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一种基于截短N蛋白的猪丁型冠状病毒抗体ELISA检测方法的建立 被引量：1
1
作者 王东升 于瑞明 +5 位作者 张莉萍 白英杰 刘霞 王永录 杜晓华 刘新生 《生物工程学报》 北大核心 2025年第7期2760-2773,共14页
为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdⅡ中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV... 为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdⅡ中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)阳性血清的反应原性和特异性。同时对重组真核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2进行Western blotting和间接免疫荧光实验验证分析。最后使用重组原核蛋白PDCoV-N2建立间接ELISA方法,优化反应条件,检测敏感性、特异性及重复性,并对102份临床血清进行了检测。重组原核蛋白PDCoV-N2与PEDV抗血清交叉反应较低。以PDCoV-N2蛋白制备的间接ELISA方法的最优条件为:抗原包被浓度1.25μg/mL,37℃包被1 h,BSA封闭液4℃过夜,血清最佳稀释浓度1:50,37℃孵育1 h,酶标二抗最佳稀释比例为1:80000,37℃孵育1 h,加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色液37℃反应10 min。待检样品的S/P值(样本值–阴性对照值)/(阳性对照值–阴性对照值)≥0.45为阳性,S/P值≤0.38为阴性,S/P值介于0.45和0.38之间,则为可疑。检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis of swine,TGEV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,ASFV)阳性血清,结果显示,其他冠状病毒的S/P值均小于0.38,表明其具有良好的特异性;PDCoV抗血清800倍稀释后仍为阳性;批间和批内重复性实验结果显示,本方法变异系数均小于10%;临床血清样本检测结果显示,该方法与中和实验的符合率为94.12%。本研究基于截短的PDCoV N蛋白,建立了能够检测抗PDCoV特异性IgG抗体的ELISA方法,且该方法敏感、特异、稳定、重复性好,为PDCoV的临床诊断提供了新的方法。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 截短N蛋白 IGG抗体 间接elisa
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禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量：1
2
作者 苏晓月 吕转平 +2 位作者 沈亚安 赵明明 唐思静 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第1期64-69,共6页
为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间... 为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV、AIV-H9、ILTV阳性血清均为阴性,最低抗体检出效价为1︰12800,与进口试剂盒的符合率为94.87%,检测临床血清样品的阳性率为14.02%。结果说明该研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、符合性好,可为ALV的检测和净化等提供一种简单快速的方法。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 间接elisa方法 抗体检测 净化
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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
3
作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页
为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接elisa
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鸭短喙矮小综合征病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用
4
作者 朱小丽 王劭 +5 位作者 董慧 程晓霞 江丹丹 肖世峰 陈少莺 陈仕龙 《福建农业学报》 北大核心 2025年第7期649-655,共7页
