯曲杆菌免疫显性抗原SapA、空肠弯曲杆菌免疫显性抗原FlaA,建立了动物弯曲杆菌病血清学间接ELISA诊断方法,为弯曲杆菌病防控提供了有效的诊断抗原及快速诊断方法。 展开更多
关键词 弯曲杆菌 免疫显性抗原 原核表达 Western blotting 间接elisa
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ELISA法与UPLC-MS/MS法检测水产品中喹诺酮类药物残留的比较分析
8
作者 张乐 徐加兵 +2 位作者 孙伟翔 江翰 杨海峰 《中国饲料》 北大核心 2026年第3期156-163,共8页
采用酶联免疫法(ELISA)和超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)检测市售6种水产品中14种喹诺酮类药物(QNs)残留的效果,旨在比较两种方法结果的差异性和相关性。其中,UPLC-MS/MS法参考国家标准GB/T 20366-2006进行检测分析,建立14... 采用酶联免疫法(ELISA)和超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)检测市售6种水产品中14种喹诺酮类药物(QNs)残留的效果,旨在比较两种方法结果的差异性和相关性。其中,UPLC-MS/MS法参考国家标准GB/T 20366-2006进行检测分析,建立14种QNs药物标准曲线,外标法进行定量分析的结果与ELISA法比较。结果表明:ELISA法检测QNs类药物样品阳性检出率为78.57%,UPLC-MS/MS法检出率为64.29%,环丙沙星最高残留量在黄颡鱼头中为15.76μg/kg,恩诺沙星UPLC-MS/MS法的阳性检出率为64.29%,且最高残留量高达2128.41μg/kg。其中ELISA法样品检出率普遍高于UPLC-MS/MS法,说明ELISA法存在假阳性的情况。鉴于ELISA法分析速度快,样品前处理方法简单等优点,适合用于大批量的样品初筛,UPLC-MS/MS法准确度高,重现性好,可用于ELISA法阳性结果的验证和更精确的药物残留含量测定。本实验为水产品中监测QNs药物残留提供新的检测思路,可结合实际工作情况,选择更快更好的方法,为水产品中用药或水产养殖饲料添加剂的QNs类药物残留检测提供技术支持。 展开更多
关键词 elisa法 UPLC-MS/MS法 喹诺酮类药物 水产品
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E种牛肠道病毒VP1蛋白的截短表达及抗体间接ELISA检测方法的建立
9
作者 崔平 刘澜 +3 位作者 李本科 白耀国 李玉坤 管宇 《中国兽医杂志》 北大核心 2026年第2期40-48,共9页
为了开展E种牛肠道病毒(BEV-E)的流行病学调查和抗体筛查,本试验采用原核表达技术对BEV-E外衣壳蛋白VP1进行体外截短表达,采用His-Tag蛋白纯化柱对VP1重组蛋白进行纯化,采用蛋白免疫印迹(WB)方法对重组蛋白进行鉴定。以纯化的VP1重组蛋... 为了开展E种牛肠道病毒(BEV-E)的流行病学调查和抗体筛查,本试验采用原核表达技术对BEV-E外衣壳蛋白VP1进行体外截短表达,采用His-Tag蛋白纯化柱对VP1重组蛋白进行纯化,采用蛋白免疫印迹(WB)方法对重组蛋白进行鉴定。以纯化的VP1重组蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化和确定临界值,建立了检测BEV-E抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,并进行特异性、灵敏性、重复性、符合率试验和临床样品检测。结果显示,成功表达VP1重组蛋白;间接ELISA检测方法的最佳抗原工作浓度为15.0μg/mL,最佳一抗稀释倍数为1∶80,最佳酶标二抗稀释倍数为1∶3000,最佳封闭液为10%马血清,最佳一抗、酶标二抗、封闭液工作时间分别为30、30、60 min;临界值为0.386;与牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、产肠毒素性大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,特异性良好;BEV-E阳性血清1∶25600稀释时仍可检测出阳性,灵敏性较高;批内和批间变异系数均小于10%,重复性良好;该方法与间接免疫荧光检测方法的符合率为92.5%;临床样品检测结果显示,BEV-E抗体平均阳性率为7.88%。结果表明,本试验建立的BEV-E VP1抗体间接ELISA检测方法为开展BEV-E临床诊断和流行病学调查提供了试验依据。 展开更多
关键词 E种牛肠道病毒(BEV-E) VP1蛋白 截短表达 抗体检测 间接elisa
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基于猪流行性腹泻病毒S蛋白夹心ELISA定量的疫苗质控方法的建立及验证
10
作者 张承凤 杜久斌 +4 位作者 曹光辉 陈晓洁 黎明 贺笋 杨延丽 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第2期216-224,共9页
