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禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量：1
1
作者 苏晓月 吕转平 +2 位作者 沈亚安 赵明明 唐思静 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第1期64-69,共6页
为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间... 为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV、AIV-H9、ILTV阳性血清均为阴性,最低抗体检出效价为1︰12800,与进口试剂盒的符合率为94.87%,检测临床血清样品的阳性率为14.02%。结果说明该研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、符合性好,可为ALV的检测和净化等提供一种简单快速的方法。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 间接elisa方法 抗体检测 净化
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新城疫病毒HN蛋白的截短表达及间接ELISA方法建立
2
作者 魏玲 王思怡 +4 位作者 熊荣园 梁洪 王怀禹 李彩虹 杨国淋 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第3期91-95,共5页
为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表... 为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,间接ELISA方法检测6种其它鸡病阳性血清均为阴性,其最低抗体检出效价为1∶10240,其与血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition,HI)方法的阳性和阴性符合率分别为98.08%和92.31%,检测临床样品阳性率为91.48%。说明建立的间接ELISA方法可用于NDV免疫抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 新城疫病毒 HN蛋白 截短表达 间接elisa 抗体检测
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布鲁氏菌双抗夹心ELISA检测方法的建立与初步验证
3
作者 姚梦欣 彭泽宇 +5 位作者 任文浩 徐艺玫 郭伟 陈创夫 马忠臣 王勇 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第3期255-262,共8页
目的 建立灵敏、特异的布鲁氏菌双抗体夹心ELISA检测方法。方法 筛选用于布鲁氏菌检测的单克隆捕获抗体和检测抗体,优化并确定最佳抗体包被时间和浓度,最佳封闭液、封闭时间和阴阳性临界值;通过检验其他易与布鲁氏菌发生交叉反应的细菌... 目的 建立灵敏、特异的布鲁氏菌双抗体夹心ELISA检测方法。方法 筛选用于布鲁氏菌检测的单克隆捕获抗体和检测抗体,优化并确定最佳抗体包被时间和浓度,最佳封闭液、封闭时间和阴阳性临界值;通过检验其他易与布鲁氏菌发生交叉反应的细菌来验证该方法的特异性;通过对灭活布鲁氏菌梯度稀释液的检测,验证该方法的灵敏性;将该夹心ELISA检测结果与试管凝集和qPCR检测结果进行比较。结果 筛选出的捕获抗体为4A12,检测抗体为6C12。试验分析显示,捕获抗体4A12的最佳包被浓度为5μg/mL,检测抗体6C12的最佳稀释比为1∶2 000。该研究的最佳包被条件为4℃过夜、5%脱脂奶粉封闭、封闭时间2 h。该研究建立的双抗体夹心ELISA方法只与布鲁氏菌发生反应,与其他细菌未发生反应;布鲁氏菌灭活菌液浓度稀释到1×10^(5) CFU/mL时仍能检测出。批内、批间变异系数均小于10%。结论 该研究成功建立了布鲁氏菌双抗夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性与灵敏性,为布鲁氏菌病的精确诊断和有效防控提供有效途径。 展开更多
关键词 单克隆抗体 布鲁氏菌 双抗夹心elisa法 诊断
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非洲猪瘟病毒抗体阻断ELISA法测量不确定度评估
4
作者 柴娟 张璐 +10 位作者 董建斐 周丰超 王雅婷 孙仁杰 陈文静 黄晓兵 冯肖肖 黄靖 郑方宇 谢荣辉 张传亮 《中国动物检疫》 2025年第5期120-124,共5页
为了评估阻断ELISA方法检测结果的可靠性,使用阻断ELISA方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体,并分别使用“影响因素分析”法和“对照样品”法对试验进行测量不确定度评估。“影响因素分析”法和“对照样品”法评估的扩展不确定度(U)分别为0.... 为了评估阻断ELISA方法检测结果的可靠性,使用阻断ELISA方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体,并分别使用“影响因素分析”法和“对照样品”法对试验进行测量不确定度评估。“影响因素分析”法和“对照样品”法评估的扩展不确定度(U)分别为0.053 0和0.044 2 (k=2),表明在控制好移液器、培养箱和酶标仪等仪器引入的不确定度基础上,ELISA方法检测ASFV抗体的整体不确定度相对较低。两种方法评估的不确定度值差异不显著,使用“影响因素分析”法可以通过分析各分量在测量结果中的相对贡献,得到影响结果的关键因素,并进行改进;使用“对照样品”法可减少大量计算过程,操作更简单。ASFV抗体ELISA试验判定引入不确定度,可以提高结果的准确性,有利于进一步完善兽医检测领域不确定度评估体系。 展开更多