【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法。【方法】以蔗糖密度梯度离心纯化的SBDSV流行株M15,以此灭活全病毒作为固相包被抗原,通过系统性优化反应参数,构建一... 【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法。【方法】以蔗糖密度梯度离心纯化的SBDSV流行株M15,以此灭活全病毒作为固相包被抗原,通过系统性优化反应参数,构建一种高特异性的间接ELISA检测方法,用于鸭短喙矮小综合征病毒(SBDSV)血清抗体的定性分析。【结果】建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:抗原包被浓度0.1 mg·mL^(−1),37℃孵育2 h后再4℃过夜包被;1%BSA 37℃封闭2 h;血清样本1∶200稀释;阴阳性临界值为0.3214。该检测方法特异性好,与其他常见水禽病毒阳性血清均无交叉反应;敏感性高,阳性高免血清(LPAI效价2^(8))1∶204800倍稀释时检测结果仍为阳性;批内、批间重复性好,变异系数均小于6%;利用所建立的ELISA方法对70份SBDSV疑似感染病鸭的血清样品进行检测,检测结果与LPAI检测结果符合率为90%。对福建省648份临床送检1日龄雏鸭血清样品进行检测,抗体阳性率约为48.30%,显示福建省养鸭场存在不同程度的SBDSV感染。【结论】本研究建立的SBDSV血清抗体间接ELISA检测方法,该方法特异性高,适合大规模血清学检测,可为监测SBDSV在我国的流行情况以及雏鸭母源抗体水平评价提供技术支撑。 展开更多
关键词 鸭短喙矮小综合征 间接elisa 抗体检测
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抗营养因子大豆凝集素夹心ELISA检测方法的建立
5
作者 胡骁飞 杨继飞 +3 位作者 邢云瑞 庞杏豪 孙亚宁 魏凤仙 《西北农业学报》 北大核心 2025年第1期133-139,共7页
为建立灵敏、特异的大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测方法。试验以SBA鼠源单克隆抗体为捕获抗体,SBA兔源多克隆抗血清为检测抗体,羊抗兔酶标抗体为二抗,通过对抗体的工... 为建立灵敏、特异的大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测方法。试验以SBA鼠源单克隆抗体为捕获抗体,SBA兔源多克隆抗血清为检测抗体,羊抗兔酶标抗体为二抗,通过对抗体的工作浓度及反应时间优化,建立SBA的双抗体夹心ELISA检测方法,并用建立的方法检测大豆、大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕中SBA含量。结果表明:建立SBA双抗夹心ELISA检测方法的检测范围为39.06~1250 ng/mL,检出限为3.00 ng/mL,样品添加回收率为77.96%~116.15%,变异系数为6.11%~18.34%,与大豆中胰蛋白酶抑制因子BBI、KTI,大豆球蛋白glycinin及大豆伴球蛋白-conglycinin等其他抗营养因子均无交叉反应。大豆中SBA含量显著高于大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);大豆粕中SBA含量显著高于膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);膨化大豆粕显著高于酶解大豆粕中SBA含量(P<0.05)。综上,本研究建立了灵敏度高、特异性好的SBA双抗夹心ELISA检测方法,该方法可用于饲料中大豆凝集素的监控检测。 展开更多
关键词 大豆凝集素 抗营养因子 多克隆抗体 单克隆抗体 夹心elisa
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新城疫病毒HN蛋白的截短表达及间接ELISA方法建立
6
作者 魏玲 王思怡 +4 位作者 熊荣园 梁洪 王怀禹 李彩虹 杨国淋 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第3期91-95,共5页
为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表... 为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,间接ELISA方法检测6种其它鸡病阳性血清均为阴性,其最低抗体检出效价为1∶10240,其与血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition,HI)方法的阳性和阴性符合率分别为98.08%和92.31%,检测临床样品阳性率为91.48%。说明建立的间接ELISA方法可用于NDV免疫抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 新城疫病毒 HN蛋白 截短表达 间接elisa 抗体检测
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鸡肉中利巴韦林间接竞争ELISA检测方法的建立
7
作者 胡骁飞 邢云瑞 +3 位作者 邢广旭 孙亚宁 王琳 张改平 《中国免疫学杂志》 北大核心 2025年第10期2495-2498,2504,共5页