本试验旨在建立一种准确、灵敏的定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的夹心ELISA方法,用于PED疫苗的质量控制。采用重组PEDV全长S蛋白作为标准品,测定家兔源单克隆抗体GC44F3-1和GC32C11-5与PEDV S蛋白标准品的亲和力;优化夹心ELISA条... 本试验旨在建立一种准确、灵敏的定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的夹心ELISA方法,用于PED疫苗的质量控制。采用重组PEDV全长S蛋白作为标准品,测定家兔源单克隆抗体GC44F3-1和GC32C11-5与PEDV S蛋白标准品的亲和力;优化夹心ELISA条件,验证方法的检测线性、检测限、准确性、重复性、稀释平行性及特异性;监测PEDV S蛋白标准品与预包被的ELISA酶标板保存稳定性,验证方法作为质控方法的可行性。制备的PEDV S蛋白纯度>90%,尺寸均一性较好;GC44F3-1和GC32C11-5的结合速率常数k_(on)分别为4.294×10^(5)和9.445×10^(4)(mol/L)^(-1)·s^(-1),二者解离速率常数k_(off)<1×10^(-7)s^(-1),解离常数Kd<10^(-12)mol/L。ELISA最优检测条件为:捕获抗体2μg/m L,检测抗体0.125μg/m L,捕获抗体4℃过夜包被,抗原37℃孵育1 h,检测抗体37℃孵育1 h,Streptavidin-HRP 37℃孵育25 min,37℃显色15 min。方法学验证表明,该方法具有良好的检测线性(R^(2)=0.9993,n=7),检测限为0.098 ng/m L;高、中、低3个浓度的PEDV S蛋白标准品回收率为94.5%~100.2%,加标回收率为84.3%~98.1%;批内和批间检测CV<5%,重复性良好;不同稀释倍数下检测值CV<5%,稀释平行性好;仅对PEDV检测时结果呈阳性,特异性良好。PEDV S蛋白标准品和预包被的ELISA酶标板稳定保存12个月。该方法能够用于不同生产过程样品的检测和不同批次乳化样品的保存稳定性监测。本研究建立的PEDV S蛋白夹心ELISA定量检测方法具有灵敏、准确、稳定等优点,对PED疫苗质量控制具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 双抗体夹心elisa 疫苗 质量控制
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5种国产狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的比对
11
作者 王培 李佳 +11 位作者 郑博君 赵浩军 张跃 程汝佳 殷雨晴 郑雪莹 刘海莹 史记 朱琳琳 杨金鹏 余琦 梅力 《中国动物检疫》 2026年第2期140-146,共7页
为评估国产狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的性能,以荧光抗体病毒中和试验(FAVN)为“金标准”,对74份包含不同狂犬病病毒抗体水平的临床血清样品,分别使用FAVN和5种ELISA试剂盒(A—E)进行检测,分析评估试剂盒的诊断效能、一致性和差异性... 为评估国产狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的性能,以荧光抗体病毒中和试验(FAVN)为“金标准”,对74份包含不同狂犬病病毒抗体水平的临床血清样品,分别使用FAVN和5种ELISA试剂盒(A—E)进行检测,分析评估试剂盒的诊断效能、一致性和差异性,并对定量试剂盒A和B进行相关性评估。结果显示:试剂盒A性能最佳,敏感性、特异性及符合率均超过90%,Kappa系数为0.835,其检测结果与FAVN方法一致性极强,且无统计学差异(P>0.05);试剂盒B、D、E性能次之,敏感性、特异性及符合率均超过80%,Kappa系数均大于0.6,检测结果与FAVN方法具有高度一致性,且无统计学差异(P>0.05);试剂盒C敏感性较低(66.67%),Kappa系数为0.578,且检测结果与FAVN差异显著(P<0.05)。依据不同抗体效价范围分别计算各试剂盒的符合率,当抗体效价接近临界值(0.5 IU/mL)时,所有试剂盒符合率均下降;定量试剂盒A和B检测结果与FAVN呈高度正相关(r值分别为0.888和0.794)。研究表明,国产试剂盒适用于血清样品的定性评估,也可较好地反映中和抗体水平的变化。本研究为国产狂犬病ELISA试剂盒的选择和应用提供了依据。 展开更多
关键词 狂犬病 抗体检测 elisa FAVN 试剂盒比对
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3种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA试剂盒的比较
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作者 田原 曹静 +3 位作者 柴文娴 余昊天 于重伟 夏福芳 《现代畜牧兽医》 2026年第1期25-29,共5页
