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非洲猪瘟病毒pB602L蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立
1
作者 张向阳 矫健 +8 位作者 黄培 焦翠翠 张梦瑶 黄静波 龚志远 李海伦 李媛媛 张海丽 王化磊 《病毒学报》 北大核心 2026年第1期126-134,共9页
目的为了建立非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)pB602L蛋白抗体间接ELISA检测方法。方法本研究利用大肠杆菌表达系统表达了His-pB602L重组蛋白,并以纯化的His-pB602L重组蛋白为包被抗原,以表达pB602L的重组狂犬病病毒免疫... 目的为了建立非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)pB602L蛋白抗体间接ELISA检测方法。方法本研究利用大肠杆菌表达系统表达了His-pB602L重组蛋白,并以纯化的His-pB602L重组蛋白为包被抗原,以表达pB602L的重组狂犬病病毒免疫后的小鼠阳性血清和ASFV猪阳性血清为一抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)作为广谱二抗,采用棋盘滴定法优化各反应条件,建立针对pB602L蛋白的间接ELISA抗体检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行评价。结果ASFV pB602L蛋白间接ELISA抗体检测方法的最优反应条件为:抗原包被浓度为4μg/mL,4℃包被16 h~18 h,5%脱脂奶粉37℃封闭0.5 h,待检血清孵育0.5 h,SPA-HRP 1:10000倍稀释后37℃孵育0.5 h。该方法仅对ASFV阳性血清检测结果为阳性,与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪乙型脑炎病毒和猪圆环病毒2型阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测稀释度为1∶6400的猪ASFV临床阳性血清时仍呈现阳性,检测分别稀释3200倍和1600倍的ASFVⅠ型和Ⅱ型阳性血清均为阳性;批内重复和批间重复变异系数均小于10%。结论本研究建立的ASFV pB602L蛋白间接ELISA抗体检测方法不仅可用于ASF的临床诊断和流行病学调查,亦能够为ASF疫苗研发过程中免疫动物的特异性抗体评价提供技术支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 pB602L蛋白 pB602L抗体 间接elisa
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鸭短喙矮小综合征病毒单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立
2
作者 朱小丽 王劭 +5 位作者 董慧 程晓霞 江丹丹 肖世峰 陈少莺 陈仕龙 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第2期948-958,共11页
【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法,为SBDSV抗体检测及诊断试剂盒研发提供技术支撑。【方法】本研究用纯化的SBDSV M15株灭活毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠... 【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法,为SBDSV抗体检测及诊断试剂盒研发提供技术支撑。【方法】本研究用纯化的SBDSV M15株灭活毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,利用间接ELISA筛选可分泌SBDSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用筛选出的杂交瘤细胞接种小鼠制备腹水。通过间接ELISA测定单克隆抗体效价,通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和胶乳凝集(latex particle agglutination,LPA)试验鉴定单克隆抗体特性。通过中和试验测定单克隆抗体中和活性,使用试剂盒鉴定单克隆抗体亚类。运用棋盘滴定法优化反应体系,建立基于SBDSV单克隆抗体的竞争ELISA检测方法。通过检测阴性血清确定该方法的临界值。对建立的竞争ELISA检测方法进行特异性、灵敏性和重复性测定。用该方法检测临床血清样品,并与胶乳凝集抑制(latex particle agglutination inhibition,LPAI)试验结果进行比对。【结果】经间接ELISA筛选,获得3株稳定分泌SBDSV单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为D5-3、G11-23和H2-27。间接ELISA结果显示,3株杂交瘤细胞D5-3、G11-23和H2-27培养上清的抗体效价分别为1∶2~6、1∶2~5和1∶2~6,腹水的抗体效价分别为1∶10~5、1∶10~4和1∶10~6。