目的:建立高灵敏度的鸡肉中利巴韦林间接竞争ELISA(icELISA)检测方法。方法:基于已获得的利巴韦林单克隆抗体,采用棋盘试验确定抗原抗体最佳工作浓度,从而建立icELISA方法,并对该方法的性能进行鉴定。结果:建立的icELISA方法线性范围为0... 目的:建立高灵敏度的鸡肉中利巴韦林间接竞争ELISA(icELISA)检测方法。方法:基于已获得的利巴韦林单克隆抗体,采用棋盘试验确定抗原抗体最佳工作浓度,从而建立icELISA方法,并对该方法的性能进行鉴定。结果:建立的icELISA方法线性范围为0.44~32.71 ng/ml,IC50为3.78 ng/ml,最低检测限(LOD)为0.20 ng/ml;除了与利巴韦林特异反应外,与其他抗病毒药物均无交叉反应;样品加标回收率为91.60%~100.76%,变异系数7.29%~10.63%。结论:本研究建立了灵敏度高、特异性强的利巴韦林icELISA检测方法,可用于检测鸡肉中利巴韦林残留。 展开更多
关键词 利巴韦林 抗病毒药物 鸡肉 检测 间接竞争elisa
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腮腺炎病毒滴度ELISA检测方法的建立及其初步验证
8
作者 刘丽 李娟 +3 位作者 刘悦越 赵荣荣 李长贵 权娅茹 《中国生物制品学杂志》 2025年第7期827-832,共6页
目的 建立检测腮腺炎病毒滴度的ELISA方法,并进行验证,以缩短检定时间,为紧急出检提供技术支撑。方法 用腮腺炎疫苗病毒滴定参考品感染Vero细胞,以小鼠腹水为一抗,HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗,对Vero细胞接种浓度、病毒接种后离心时间、... 目的 建立检测腮腺炎病毒滴度的ELISA方法,并进行验证,以缩短检定时间,为紧急出检提供技术支撑。方法 用腮腺炎疫苗病毒滴定参考品感染Vero细胞,以小鼠腹水为一抗,HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗,对Vero细胞接种浓度、病毒接种后离心时间、病毒感染时间、抗体浓度、封闭条件、固定方法及时间等条件进行优化,建立检测腮腺炎病毒滴度的ELISA方法,并进行特异性、准确性、精密性、线性验证,同时与微量细胞病变法检测结果进行比较。结果 建立的ELISA方法步骤为:将浓度3×10^(5)个/mL的Vero细胞悬液加至96孔细胞培养板培养24 h;加入待测样本和参考品,236×g离心2 h,再继续培养48 h;用4%多聚甲醛固定10 min后,加入PBS-0.5%TritonX-100处理30 min;用5%脱脂奶粉封闭后,加入一抗(1∶1 000稀释)和二抗(1∶2 000稀释);TMB显色,硫酸终止反应,检测A450值。建立的方法对腮腺炎病毒具有良好的特异性;检测不同浓度参考品病毒滴度的相对偏倚(relative bias,RB)均小于10%;不同工作日重复6次检测参考品病毒滴度的变异系数(CV)为3.9%;方法的线性斜率为0.920 6,相关系数(r)为0.993 9。两种方法检测参考品病毒滴度结果差异无统计学意义(t=2.049,P > 0.05)。结论 建立的检测腮腺炎病毒滴度的ELISA方法特异性强,准确性和精密性好,且与微量细胞病变法检测结果具有较好的一致性,可明显缩短检定时间。 展开更多
关键词 腮腺炎病毒 elisa 病毒滴度 紧急出检
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鸡传染性喉气管炎病毒抗原双抗夹心ELISA方法的建立
9
作者 谢晶 于吉锋 +12 位作者 肖璐 吴学婧 叶勇刚 魏勇 李兴玉 曹冶 潘梦 毛从剑 杨竣雁 叶健强 曾子轩 康玮笠 康润敏 《中国动物检疫》 2025年第6期99-105,127,共8页
为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)抗原的检测方法,利用ILTV gJ蛋白的2株单克隆抗体,1株用作捕获抗体,另1株经辣根过氧化物酶(HRP)标记后用作检测抗体,采用棋盘法优化反应条件,建立了一种检测ILTV抗原的双抗夹心ELISA方法,并对其进行了... 为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)抗原的检测方法,利用ILTV gJ蛋白的2株单克隆抗体,1株用作捕获抗体,另1株经辣根过氧化物酶(HRP)标记后用作检测抗体,采用棋盘法优化反应条件,建立了一种检测ILTV抗原的双抗夹心ELISA方法,并对其进行了性能评估。结果显示:捕获抗体的最佳包被质量浓度为2μg/m L,酶标单克隆抗体的最适稀释度为1:4 000;临界值为0.295 6,当待测样品OD_(450 nm)值大于0.295 6且P/N值大于2时,判为阳性;建立的双抗夹心ELISA方法可特异性检测ILTV抗原,而对其他禽类常见抗原的检测结果均为阴性;最低检测限为49.4 ELD_(50)/0.1 mL,批内和批间变异系数均小于10%。48份临床样品的检测结果显示,该方法与行业标准中PCR方法的符合率为93.75%。结果表明,本研究建立的ILTV双抗夹心ELISA方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于ILTV抗原检测。该方法的建立为该病的检测、监测以及防控提供了技术支撑。 展开更多