关键词 elisa 非洲猪瘟病毒抗体 测量不确定度 “影响因素分析”法 “对照样品”法
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基于IgY的ELISA法检测淋病奈瑟氏菌的效果及抗体敏感度影响分析
5
作者 肖昕 张曼珂 +3 位作者 夏乐欢 罗艳 李勤 李红姣 《中国卫生标准管理》 2025年第8期172-176,共5页
目的 探讨高效价、高纯度、生物活性好的抗淋病奈瑟氏菌的特异性鸡卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY)应用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测淋病奈瑟氏菌的效果。方法 采用超声破碎、研磨破碎、... 目的 探讨高效价、高纯度、生物活性好的抗淋病奈瑟氏菌的特异性鸡卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY)应用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测淋病奈瑟氏菌的效果。方法 采用超声破碎、研磨破碎、共振裂解等方法裂解淋病奈瑟氏菌,筛选出最佳裂解抗原,然后将经甲醛灭活的全菌抗原或裂解抗原与佐剂充分乳化免疫产蛋母鸡;采用酶联免疫吸附试验检测水稀释后的IgY抗体效价变化;通过硫酸铵盐析,超滤法纯化抗体,并用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝电泳法和二喹啉甲酸法测定抗体纯度和浓度,ELISA法评价IgY检测效果。结果 超声破碎法裂解的淋病奈瑟氏菌抗原浓度最高且蛋白条带最为完整;0.5 mL的1×10^(9) CFU/mL灭活菌初次免疫4周后再次免疫的方案产生的抗体效价最高,可达1∶25 600。硫酸铵沉淀超滤纯化后的抗体纯度可达94%,浓度为27.02 mg/mL;建立的间接ELISA法制检测淋病奈瑟氏菌具有较高的特异性和敏感度。结论 基于IgY的ELISA法检测淋病奈瑟氏菌效果显著,可以提高制备抗体的敏感度。 展开更多
关键词 淋病奈瑟氏菌 鸡卵黄抗体 免疫球蛋白 间接elisa法 效能 价值
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IBDV单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立
6
作者 姜艳平 刘薇 +6 位作者 宫浩阳 蔡李萌 李佳璇 崔文 周晗 韩建春 唐丽杰 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3433-3441,共9页
旨在建立一种快速有效的检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的方法,本研究以IBDV全病毒作为免疫原制备单克隆抗体,以获得的单抗6G3作为捕获抗体,单抗4C12作为检测抗体,建立检测IBDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该ELISA方法具有良好的... 旨在建立一种快速有效的检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的方法,本研究以IBDV全病毒作为免疫原制备单克隆抗体,以获得的单抗6G3作为捕获抗体,单抗4C12作为检测抗体,建立检测IBDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性,与REV、AEV、ALV和EDSV均无交叉反应;能检测病毒的最小量为1.585×10^(3) ELD50;批间和批内重复性试验显示,该方法具有良好的重复性;通过该方法对49份临床样品进行检测,与商品化的IBDV抗原检测卡进行比较,符合率达94.18%。综上,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于IBDV的快速检测,为制备商品化的IBDV检测试剂盒奠定基础。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病毒 单克隆抗体 检测方法 双抗体夹心elisa
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SARS-CoV-2重组蛋白疫苗(CHO细胞)体外相对效力双抗体夹心ELISA检测方法建立与验证
7
作者 曹莎莎 何鹏 +6 位作者 刘晓雅 刘莹 刘宇 马志桃 韦芬 王佳霁 胡忠玉 《药物分析杂志》 北大核心 2025年第3期452-459,共8页