研究旨在评价3种商品化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体ELISA试剂盒的检测性能。选用PRRSV阴性、阳性血清各3份和临床血清样本409份,比较3种试剂盒的分析敏感性、批内重复性以及阴性、阳性符合率。结果显示,试剂盒C分析敏感性最高,... 研究旨在评价3种商品化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体ELISA试剂盒的检测性能。选用PRRSV阴性、阳性血清各3份和临床血清样本409份,比较3种试剂盒的分析敏感性、批内重复性以及阴性、阳性符合率。结果显示,试剂盒C分析敏感性最高,试剂盒A和B基本一致;试剂盒A、B、C批内变异系数小于4%,均具有较好的重复性,其中试剂盒B的重复性最好,试剂盒C次之;试剂盒B、C的阳性符合率均为100.00%,试剂盒A的阳性符合率为98.08%,3种试剂盒的诊断敏感性为B=C>A;试剂盒A的阴性符合率为100.00%,试剂盒B、C分别为99.59%和97.22%,3种试剂盒的诊断特异性为A>B>C。研究表明,试剂盒B综合性能评价最高,重复性好,诊断敏感性和特异性高,是抗体检测的首选;若临床检测偏重敏感性,可选择分析敏感性和诊断敏感性更高的试剂盒C;若临床检测偏重特异性,可选择诊断特异性更高的试剂盒A。 展开更多
关键词 PRRSV elisa 抗体检测 检测性能
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拆封后ELISA检测微孔板条不同保存时间稳定性验证
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作者 程丽英 张婧 +1 位作者 刘正敏 胡京辉 《医学检验与临床》 2026年第1期20-24,共5页
目的:探讨ELISA试剂拆封后微孔板条在室温放置不同时间对检测结果的影响,为实验室试剂规范管理提供依据。方法:以2个厂家生产的梅毒螺旋体(TP)抗体诊断试剂盒A和B为研究对象,拆封后的微孔板条分别于室温条件下保存0天(对照组)、3天(试验... 目的:探讨ELISA试剂拆封后微孔板条在室温放置不同时间对检测结果的影响,为实验室试剂规范管理提供依据。方法:以2个厂家生产的梅毒螺旋体(TP)抗体诊断试剂盒A和B为研究对象,拆封后的微孔板条分别于室温条件下保存0天(对照组)、3天(试验组1)和7天(试验组2),采用标准物质进行检测,系统分析各组检测结果的差异性。结果:①定性结果符合性:采用Kappa检验分析,A、B两种试剂,试验组1和试验组2与对照组相比,阴阳性结果具有高度一致性。②定量结果一致性:采用Bland-Altman分析,A、B两种试剂试验组1和试验组2的检测结果均有95.8%的点落在95%一致性界限之内,与对照组数值具有一致性。③批内变异;每种试剂的三组数据批内变异系数(CV)均在15%之内,且各组之间无显著性差异(P>0.05)。④批间变异;两种试剂各组批间变异均在实验室可接受范围之内。结论:TP诊断试剂盒的微孔板条在拆封后室温放置7天内具有良好的稳定性,可满足实验室检测要求。 展开更多
关键词 elisa 梅毒螺旋体 微孔板条 稳定性
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变异链球菌卵黄抗体间接ELISA方法的建立
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作者 纪姝亦 赵晓锋 +2 位作者 侯博雅 林倚祈 刘环宇 《山西化工》 2026年第1期50-52,72,共4页
变异链球菌(Streptococcus mutans)是龋齿的主要致病菌;卵黄抗体作为动物体内的免疫球蛋白能够有效中和病毒粒子,从而发挥疾病防治的作用。因此探究变异链球菌卵黄抗体的效价对于口腔致病菌抗体研究及疫苗评价中具有潜在应用价值和意义... 变异链球菌(Streptococcus mutans)是龋齿的主要致病菌;卵黄抗体作为动物体内的免疫球蛋白能够有效中和病毒粒子,从而发挥疾病防治的作用。因此探究变异链球菌卵黄抗体的效价对于口腔致病菌抗体研究及疫苗评价中具有潜在应用价值和意义。由于目前缺少对变异链球菌卵黄抗体进行效价评估检测方法的建立,本实验通过建立间接ELISA检测方法以优化其评估方法。实验采用变异链球菌抗原免疫母鸡制备特异性Ig Y,进行关键参数优化,包括:抗原最佳包被条件(1∶2稀释,37℃1 h后4℃过夜)、封闭条件(37℃1 h后4℃过夜)、二抗工作浓度(1∶5 000稀释,孵育2 h)及TMB显色时间(60 min)。研究建立的间接ELISA方法稳定且灵敏度高,为变异链球菌Ig Y研究提供了标准化技术方案。 展开更多
关键词 变异链球菌 卵黄抗体 间接elisa
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重组轮状病毒VP8蛋白抗原ELISA检测方法的建立及验证
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作者 冀颖 孙艳艳 +3 位作者 纪国存 龙静 苏桂民 杜琳 《中国生物制品学杂志》 2026年第1期67-77,共11页