关键词 鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV) 单克隆抗体 双抗夹心elisa
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非洲猪瘟病毒抗体阻断ELISA法测量不确定度评估
10
作者 柴娟 张璐 +10 位作者 董建斐 周丰超 王雅婷 孙仁杰 陈文静 黄晓兵 冯肖肖 黄靖 郑方宇 谢荣辉 张传亮 《中国动物检疫》 2025年第5期120-124,共5页
为了评估阻断ELISA方法检测结果的可靠性,使用阻断ELISA方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体,并分别使用“影响因素分析”法和“对照样品”法对试验进行测量不确定度评估。“影响因素分析”法和“对照样品”法评估的扩展不确定度(U)分别为0.... 为了评估阻断ELISA方法检测结果的可靠性,使用阻断ELISA方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体,并分别使用“影响因素分析”法和“对照样品”法对试验进行测量不确定度评估。“影响因素分析”法和“对照样品”法评估的扩展不确定度(U)分别为0.053 0和0.044 2 (k=2),表明在控制好移液器、培养箱和酶标仪等仪器引入的不确定度基础上,ELISA方法检测ASFV抗体的整体不确定度相对较低。两种方法评估的不确定度值差异不显著,使用“影响因素分析”法可以通过分析各分量在测量结果中的相对贡献,得到影响结果的关键因素,并进行改进;使用“对照样品”法可减少大量计算过程,操作更简单。ASFV抗体ELISA试验判定引入不确定度,可以提高结果的准确性,有利于进一步完善兽医检测领域不确定度评估体系。 展开更多
关键词 elisa 非洲猪瘟病毒抗体 测量不确定度 “影响因素分析”法 “对照样品”法
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一种快速精准检测各种乳品中牛乳铁蛋白含量的广适性ELISA方法
11
作者 张婧 朱孔迪 +3 位作者 刘传铭 刘长振 王鹏杰 黄家强 《中国乳业》 2025年第3期91-99,共9页
[目的]验证夹心法ELISA技术是否可成为包括风味发酵乳在内的各种乳制品中牛乳铁蛋白含量的精准检测方法。[方法]利用优化的夹心法ELISA检测试剂分别检测牛乳铁蛋白(LTF)标准品溶液、巴氏杀菌乳样本、加标巴氏杀菌乳样本、12种北京地区... [目的]验证夹心法ELISA技术是否可成为包括风味发酵乳在内的各种乳制品中牛乳铁蛋白含量的精准检测方法。[方法]利用优化的夹心法ELISA检测试剂分别检测牛乳铁蛋白(LTF)标准品溶液、巴氏杀菌乳样本、加标巴氏杀菌乳样本、12种北京地区市场常见的风味发酵乳、7种加标风味发酵乳、7种混合巴氏杀菌乳的风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量,计算加标回收率及CV值。用该检测试剂检测3种加标风味发酵乳中牛乳铁蛋白对72℃热处理的敏感度;并与牛乳铁蛋白国标检测(高效液相色谱法)方法对比检测生乳和巴氏灭菌乳。[结果]该检测试剂可检测牛乳铁蛋白(LTF)标准品溶液和巴氏杀菌乳样本中牛乳铁蛋白,且加标回收率91.7%~106.4%。经检测,12种风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量为无;7种加标风味发酵乳的加标回收率86.3%~109.1%,且检测CV值远低于12%;7种风味发酵乳与巴氏杀菌乳混合乳中牛乳铁蛋白含量与对照组比值在92.3%~110.5%,且大多数检测CV值远低于12%;3种加标风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量随72℃加热时间延长而降低,且下降曲线相似。与国家标准方法对比分析,夹心法ELISA方法检测生乳和巴氏杀菌乳乳铁蛋白含量的符合率分别为97.54%、111.2%,说明该检测方法的准确性达到国标标准。[结论]夹心法ELISA检测试剂可精准检测风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量。 展开更多
关键词 牛乳铁蛋白 风味发酵乳 夹心法elisa
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施马伦贝格病毒N蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
12
作者 李阳 孙睿雪 +3 位作者 陈天杰 刘思彤 曹家慧 赵建军 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期3877-3887,共11页