目的:建立严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)重组蛋白疫苗(CHO细胞)体外相对效力的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法:采用基因重组技术制备抗SARS-Co V-2刺突蛋白受体结合区(receptor binding domain,RBD)的人源... 目的:建立严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)重组蛋白疫苗(CHO细胞)体外相对效力的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法:采用基因重组技术制备抗SARS-Co V-2刺突蛋白受体结合区(receptor binding domain,RBD)的人源单克隆抗体GH4及CB6。以GH4为包被抗体,HRP标记的CB6(CB6-HRP)为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,考察GH4和CB6-HRP的适宜工作浓度。开展方法学验证,验证项目为线性与范围、专属性、精密度(重复性、中间精密度)、准确度和耐用性。采用建立的方法检测3批工艺验证批及22批持续工艺确认批SARS-Co V-2重组蛋白疫苗(CHO细胞)的体外相对效力。结果:GH4及CB6-HRP的适宜工作浓度分别为1000 ng·m L^(-1)和31.25 ng·m L^(-1)。疫苗参考品质量浓度在0.3125~5ng·m L^(-1)范围内与A450呈良好的对数线性关系,回归方程斜率均在0.80~1.25范围内,R2均>0.99;建立的方法可特异性检测SARS-Co V-2重组蛋白疫苗(CHO细胞),与MERS重组蛋白疫苗、流感病毒疫苗、狂犬病毒疫苗及CHO宿主细胞蛋白等均无交叉反应;精密度验证时,重复性的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)分布在1.6%~2.4%范围内,中间精密度的GCV在1.2%~2.6%范围内;准确度验证时,回归方程R2为0.9945,斜率为0.9995在0.80~1.25范围内,相对偏倚(relative bias,RB)分布在-4.04%~7.36%范围内;耐用性验证中,不同考察条件下体外相对效力测定值在0.96~1.08范围内。3批工艺验证批SARS-Co V-2重组蛋白疫苗(CHO细胞)体外相对效力均值为1.02,GCV为4.8%;22批持续工艺确认批SARS-Co V-2重组蛋白疫苗(CHO细胞)体外相对效力在0.81~1.23范围内,几何均值为1.04,GCV为4.4%。结论:建立的双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的特异性、精密度、准确度及耐受性,可用于SARS-CoV-2重组蛋白疫苗(CHO细胞)体外相对效力检测及质量控制。 展开更多
关键词 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型 重组蛋白疫苗 酶联免疫吸附法 双抗体夹心法 体外相对效力
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人缝隙连接蛋白43不同结合位点单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证
8
作者 张小刚 张秀华 +5 位作者 於怀龙 刘英梅 郭新艳 安杨 李兆明 刘飞 《中国生物制品学杂志》 2025年第9期1094-1100,共7页
目的 筛选针对人缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)不同结合位点的单克隆抗体,并建立Cx43蛋白的双抗体夹心ELISA定量检测方法,以期应用于全长及截短Cx43蛋白结构、功能及其亚细胞定位的深入研究。方法 采用生物信息学方法分析人Cx43蛋... 目的 筛选针对人缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)不同结合位点的单克隆抗体,并建立Cx43蛋白的双抗体夹心ELISA定量检测方法,以期应用于全长及截短Cx43蛋白结构、功能及其亚细胞定位的深入研究。方法 采用生物信息学方法分析人Cx43蛋白序列,设计并合成针对不同结构域的多肽片段,偶联血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)作为免疫原免疫15只雌性BALB/c小鼠。通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,筛选能够稳定分泌抗Cx43蛋白单克隆抗体的细胞株。采用Protein G亲和层析纯化抗体,并鉴定其亚型、亲和力及特异性。以2株高亲和力单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体(用HRP标记),建立双抗体夹心ELISA检测方法,并优化方法的封闭液(5%牛奶-PBS、3%BSA-PBS)、清洗液[0.01 mol/L PBS(pH 7.2)、0.01 mol/L PBS-0.5%Tween 20(pH 7.2)(即PBST)]、样品稀释液[3%BSA-PBS及0.01 mol/L PBS(pH 7.2)],验证方法的线性范围及灵敏度、专属性、精密度、准确度。采用建立的方法检测小鼠脑组织、肠组织、股骨组织、MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞裂解液中的Cx43蛋白含量。结果 共筛选获得3株稳定分泌抗Cx43单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1-1E2、2-1G11和3-2G12,抗体亚型分别为IgG1、IgG1和IgG2b,抗体灵敏度均达0.002μg/mL,其中2-1G11和3-2G12高亲和力更高。