目的制备轮状病毒(rotavirus,RV)P[8]、P[6]和P[4]型VP8蛋白特异性抗体,初步建立重组RV VP8蛋白抗原检测的ELISA方法,并进行验证。方法采用重组表达的P[8]、P[6]和P[4]型VP8蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,各免疫3只,60μg/只,间隔2~4 d,以相... 目的制备轮状病毒(rotavirus,RV)P[8]、P[6]和P[4]型VP8蛋白特异性抗体,初步建立重组RV VP8蛋白抗原检测的ELISA方法,并进行验证。方法采用重组表达的P[8]、P[6]和P[4]型VP8蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,各免疫3只,60μg/只,间隔2~4 d,以相同剂量经腿部肌肉进行4次加强免疫;取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选针对P[8]、P[6]和P[4]型VP8蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb);免疫家兔,获得多克隆抗体。通过筛选双抗配对组合方式及抗体工作浓度,初步建立检测重组RV VP8蛋白抗原的双抗夹心ELISA方法,确定标准曲线线性及范围,并验证方法的精密度、准确度及专属性。采用建立的方法检测3批P[8]、P[6]、P[4]蛋白制备纯化过程各中间样品(菌体破碎液、粗提液、纯化液Ⅰ、纯化液Ⅱ)。结果筛选出抗P[8]McAb细胞1株,命名为P[8]-19E7,抗P[6]McAb细胞2株,命名为P[6]-4B8、P[6]-8F11,抗P[4]McAb细胞1株,命名为P[4]-11E3;获得P[8]、P[6]、P[4]兔多克隆抗体。P[6]抗原检测采用的捕获抗体(浓度为30μg/mL)、检测抗体(浓度为1.0μg/mL)均为鼠McAb,标准曲线范围为10.00~640.00 ng/mL;P[8]和P[4]抗原检测采用的捕获抗体为鼠McAb(浓度分别为5、2.5μg/mL),检测抗体为兔多克隆抗体(浓度均为1.5μg/mL),标准曲线范围分别为0.63~20.00和0.31~10.00 ng/mL。P[8]、P[6]、P[4]蛋白抗原含量6次检测结果变异系数(coefficient of variation,CV)均小于10%,回收率均在80%~120%之间,且专属性良好。3批纯化工艺中间产品抗原收率CV均小于30%。结论筛选获得的单克隆细胞株及分泌抗体特异性针对P[8]、P[6]和P[4]型VP8蛋白,互不交叉,抗体滴度高;以此建立的重组RV VP8蛋白抗原检测方法特异性强,灵敏度高,精密度良好。 展开更多
关键词 轮状病毒 单克隆抗体 兔源多克隆抗体 双抗夹心elisa
原文传递
ELISA在粮食检测中的应用研究
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作者 王华东 姚奕雯 +3 位作者 吕梅晶 钱国良 徐斌宏 叶玲军 《粮油科学与工程》 2026年第1期18-20,共3页
针对粮食安全快速检测的迫切需求,重点探讨了酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的应用价值。研究发现,ELISA在粮食真菌毒素筛查、农药残留检测、转基因成分测定以及重金属检测方面,检测效果均不亚于传统方法... 针对粮食安全快速检测的迫切需求,重点探讨了酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的应用价值。研究发现,ELISA在粮食真菌毒素筛查、农药残留检测、转基因成分测定以及重金属检测方面,检测效果均不亚于传统方法,且检测效率极大提升。尽管在多重检测和设备配套方面存在挑战,ELISA仍是保障粮食品质与安全的关键技术。 展开更多
关键词 食品免疫 elisa 粮食检测
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兽医实验室常用ELISA的分类及原理
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作者 李少学 赵芳 +6 位作者 韩银华 黄朝伟 甘雨 许光明 韦海娜 魏园园 蓝惠华 《广西畜牧兽医》 2026年第1期40-41,共2页
酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是继免疫荧光和放射免疫技术之后,迅速发展起来的一种免疫酶技术,目前已被广泛应用于生物学和医学科学等多种研究领域。ELISA在兽医实验室可用于疫苗免疫效果的评价。ELISA... 酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是继免疫荧光和放射免疫技术之后,迅速发展起来的一种免疫酶技术,目前已被广泛应用于生物学和医学科学等多种研究领域。ELISA在兽医实验室可用于疫苗免疫效果的评价。ELISA的方法有很多种,兽医实验室目前最常用的有间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA(也称为阻断ELISA),不同的ELISA方法其实验原理及操作不同。本文就兽医实验室常用ELISA方法的分类及其原理进行简要阐述与分析,对全面理解ELISA方法、提高实验室检验技术人员的操作水平及检测能力有重要的指导意义。 展开更多
关键词 间接elisa 酶联免疫吸附试验 兽医实验室
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人狂犬病毒抗体水平ELISA试剂盒的评估
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作者 李慧 周兰贞 +3 位作者 张栩欣 张运佳 王雪云 郭采平 《中国医药生物技术》 2026年第3期214-217,共4页