[目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌... [目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的SBV N蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种iELISA方法,并对其包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育时间等反应条件进行优化,检测其阴阳性临界值、特异性、灵敏性和重复性。[结果]SDS-PAGE结果显示,SBV N蛋白分子质量为30 ku;Western blotting结果显示,纯化后SBV N蛋白与SBV阳性血清能产生特异性反应。本研究建立的SBV iELISA检测方法最佳条件为:SBV N抗原包被浓度4μg/mL、4℃包被12 h、1%明胶37℃封闭1 h、血清稀释度为1:200、37℃孵育1 h、1:6 000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h,其阴阳性临界值为0.371。该iELISA检测方法仅与SBV阳性血清产生特异性反应,与牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和阿卡斑病毒(AKAV)阳性血清均无明显交叉反应,灵敏性较高,SBV阳性血清稀释度为1:1280时仍有明显反应。批间重复试验和批内重复试验变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其总符合率为94.57%。[结论]本研究建立了一种以SBV N蛋白为检测抗原的SBV iELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于SBV血清学检测,试验结果为SBV的快速诊断提供更多选择。 展开更多
关键词 施马伦贝格病毒(SBV) N蛋白 间接elisa(ielisa) 原核表达
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基于猪附红细胞体膜蛋白的间接ELISA检测方法的建立及初步应用
13
作者 徐颖 王金琦 +5 位作者 王淼 金鑫 朴政霖 韩天龙 薛书江 吕舟 《延边大学农学学报》 2025年第1期59-64,共6页
为建立有效的猪附红细胞体病间接酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法,该试验利用猪附红细胞体水溶性膜蛋白为包被抗原,优化反应条件,建立了猪附红细胞体病间接ELISA检测方法。结果表明:提取的猪附红细胞体... 为建立有效的猪附红细胞体病间接酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法,该试验利用猪附红细胞体水溶性膜蛋白为包被抗原,优化反应条件,建立了猪附红细胞体病间接ELISA检测方法。结果表明:提取的猪附红细胞体脂溶性膜蛋白的分子量主要集中在25~35Ku;猪附红细胞体水溶性膜蛋白的分子量主要集中在45~180Ku。建立的间接ELISA检测方法最佳反应条件:膜蛋白最佳包被浓度为0.15μg/μL;最佳封闭条件为5%脱脂乳37℃封闭2h;血清最佳稀释倍数为1∶320;酶标二抗最佳稀释倍数为1∶2000;TMB显色时间为37℃5min。特异性试验中,包被抗原与弓形虫、猪肺炎支原体,以及猪大肠杆菌阳性血清无交叉反应。重复性试验结果显示,批内变异系数为2.62%~8.89%,批间变异系数为5.49%~9.65%。对40份猪血清进行检测,建立的间接ELISA方法检出阳性样品19份,阳性率为47.5%。这说明建立的间接ELISA检测方法特异性强、敏感性高,将为猪附红细胞体病的临床诊断提供准确便捷的血清学检测手段。 展开更多
关键词 猪附红细胞体 膜蛋白 临床检测 间接elisa检测方法 抗体检测
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呼吸道合胞病毒融合前F蛋白双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立及验证
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作者 李海巍 黄陆霞 +1 位作者 李智华 李倩倩 《中国医药生物技术》 2025年第5期515-521,共7页
目的建立一种基于酶联免疫吸附技术(ELISA)并能简便、快速对呼吸道合胞病毒(RSV)融合前F蛋白(preF)进行定量检测的方法。方法利用HEK293悬浮细胞表达7种针对RSV F蛋白不同表位的单克隆抗体(D25、palivizumab、101F、MED18897、AM22、AM1... 目的建立一种基于酶联免疫吸附技术(ELISA)并能简便、快速对呼吸道合胞病毒(RSV)融合前F蛋白(preF)进行定量检测的方法。方法利用HEK293悬浮细胞表达7种针对RSV F蛋白不同表位的单克隆抗体(D25、palivizumab、101F、MED18897、AM22、AM14、motavizumab)及preF、融合后F蛋白(postF)。根据7种单克隆抗体对preF、post F结合能力的不同,将可同时识别preF、post F抗体作为包被抗体,特异性识别preF抗体作为酶标抗体,选择信噪比最大的组别建立针对preF的双抗体夹心ELISA检测及定量方法。结果本研究建立的以motavizumab作为包被抗体,D25作为酶标抗体的双抗体夹心ELISA方法可特异性识别RSV preF并对其定量,并且该方法具有良好的特异性和灵敏度,其检测灵敏度为7.8 ng/mL、线性范围为7.8 ng/mL~0.5μg/m L,r^(2)为0.9932,同一样本3次重复检测结果的CV值为0.15%~6.86%。结论motavizumab作为包被抗体,D25作为酶标抗体的双抗体夹心ELISA方法特异性好、灵敏度高、稳定性佳,可用于RSV疫苗产品及前期研究样品中preF抗原含量测定,为RSV疫苗的研制及工艺开发奠定基础。 展开更多