以2-1G11为捕获抗体、HRP标记的3-2G12为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA法。最佳封闭液为3%BSA-PBS,清洗液为PBST,样品稀释液为0.01 mol/L PBS(pH 7.2)。Cx43蛋白标准品浓度在3.12~200 ng/mL范围内,与A450均值呈良好的线性关系,R^(2)> 0.98;该方法可特异性检出Cx43蛋白,与KLH蛋白、重组人骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)及重组人谷氨酰胺转氨酶2(transglutaminase 2,TGM2)均无交叉反应;精密度验证CV为7.72%;高、中、低3个浓度供试品的回收率均在85%~115%范围内。MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞中Cx43蛋白含量较高(58.03 ng/mL),小鼠成骨组织中Cx43蛋白含量较低(38.4 ng/mL)。结论 成功制备了针对人Cx43不同结合位点的特异性单克隆抗体,并建立了灵敏度高、特异性强的双抗体夹心ELISA定量检测方法,为Cx43蛋白的结构与功能研究提供了可靠的检测方法。 展开更多
关键词 缝隙连接蛋白43 多肽免疫 单克隆抗体 双抗体夹心elisa法
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猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立
9
作者 颜士琦 李复坤 +5 位作者 齐冬梅 赖月辉 黄福强 冯钰鑫 周晓敏 樊全宝 《广东畜牧兽医科技》 2025年第5期66-72,120,共8页
猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种高度传染性和致死性的病毒性疾病,疫苗接种是预防CSF的有效手段,抗体水平是评价免疫猪群免疫效果的重要指标。该研究通过原核表达系统成... 猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种高度传染性和致死性的病毒性疾病,疫苗接种是预防CSF的有效手段,抗体水平是评价免疫猪群免疫效果的重要指标。该研究通过原核表达系统成功表达了CSFV重组蛋白E2Y,将纯化的E2Y蛋白作为包被抗原,优化条件并建立了CSFV间接ELISA抗体检测方法。试验结果表明,蛋白包被浓度为0.25μg/mL,与常见猪病毒的阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性、灵敏性、可重复性,与商品化试剂盒一致性为91.67%。该研究成功建立了CSFV间接ELISA抗体检测方法,为进一步优化和研制CSFV抗体检测试剂盒提供了技术参考。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 抗体检测 间接elisa方法
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非洲猪瘟病毒P54蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立 被引量：1
10
作者 王程 夏应菊 +1 位作者 王海东 刘业兵 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4440-4449,共10页
【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P... 【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P54,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的P54蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种间接ELISA方法,对包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育等反应条件进行优化后,对其临界值、特异性、灵敏性和重复性进行验证。【结果】SDS-PAGE结果显示,P54蛋白分子质量为42 ku,纯度在95%以上;Western blotting结果显示,P54蛋白与ASFV阳性血清能产生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为:0.3125μg/mL抗原37℃包被1 h,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,1∶800稀释的血清37℃孵育2 h,1∶15000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h。该ELISA检测方法仅与ASFV阳性血清产生特异性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和乙型脑炎病毒的阳性血清均无明显交叉反应;该方法灵敏性较高,ASFV阳性血清稀释度为1∶3200时仍有明显反应。批间重复和批内重复变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其阳性符合率为95.45%,阴性符合率为96.05%,总符合率为95.83%。【结论】本研究建立了一种以ASFV P54蛋白为检测抗原的ASFV间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于ASFV的血清学检测,为非洲猪瘟的快速诊断提供更多选择。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) 间接elisa方法 P54蛋白 原核表达