IFA结果显示,单克隆抗体D5-3、G11-23和H2-27均具有较好的结合活性,可用于IFA检测。LPA试验结果显示,仅单克隆抗体H2-27具有致敏胶乳的特性。中和试验结果显示,3株单克隆抗体均具有中和SBDSV的能力,其中单克隆抗体H2-27的中和活性最强。单克隆抗体亚类鉴定结果显示,单克隆抗体D5-3和G11-23均为IgG1,H2-27为IgM。以纯化的SBDSV(M15株)灭活毒作为包被抗原,单克隆抗体H2-27为竞争抗体,建立了一种检测SBDSV抗体的竞争ELISA方法,当抑制率(PI)≥23.70%时,判定为SBDSV抗体阳性;PI≤15.91%时判定为阴性。该方法特异性好,与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、鸭源副黏病毒(Duck paramyxovirus,DPMV)、鸭肝炎病毒1型(Duck hepatitis virus-1,DHV-1)和鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)阳性血清均无交叉反应;敏感性高,高免血清(LPAI效价1∶2~8)1∶25600稀释时仍为阳性;批间、批内重复性好,变异系数均<6%。竞争ELISA检测结果与LPAI结果具有良好的正相关性,二者的符合率为89.10%(188/211)。【结论】本研究成功制备3株SBDSV单克隆抗体,基于单克隆抗体H2-27建立的竞争ELISA方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可高通量检测SBDSV抗体,为监测SBDSV在中国的流行情况及雏鸭母源抗体水平评价提供技术支撑。 展开更多
关键词 鸭 短喙矮小综合征病毒(SBDSV) 单克隆抗体 竞争elisa
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鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ抗体间接ELISA检测方法的建立与应用
3
作者 曲哲会 张孟云 +7 位作者 陈晶晶 聂雅诺 王凤瑞 刘志科 焦凤超 郝香琪 梁成成 郭晓秋 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第4期2082-2092,共11页
【目的】建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白结构域Ⅲ(E-DⅢ)抗体间接ELISA检测方法,为DTMUV血清学监测提供一种检测手段。【方法】利用PCR扩增DTMUV E-DⅢ基因,连接至pET-30a(+)载体构建重组质粒pET-E-DⅢ,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细... 【目的】建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白结构域Ⅲ(E-DⅢ)抗体间接ELISA检测方法,为DTMUV血清学监测提供一种检测手段。【方法】利用PCR扩增DTMUV E-DⅢ基因,连接至pET-30a(+)载体构建重组质粒pET-E-DⅢ,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物,建立E-DⅢ蛋白抗体间接ELISA检测方法,优化抗原浓度和抗体稀释度、封闭条件、待检血清反应条件、酶标二抗反应条件和显色时间,明确临界值判断标准,评价所建立抗体间接ELISA检测方法的特异性、敏感性和重复性,并对背景清楚的126份血清进行检测。【结果】成功构建含大小约300 bp目的条带的重组质粒pET-E-DⅢ,诱导表达获得分子质量约16 ku的重组蛋白E-DⅢ,且以可溶性和包涵体共存表达,浓度为284.5 mg/L。经筛选确定最佳间接ELISA工作条件为:E-DⅢ蛋白包被浓度为250 ng/mL,待检血清稀释度为1∶80,封闭条件为25℃封闭1.5 h,待检血清反应条件为37℃孵育1 h,酶标二抗为1∶7500稀释,37℃孵育1 h,显色时间为10 min。确定D_(450nm)值≥0.337为阳性,D_(450nm)值≤0.282为阴性。特异性试验结果显示,该方法仅DTMUV阳性血清检测结果为阳性,新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒1型和3型阳性血清检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法检测阳性血清的最大稀释度为1∶1280。重复性试验结果显示,批内试验和批间试验变异系数分别为2.11%~5.09%和3.25%~6.95%。126份背景清楚血清检测结果显示,阳性和阴性血清符合率分别为95.83%和96.30%。【结论】本研究表达纯化了DTMUV E-DⅢ蛋白,并成功建立了基于E-DⅢ蛋白的特异性好、敏感性高、重复性良好的抗体间接ELISA检测方法。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒(DTMUV) E蛋白结构域Ⅲ 原核表达 间接elisa 抗体
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PRRSV全病毒包被抗原间接ELISA抗体检测方法的建立与应用
4
作者 孙海凤 孙杨杨 +1 位作者 白娟 姜平 《畜牧与兽医》 北大核心 2026年第4期115-121,共7页