关键词 呼吸道合胞病毒 融合前F蛋白 单克隆抗体 双抗体夹心elisa 抗原定量
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基于猪流行性腹泻病毒S蛋白单克隆抗体的竞争ELISA方法的建立 被引量：4
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作者 柴茂 马震原 +7 位作者 杨海波 王淑娟 赵雪丽 刘影 王东方 王翠 谢彩华 闫若潜 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第1期73-79,共7页
为建立基于猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白单克隆抗体的竞争ELISA方法,利用真核表达系统表达PEDV S蛋白主要抗原区,将纯化的S蛋白免疫小鼠后制备抗PEDV S蛋白的单克隆抗体,经各组分和反应条件优化,建立了检测PEDV S蛋白抗体的竞争ELISA方... 为建立基于猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白单克隆抗体的竞争ELISA方法,利用真核表达系统表达PEDV S蛋白主要抗原区,将纯化的S蛋白免疫小鼠后制备抗PEDV S蛋白的单克隆抗体,经各组分和反应条件优化,建立了检测PEDV S蛋白抗体的竞争ELISA方法。结果表明,表达的S蛋白大小为92 k Da,制备出IgG1亚类的抗S蛋白单克隆抗体5B3D6,建立的竞争ELISA方法S/N临界值为0.400,样品检测时间短(55 min),重复性稳定(变异系数小于10%),特异性强(无交叉反应),与血清中和试验的总符合率高(97.08%)。该方法为PEDV抗体评估和猪流行性腹泻防控提供了有力支撑。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 单克隆抗体 竞争elisa
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猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：4
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作者 潘向英 曾智勇 +7 位作者 梁海英 汤德元 王彬 叶泥 田红利 边孟婷 柳佳佳 黄书 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1231-1240,共10页
【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6... 【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP 6截短基因。利用pET-32a(+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒。以大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主菌,对重组质粒进行诱导表达,并优化表达条件。利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化,以此作为包被抗原,通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件。确定间接ELISA方法的阴阳性临界值,检验其特异性、敏感性、重复性及符合性,并对2021—2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体,实现VP6蛋白的原核截短表达,蛋白分子质量大小约40 ku,具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化,确定VP6包被抗原最佳浓度为2μg/mL、阳性血清稀释度为1∶100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D 450 nm)为0.410。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应,特异性强;批内和批间重复试验变异系数均<10%,重复性好;与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80%。间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示,样品总阳性率为28.91%。【结论】本研究成功实现了PoRV VP6蛋白的截短表达,并建立了PoRV间接ELISA抗体检测方法,适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 猪轮状病毒(PoRV) VP6蛋白 截短表达 间接elisa