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基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立 被引量：3
11
作者 胡帅琪 丛潇 +5 位作者 练月晓 伍妙梨 朱于军 丛锋 顾有方 闻爱友 《安徽科技学院学报》 2024年第3期25-33,共9页
目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此... 目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 重组核衣壳蛋白 间接elisa 诊断方法
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BCSP31蛋白双抗夹心ELISA定量方法的建立及应用 被引量：1
12
作者 陈凯楠 李金斗 +5 位作者 丁佳欣 冯嘉轩 于喜冰 单春晖 汪思捷 丁壮 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期699-705,共7页
通过原核表达系统制备、纯化布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗核心组分BCSP31蛋白,并将其作为免疫原及标准品分别免疫新西兰大白兔(1mg/只)和BALB/c鼠(200μg/只)制备兔源捕获多克隆抗体和鼠源检测多克隆抗体,对双抗夹心ELISA方法的捕获抗体和... 通过原核表达系统制备、纯化布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗核心组分BCSP31蛋白,并将其作为免疫原及标准品分别免疫新西兰大白兔(1mg/只)和BALB/c鼠(200μg/只)制备兔源捕获多克隆抗体和鼠源检测多克隆抗体,对双抗夹心ELISA方法的捕获抗体和检测抗体最佳稀释倍数、封闭液种类及封闭条件、酶标二抗工作条件等参数进行优化,结果显示兔多克隆抗体最佳包被浓度和鼠多克隆抗体最佳稀释倍数均为1∶1600、3%脱脂奶粉封闭1h、酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4000、酶标二抗孵育时间1h、显色时间为15min的条件下建立的双抗夹心ELISA方法效果最好。按照上述最佳反应条件对布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗(BCSP31-cVLPs)核心抗原成分BCSP31蛋白进行定量检测,并对其敏感性、特异性、重复性等性能进行评价,结果显示1μL布鲁菌嵌合病毒样颗粒中的BCSP31含量约占总蛋白含量的14.187%;将布鲁菌嵌合病毒样颗粒稀释640倍后,P/N值仍大于2.1,有较高的敏感性;与FAdV、IBDV、NDV、AIV等其他病毒样颗粒均无交叉反应,特异性高;批间和批内变异系数均在10%以下,重复性良好。该方法的建立为推进布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗的质量控制标准建立及商品化奠定了基础。 展开更多
关键词 布鲁菌病嵌合病毒样颗粒 BCSP31蛋白 双抗夹心elisa方法 参数优化 应用
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抗水禽呼肠孤病毒σC蛋白抗体间接ELISA方法的建立及鹅群血清学调查 被引量：1
13
作者 陈稼龙 何莉 +3 位作者 郑炜鸿 朱婉君 张济培 陈济铛 《广东畜牧兽医科技》 2024年第6期8-15,共8页
为提供水禽呼肠孤病毒病早期诊断的精准快速检测方法,该试验通过BL21(DE3)原核表达系统稳定表达水禽呼肠孤病毒σC蛋白,并将纯化的重组σC蛋白包被ELISA酶标板,经进一步反应条件优化。结果显示,该试验建立的ELISA检测方法最优反应条件是... 为提供水禽呼肠孤病毒病早期诊断的精准快速检测方法,该试验通过BL21(DE3)原核表达系统稳定表达水禽呼肠孤病毒σC蛋白,并将纯化的重组σC蛋白包被ELISA酶标板,经进一步反应条件优化。结果显示,该试验建立的ELISA检测方法最优反应条件是:抗原包被含量为1μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶50,孵育时间为45 min,酶标二抗最佳稀释度为1∶500,孵育时间为30 min,最佳底物显色时间为20 min,OD_(450)值≥0.3判定为阳性。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,对水禽呼肠孤病毒基因Ⅰ型和基因Ⅱ型血清具有一定的交叉反应。对105份临床健康鹅群血清样品进行检测,阳性率高达77.33%。该研究提供了一种敏感高效的快速检测水禽呼肠孤病毒中和抗体的方法,为鹅群临床血清大规模检测提供方法,为研发商品化的ELISA检测试剂盒提供基础。 展开更多
关键词 水禽呼肠孤病毒 σC蛋白 间接elisa方法 血清学调查
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狐源兔脑炎微孢子虫极管蛋白2(PTP2)的原核表达及间接ELISA方法的建立