为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测方法准确性,本研究采用分子筛方法和超速离心法制备PRRSV全病毒纯化抗原和Marc-145细胞模拟抗原,SDS-PAGE与Western blot结果显示,PRRSV全病毒纯化抗原主要包含M蛋白和N蛋白,细胞模拟抗... 为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测方法准确性,本研究采用分子筛方法和超速离心法制备PRRSV全病毒纯化抗原和Marc-145细胞模拟抗原,SDS-PAGE与Western blot结果显示,PRRSV全病毒纯化抗原主要包含M蛋白和N蛋白,细胞模拟抗原不与PRRSV抗体发生反应。通过反应条件优化,建立了PRRSV间接ELISA抗体检测方法,阴阳性抗体判定标准S/P临界值为0.4,敏感性96.47%,特异性96.36%。该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)等均无交叉反应性。批内和批间变异系数均低于10%。采用788份猪临床血清样品进行比对检测,该方法与间接免疫荧光试验(IFA)相比,Kappa值为0.91,而与IDEXX商品化试剂盒相比,Kappa值为0.72。上述结果表明,该方法敏感性高,特异性强,重复性好,是一种潜在的可用于PRRSV抗体检测、流行病学调查和疫病净化的方法。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 elisa 全病毒抗原
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ELISA试验室内质控框架构建方法改进初探
5
作者 段友斌 王瑞 +6 位作者 常乐 邱昌文 李志强 陈庚瑞 杨婧涓 何清 王露楠 《中国输血杂志》 2026年第1期103-108,共6页
目的对9家血站实验室室内质控数据进行统计分析,提出改进ELISA试验室内质控框架构建方法的参考建议,并进行验证。方法1)收集9家血站室内质控数据,以某国产HBsAg ELISA检测试剂为例进行分析;2)比较血站1各批次室内质控值是否存在差异;3)... 目的对9家血站实验室室内质控数据进行统计分析,提出改进ELISA试验室内质控框架构建方法的参考建议,并进行验证。方法1)收集9家血站室内质控数据,以某国产HBsAg ELISA检测试剂为例进行分析;2)比较血站1各批次室内质控值是否存在差异;3)统计分析9家血站室内质控批次使用情况、使用批次数、使用天数、质控次数、各批次均值和变异系数;4)采用改进的ELISA试验室内质控框架构建方法,构建血站1和血站9各批次室内质控的临时框架和固定框架,并对离群值进行判定。结果1)ELISA试验各批次室内质控数据有差异(P<0.01),宜更换质控品和试剂时均更换质控框架。2)9家血站之间使用的质控品和试剂批号、每批次质控次数、相同批号质控值差异较大,宜由各实验室单独建立室内质控框架。3)改进ELISA试验室内质控框架构建方法为:使用框架平移,即预实验均值和上一批次累积变异系数构建临时框架,如该批次使用时间≥20 d且质控数据≥20点,则累积20 d至少20个点后,汇集计算在控数据累积质控均值和标准差构建固定框架。使用该方法构建的临时框架和固定框架,判定血站1和血站9室内质控26个极端离群值均为失控。218个一般离群值,除10个被临时框架判定为正常外,其余均判定为警告和失控,能够有效监控试验稳定性。结论根据不同规模血站室内质控情况的统计分析结果,结合ELISA试验的特性、试剂质控品批间的不稳定性,建议在更换质控品或试剂批号时重新构建质控图,以框架平移建立临时框架,以累计数据计算固定框架,适用于不同规模血站实验室,能够对ELISA试验过程稳定性进行有效控制。 展开更多
关键词 elisa试验 室内质控 质控框架 血站实验室
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腐败梭菌α毒素单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立
6
作者 马祎芳 赵佳慧 +4 位作者 马清龙 高鹏程 曾巧英 李学瑞 储岳峰 《中国兽医杂志》 北大核心 2026年第2期31-39,共9页
为方便临床上检测腐败梭菌血清样本,以及评价腐败梭菌疫苗对动物的免疫效果,本试验利用大肠杆菌表达系统诱导α毒素重组蛋白的表达,经纯化后免疫BALB/c小鼠,制备α毒素单克隆抗体。以筛选的单抗为捕获抗体,通过棋盘滴定法优化反应条件,... 为方便临床上检测腐败梭菌血清样本,以及评价腐败梭菌疫苗对动物的免疫效果,本试验利用大肠杆菌表达系统诱导α毒素重组蛋白的表达,经纯化后免疫BALB/c小鼠,制备α毒素单克隆抗体。以筛选的单抗为捕获抗体,通过棋盘滴定法优化反应条件,建立腐败梭菌α毒素抗体的竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,利用该方法检测绵羊血清样本的阴阳性临界值,并评估其重复性、灵敏度、特异性和符合率,同时检测牛血清样本的阴阳性临界值。结果显示,成功诱导表达和纯化出约65 kDa的目的蛋白;通过杂交瘤技术筛选获得1株稳定分泌特异性抗体的单抗8H2;竞争ELISA最佳抗原包被条件为300 ng/孔、16 h,血清稀释度为1∶1,单抗稀释度为1∶2000,封闭条件为1%牛血清白蛋白(BSA)、90 min,血清和单抗竞争时间为90 min,二抗稀释度为1∶15000、孵育30 min,显色时间为15 min;该方法检测绵羊血清样本的阳性临界值为27.19%,阴性临界值为22.59%;批间和批内变异系数均低于10%,重复性良好;标准阳性血清稀释度为1∶16时仍为阳性;与产气荚膜梭菌、布鲁氏菌和鼠伤寒沙门菌均无交叉反应,特异性良好;利用该方法检测100份绵羊血清样本,与间接ELISA的检测总符合率为89.00%(89/100);检测牛血清样本的阳性临界值为20.00%,阴性临界值为16.30%。本试验成功制备了1株腐败梭菌α毒素特异性单抗,并构建了抗体竞争ELISA检测方法,为腐败梭菌病的早期诊断和疫苗免疫效果评价提供了技术支撑。 展开更多