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猪流行性腹泻病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的制备
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作者 冯平 符美静 +3 位作者 张磊 瞿军军 张艳 陈瑞 《现代畜牧科技》 2025年第9期29-32,共4页
为开发针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高效诊断试剂,该试验通过制备预包被微孔板和酶标抗体,研发出猪流行性腹泻病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒,并开展特异性试验、中和活性试验和临床诊断试验,验证试剂盒性能。结果表明,该试剂盒制备的单... 为开发针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高效诊断试剂,该试验通过制备预包被微孔板和酶标抗体,研发出猪流行性腹泻病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒,并开展特异性试验、中和活性试验和临床诊断试验,验证试剂盒性能。结果表明,该试剂盒制备的单克隆抗体特异性良好,仅与PEDV相关毒株反应呈阳性,与其他毒株及细胞无交叉反应;各单克隆抗体对不同PEDV毒株有较高中和活性,如PEDV-Mabs-2D5对PEDV-KB2013-4株中和效价达1∶2048;试剂盒最低检出量为1∶256,特异性符合率100%,临床检测结果与预期相符。该试验制备的猪流行性腹泻病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒特异性强、灵敏度高,对于判断猪场PEDV感染情况和评估猪瘟疫苗免疫状况意义重大,为PEDV防控提供了有效检测手段。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻 特异性试验 elisa抗体检测
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基于塞内卡病毒A猪源中和性Fab抗体的竞争ELISA检测方法的建立与评价 被引量：1
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作者 梁玉斌 马雪青 +8 位作者 何宜轩 王彩荷 李坤 李平花 付元芳 卢曾军 杜晓华 刘霞 孙普 《生物工程学报》 北大核心 2025年第7期2748-2759,共12页
塞内卡病毒病是由塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)引起的一种主要感染猪的病毒性传染病,监测其流行情况对防控具有重要意义。为了建立一种快速检测SVA中和抗体的ELISA检测方法,本研究利用HEK293F细胞表达SVA特异性猪源Fab(fragment of a... 塞内卡病毒病是由塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)引起的一种主要感染猪的病毒性传染病,监测其流行情况对防控具有重要意义。为了建立一种快速检测SVA中和抗体的ELISA检测方法,本研究利用HEK293F细胞表达SVA特异性猪源Fab(fragment of antigen binding)抗体,经间接ELISA、免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)、病毒中和实验(virus neutralization test,VNT)、蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)等方法验证Fab抗体的生物学活性,将其用生物素标记后作为竞争抗体,以竞争ELISA(competitive ELISA,C-ELISA)反应模式建立一种SVA中和抗体C-ELISA检测方法,并对其敏感性、特异性、重复性、与VNT的符合率进行测定。结果表明,成功制备了1株具有中和活性的Fab抗体,且与SVA之间有较高的亲和力,将其命名为1M33Fab,用生物素标记后命名为Bio-1M33Fab;确定C-ELISA方法的SVA粒子最佳包被浓度为1μg/mL、Bio-1M33Fab最适工作浓度为0.5μg/mL、待检血清样本最佳稀释比例为1:10、酶标亲和素最佳稀释比为1:30000;确定抑制百分率(percent inhibition,PI)为47%时,敏感性和特异性最高,分别为96.88%和100%,且与常见的主要猪病毒病阳性血清不发生交叉反应;批内变异系数范围为1.12%–7.34%、批间变异系数范围为1.10%–8.97%,表明重复性较好;利用该方法和VNT同时检测了224份临床猪血清样本,2种方法的符合率为93.75%。本研究利用SVA猪源Fab抗体成功建立了一种检测SVA中和抗体的C-ELISA方法,为开发检测试剂盒产品奠定了基础。 展开更多