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作者 高妍 贺飞 +1 位作者 王好 刘丽凡 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第12期108-114,共7页
为了建立一种特异性好、敏感性高、重复性好的可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,试验首先从疑似感染兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon.cuniculi)的蓝狐脑组织DNA中扩增PTP2基因,并将其与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质... 为了建立一种特异性好、敏感性高、重复性好的可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,试验首先从疑似感染兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon.cuniculi)的蓝狐脑组织DNA中扩增PTP2基因,并将其与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒pET32a-PTP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,将菌体超声后对表达的重组蛋白进行可溶性分析,并纯化目的蛋白;然后以重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件和临界值的确定建立蓝狐兔脑炎微孢子虫的间接ELISA方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验;最后采用建立的间接ELISA方法对28份经常规PCR方法验证已经感染兔脑炎微孢子虫病的蓝狐血清样品进行检测,并计算符合率。结果表明:表达的重组蛋白的分子质量为45.8 ku,且表达产物以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,经纯化杂带明显减少,纯化后的重组蛋白质量浓度为1.55 mg/mL。间接ELISA方法的最佳包被抗原质量浓度为8μg/ml,最佳一抗稀释度为1∶100,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳封闭条件为37℃、1 h,最佳一抗孵育时间为120 min,最佳二抗稀释度为1∶5 000,最佳二抗孵育时间为60 min,最佳显色时间为20 min。阴、阳性血清OD_(450)临界值分别为0.268和0.302。建立的间接ELISA方法检测蓝狐犬瘟热病毒、蓝狐伪狂犬病毒、蓝狐细小病毒阳性血清均为阴性,可检测到稀释度为1∶3 200的蓝狐兔脑炎微孢子虫阳性血清,批内重复与批间重复变异系数均小于10%。用建立的间接ELISA方法检测28份蓝狐血清样品的阳性样品数为23份,与常规PCR方法的符合率为82.14%。说明试验成功建立了一种可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,该方法特异性好、敏感性高、重复性好,适合在基层推广。 展开更多
关键词 兔脑炎微孢子虫病 微孢子虫极管蛋白2(PTP2) 原核表达 间接elisa 检测方法的建立
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DHAV-33D蛋白单克隆抗体制备及其DAS-ELISA检测方法的建立 被引量：1
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作者 冯旭东 伍琳楠 +7 位作者 陈天泽 赵梦茹 刘言言 周学慧 杨晓伟 郁蕾 张立武 赵光伟 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期2556-2563,2578,共9页
为实现鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)的快速检测,本试验首先对DHAV-3的非结构蛋白3D进行原核表达,纯化后免疫BALB/c小鼠,四免后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合制备单克隆抗体,进而利用单克隆抗体建立双抗夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方... 为实现鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)的快速检测,本试验首先对DHAV-3的非结构蛋白3D进行原核表达,纯化后免疫BALB/c小鼠,四免后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合制备单克隆抗体,进而利用单克隆抗体建立双抗夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,评估其灵敏性、特异性和重复性,最后将所建方法应用于临床样本的检测,并与RT-PCR方法进行符合性验证。