目的评估四种人狂犬病毒抗体ELISA试剂盒对人狂犬病毒抗体水平的检测性能。方法选取四种半定量检测狂犬病毒抗体试剂盒(A、B、C、D),对234份人血浆样本进行检测,通过Kappa检验、t检验及相关性分析,评估各试剂盒分别在抗体水平≥5、8、10... 目的评估四种人狂犬病毒抗体ELISA试剂盒对人狂犬病毒抗体水平的检测性能。方法选取四种半定量检测狂犬病毒抗体试剂盒(A、B、C、D),对234份人血浆样本进行检测,通过Kappa检验、t检验及相关性分析,评估各试剂盒分别在抗体水平≥5、8、10 IU/mL时与快速荧光灶抑制试验(RFFIT)结果的一致性,并基于诊断符合率、敏感性、特异性综合评价各试剂盒的性能。结果同一种试剂盒的Kappa值随着临界值的升高呈上升趋势,其中A试剂盒5 IU/mL的Kappa值最低(0.085),而D试剂盒10 IU/mL的Kappa值最高(0.653),且D试剂盒10 IU/mL的一致性没有显著性差异(P>0.05)。D试剂盒在5、8和10 IU/mL 3个临界值中符合率均表现最优。A试剂盒敏感性最佳,C试剂盒最差。特异性方面,5 IU/mL临界值的是C试剂盒最优;8 IU/mL和10 IU/mL的则为D试剂盒最优;A试剂盒在3个临界值的特异性均最差。结论A试剂盒的敏感性最优,但假阳性率显著;B试剂盒和C试剂盒性能居中;D试剂盒在3个临界值的综合表现最优,可为企业更准确筛选出高抗体水平血浆。 展开更多
关键词 狂犬病毒 狂犬病免疫球蛋白 elisa试剂盒 快速荧光灶抑制试验 抗体水平
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一种基于截短N蛋白的猪丁型冠状病毒抗体ELISA检测方法的建立 被引量：2
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作者 王东升 于瑞明 +5 位作者 张莉萍 白英杰 刘霞 王永录 杜晓华 刘新生 《生物工程学报》 北大核心 2025年第7期2760-2773,共14页
为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdⅡ中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV... 为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdⅡ中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)阳性血清的反应原性和特异性。同时对重组真核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2进行Western blotting和间接免疫荧光实验验证分析。最后使用重组原核蛋白PDCoV-N2建立间接ELISA方法,优化反应条件,检测敏感性、特异性及重复性,并对102份临床血清进行了检测。重组原核蛋白PDCoV-N2与PEDV抗血清交叉反应较低。以PDCoV-N2蛋白制备的间接ELISA方法的最优条件为:抗原包被浓度1.25μg/mL,37℃包被1 h,BSA封闭液4℃过夜,血清最佳稀释浓度1:50,37℃孵育1 h,酶标二抗最佳稀释比例为1:80000,37℃孵育1 h,加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色液37℃反应10 min。待检样品的S/P值(样本值–阴性对照值)/(阳性对照值–阴性对照值)≥0.45为阳性,S/P值≤0.38为阴性,S/P值介于0.45和0.38之间,则为可疑。检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis of swine,TGEV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,ASFV)阳性血清,结果显示,其他冠状病毒的S/P值均小于0.38,表明其具有良好的特异性;PDCoV抗血清800倍稀释后仍为阳性;批间和批内重复性实验结果显示,本方法变异系数均小于10%;临床血清样本检测结果显示,该方法与中和实验的符合率为94.12%。本研究基于截短的PDCoV N蛋白,建立了能够检测抗PDCoV特异性IgG抗体的ELISA方法,且该方法敏感、特异、稳定、重复性好,为PDCoV的临床诊断提供了新的方法。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 截短N蛋白 IGG抗体 间接elisa
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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1
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作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页
为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接elisa
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