关键词 塞内卡病毒A 竞争elisa 中和抗体 诊断检测
原文传递
绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白原核表达及ELISA方法建立 被引量：1
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作者 陈思宇 张梦洁 +12 位作者 田睿 陈益 刘镝钺 李文良 毛立 程子龙 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 杜改梅 储岳峰 王金泉 刘茂军 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期97-105,共9页
绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF... 绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF-Tu蛋白,以纯化的rEF-Tu为包被抗原,建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 kDa,与预期相符;Western blot证实具有良好的反应原性;建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示,包被抗原浓度为1.25 mg/L,37℃孵育2 h;封闭条件为30 g/L BSA,37℃孵育1 h;待检血清1∶100稀释,37℃孵育45 min;酶标二抗1∶20000稀释,37℃孵育30 min;底物TMB 37℃避光反应15 min;样品OD450值≥0.296时判定为阳性,OD450值≤0.265时判定为阴性,OD 450值0.265~0.296则判为可疑;组内和组间变异系数均低于10%;用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测,两者特异性为90.70%,敏感性为82.69%,符合率约为87.12%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性,为Mo的临床诊断、抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法,也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 EF-Tu蛋白 原核表达 间接elisa
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基于猫传染性腹膜炎病毒N蛋白单克隆抗体的竞争ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1
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作者 黄金龙 杜吉革 +7 位作者 刘妍 赵辉 朱真 陈小云 王团结 罗玉峰 赵建军 印春生 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第2期210-218,共9页
为建立抗猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,FIPV)抗体竞争ELISA检测方法,应用原核表达FIPV截短N蛋白[rFIPV N(aa17-172)]免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和间接ELISA方法筛选能稳定分泌针对重组N蛋白(17-172 aa)的杂... 为建立抗猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,FIPV)抗体竞争ELISA检测方法,应用原核表达FIPV截短N蛋白[rFIPV N(aa17-172)]免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和间接ELISA方法筛选能稳定分泌针对重组N蛋白(17-172 aa)的杂交瘤细胞株,制备腹水并进行纯化和鉴定。以重组N蛋白为抗原,纯化后的单克隆抗体为一抗建立抗体竞争ELISA方法。试验结果显示,纯化后重组N蛋白浓度为0.5 mg/mL,纯度大于85%,将其作为包被抗原,通过间接ELISA筛选出3株单克隆杂交瘤细胞株,命名为5C5、1F8和4A10。纯化的3株单克隆抗体效价均高于1∶102400。间接免疫荧光试验结果显示,3株单克隆抗体均能与FIPV发生特异性反应。抗体竞争ELISA方法最佳包被抗原浓度为1.25μg/mL,最佳抗体工作浓度为1∶128000。通过检测本实验室保存的94份FIPV阴性血清,确定本研究建立的抗体竞争ELISA方法阳性阻断率≥20.1%,阴性阻断率≤15.9%。对62份猫血清和本实验室前期建立的FIPV抗S蛋白的抗体竞争ELISA方法进行符合率比较,两种方法符合率为85.5%。本研究建立的抗N蛋白抗体竞争ELISA方法可用于FIPV抗体的检测,为FIP诊断提供了技术支撑。 展开更多
关键词 猫传染性腹膜炎病毒 N蛋白 单克隆抗体 竞争elisa
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