结果显示:DHAV-33D蛋白在BL21(DE3)中高效表达,经Western blot验证,纯化后的蛋白其特异性良好;细胞融合后经3次亚克隆,成功筛选到6株杂交瘤细胞,分别命名为1A3、1B6、1C7、1D9、2A1和3A9,抗体亚型鉴定结果显示1A3为IgG2b,1B6为IgG2a,3A9为IgG3,1C7、1D9和2A1均为IgG1;经筛选,将1B6和1A3两株亲和性高的单抗分别作为捕获抗体与检测抗体,建立DAS-ELISA检测方法,优化反应条件后确定捕获抗体1B6最佳包被质量浓度为1×10^(-3) g/L,检测抗体1A3的最佳稀释度为1∶1000,阴阳临界值(cut-off)为0.256;灵敏性试验显示该方法对3D蛋白的最低检测限度为4.0×10^(-4) g/L;重复性试验显示,该方法批内、批间变异系数(Cv)均小于9%,重复性好;特异性试验显示,该方法对鸭腺病毒(DAdV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸭疫里默氏杆菌(RA)病原无特异性反应,但与鸭甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)具有交叉反应,可以同时检测出DHAV-3与DHAV-1病原;应用该试验建立的DASELISA方法与RT-PCR检测方法同时对186份临床样本进行检测,DAS-ELISA方法可同时识别DHAV-1和DHAV-3,且与RT-PCR检测方法的符合率为98.9%。结果表明,本试验建立的DAS-ELISA方法重复性好、灵敏性高,可用于DHAV-1与DHAV-3的诊断,为我国鸭甲型肝炎的流行病学调查及防控提供了技术支撑。 展开更多
关键词 DHAV-3 单克隆抗体 DAS-elisa 3D蛋白 检测方法
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成年鸭睾丸发育差异分析
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作者 陶志云 宋卫涛 +6 位作者 徐文娟 朱春红 刘宏祥 王志成 顾昊天 王逸飞 李慧芳 《山西农业科学》 2025年第1期160-166,共7页
为探讨不同精液量鸭的睾丸发育差异,以成年高邮鸭为研究对象,根据个体精液量体积分为精液量多和精液量少组,分别称量2组鸭的体质量和睾丸总质量;采用ELISA法检测2组血液中的睾酮含量;对2组鸭睾丸组织石蜡切片后显微观察并测量睾丸曲精... 为探讨不同精液量鸭的睾丸发育差异,以成年高邮鸭为研究对象,根据个体精液量体积分为精液量多和精液量少组,分别称量2组鸭的体质量和睾丸总质量;采用ELISA法检测2组血液中的睾酮含量;对2组鸭睾丸组织石蜡切片后显微观察并测量睾丸曲精小管面积、单位面积间质细胞数量,比较2组间的差异,并进行相关性分析;最后利用荧光定量PCR技术检测2组鸭睾丸组织中FSHR、LHR、AMH、StAR的表达水平。结果表明,精液量多组的睾丸总质量、睾丸体积和睾酮含量显著高于精液量少组的睾丸总质量、睾丸体积和睾酮含量;体质量、睾丸指数、曲精小管面积和单位面积间质细胞数量在2组间无显著差异。相关性分析结果表明,精液量与睾丸体积呈显著正相关,睾酮含量与睾丸总质量和睾丸体积呈显著正相关。精液量多组中睾丸发育相关基因FSHR、LHR、AMH、StAR的mRNA表达水平均显著高于精液量少组。综上所述,公鸭的精液量多少与睾丸总质量和睾酮含量有关,而且睾丸发育相关基因FSHR、LHR、AMH、StAR在鸭睾丸发育和精子生成过程中可能发挥了重要作用。 展开更多
关键词 高邮鸭 睾丸 发育 elisa法 相关性分析
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大黄鱼病原菌──溶藻弧菌的ELISA快速检测研究 被引量：23
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作者 鄢庆枇 王军 +2 位作者 苏永全 皮灵宝 刘成荣 《海洋科学》 CAS CSCD 北大核心 2001年第9期47-49,共3页
以灭活溶藻弧菌（０．０５％甲醛，３０℃，８ｈ）制成菌苗，注射免疫实验兔获得抗血清。该 抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等１０株对照菌株无交叉反应。用该抗血清进行溶藻 弧菌ＥＬＩＳＡ检测，其最低检测极限为９７０００ｃ... 以灭活溶藻弧菌（０．０５％甲醛，３０℃，８ｈ）制成菌苗，注射免疫实验兔获得抗血清。该 抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等１０株对照菌株无交叉反应。用该抗血清进行溶藻 弧菌ＥＬＩＳＡ检测，其最低检测极限为９７０００ｃｆｕ／ｍｌ。将该方法应用于养殖现场，检测结果为：海 水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为 ２０％、患病大黄鱼的阳性检出率为８０％，表明ＥＬＩＳＡ法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌 病，也可以检测无病症带菌大黄鱼。 展开更多
关键词 大黄鱼 溶藻弧菌 elisa检测 病原菌
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新霉素ELISA检测方法的建立 被引量：9
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作者 刘沙洲 桑小雪 +2 位作者 欧阳华学 雷绍荣 白林含 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第14期227-231,共5页
目的:比较直接和间接竞争酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的优缺点,建立新霉素残留ELISA检测方法。方法:利用自制的新霉素多克隆抗体,采用直接竞争和间接竞争ELISA方法检测新霉素残留,并比较两种方法的优缺点。结... 目的:比较直接和间接竞争酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的优缺点,建立新霉素残留ELISA检测方法。方法:利用自制的新霉素多克隆抗体,采用直接竞争和间接竞争ELISA方法检测新霉素残留,并比较两种方法的优缺点。结果:新霉素抗血清和庆大霉素的交叉反应率为2.04%,和卡那霉素的交叉反应率为0.02%,和氨苄青霉素、红霉素、四环素的交叉反应率均小于0.01%。初步测试新霉素间接竞争ELISA法的准确性和回收率。板内误差小于4%,板间误差小于11%,回收率为135.5%～191.3%。直接竞争和间接竞争ELISA方法的检测极限分别为28.58ng/mL和51.74ng/mL,达到了国家对新霉素规定的500μg/kg MRL检测限。结论:建立了直接竞争和间接ELISA吸附检测方法,条件优化更成功的间接竞争ELISA可用于开发新霉素检测试剂盒。 展开更多
关键词 新霉素 多克隆抗体 竞争酶联免疫法(enzyme linked IMMUNOSORBENT assay elisa) 方法建立
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基于山羊痘病毒P32蛋白ELISA检测方法的建立 被引量：8
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作者 吴锦艳 田宏 +3 位作者 陈妍 尚佑军 宋江伟 刘湘涛 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1906-1911,共6页
P32蛋白是羊痘病毒株中特异性很强的免疫原性结构蛋白,本研究利用原核表达系统对山羊痘病毒P32基因进行表达,并应用该蛋白建立了检测山羊痘病毒血清抗体检测方法。将P32基因克隆至pGEX-6P-1表达载体,经抗性筛选,测序鉴定获得重组阳性克... P32蛋白是羊痘病毒株中特异性很强的免疫原性结构蛋白,本研究利用原核表达系统对山羊痘病毒P32基因进行表达,并应用该蛋白建立了检测山羊痘病毒血清抗体检测方法。将P32基因克隆至pGEX-6P-1表达载体,经抗性筛选,测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了羊痘病毒重组pGEX-P32表达载体。经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达P32融合蛋白。融合蛋白纯化后SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导,8h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,相对分子质量约56 000,表达产量约占菌体总蛋白的28%。Western-blotting检测表明,表达的融合蛋白能与羊痘阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物具有良好的反应原性。用表达的融合蛋白建立了检测羊痘血清抗体的ELISA方法,经方阵滴定,确定抗原最佳包被质量浓度为每孔0.4mg/L,最佳血清稀释度为1∶20。符合率试验表明ELISA方法和琼脂扩散试验的阳性符合率为83.44%,并且所建立的方法具有很好的特异性、重复性和敏感性,这为应用该融合蛋白制备山羊痘病毒免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 山羊痘病毒 P32基因 表达 间接elisa方法
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番茄斑萎病毒外壳蛋白原核表达及Dot-blotELISA检测方法的建立 被引量：9
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作者 于翠 邓凤林 +1 位作者 杨翠云 吴建祥 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期597-601,共5页
将番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)全长外壳蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中,经限制性酶切分析及测序结果表明插入方向正确且阅读框架无移码突变.将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE分析结果证实IPTG... 将番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)全长外壳蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中,经限制性酶切分析及测序结果表明插入方向正确且阅读框架无移码突变.将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE分析结果证实IPTG可诱导1个分子量约为48 kDa的融合蛋白表达.利用6×His标签单抗和TSWV FoPaTs1多抗证实所表达的蛋白为TSWV外壳蛋白.以纯化的重组外壳蛋白免疫小鼠,制备杂交瘤细胞培养上清单抗,并用杂交瘤细胞培养液上清建立了可靠、有效检测TSWV的Dot-blot ELISA方法. 展开更多
关键词 番茄斑萎病毒 原核表达 Dot—blot EL/SA方法
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