关键词 腐败梭菌 Α毒素 单克隆抗体 竞争elisa
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基于RdRp蛋白的兔出血症病毒感染与免疫鉴别诊断ELISA方法的建立
7
作者 朱薇 仇汝龙 +7 位作者 陈萌萌 胡波 魏后军 范志宇 葛雷 伍孟婷 宋艳华 王芳 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第1期414-422,共9页
为建立区别兔出血症病毒(RHDV)感染与疫苗免疫的诊断ELISA方法,本研究通过原核表达系统表达RHDV1和RHDV2 RdRp蛋白,成功纯化获得这两种可溶性RdRp蛋白,并以RdRp蛋白作为包被抗原,建立检测抗RdRp血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,经纯... 为建立区别兔出血症病毒(RHDV)感染与疫苗免疫的诊断ELISA方法,本研究通过原核表达系统表达RHDV1和RHDV2 RdRp蛋白,成功纯化获得这两种可溶性RdRp蛋白,并以RdRp蛋白作为包被抗原,建立检测抗RdRp血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,经纯化和酶切后,获得不含标签蛋白的RdRp蛋白,约为57 ku。经Western blot验证,2种RdRp蛋白均与RHDV1或RHDV2感染血清发生特异性反应且无型别间差异。因此,选择RHDV2-RdRp作为包被抗原,包被浓度为2.5μg·mL^(-1);最佳血清稀释度为1∶100,孵育时间为37℃60 min;酶标抗体的最佳稀释度为1∶10000;临界值为0.225。经验证,该ELISA方法具有较好的特异性和敏感性;其批内、批间重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的稳定性。通过对RHDV攻毒后样本及基因工程疫苗免疫后血清样本进行检测。结果显示,RHDV感染后可以诱导机体产生针对RdRp蛋白的血清抗体,而基因工程疫苗免疫后血清检测为阴性。本研究基于RHDV-RdRp蛋白所建立的ELISA方法可以对基因工程疫苗免疫和RHDV感染进行区分,为筛查RHDV的临床感染提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp) 间接elisa
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牛结节性皮肤病病毒A33R蛋白的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 包燕玲 宋昱庆 +6 位作者 户鑫兵 钟匀汝 田占成 苟惠天 关贵全 殷宏 独军政 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第3期335-341,共7页
为了建立一种快速准确的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ELISA抗体检测方法,本研究参考GenBank中的LSDV A33R基因序列,设计截去编码跨膜区片段,密码子优化后合成该截短基因并克隆至原核表达质粒pET-28a,构建了重组质粒pET-28a-A33R_(Δ45-67 a... 为了建立一种快速准确的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ELISA抗体检测方法,本研究参考GenBank中的LSDV A33R基因序列,设计截去编码跨膜区片段,密码子优化后合成该截短基因并克隆至原核表达质粒pET-28a,构建了重组质粒pET-28a-A33R_(Δ45-67 aa),IPTG诱导表达A33R_(Δ45-67 aa)蛋白,纯化后以其作为诊断抗原建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示,利用大肠杆菌成功表达并纯化获得分子质量为21 k Da的重组A33R_(Δ45-67aa)蛋白,并建立了LSDV间接ELISA抗体检测方法,该方法具有良好的特异性和敏感性。批间和批内重复试验变异系数均低于10%,表明该间接ELISA方法重复性良好,稳定性高。该方法与IDScreen^(®)Capripox双抗原夹心ELISA试剂盒检测结果总符合率为97.7%,表明其可用于LSDV的抗体检测,将为LSD的防控提供技术支撑。 展开更多
关键词 牛结节性皮肤病病毒 A33R_(Δ45-67aa)蛋白 截短表达 间接elisa
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基于牛病毒性腹泻病毒核心蛋白C间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 贾东鹭 阮武营 +11 位作者 刘飞飞 李星仪 杨澳飞 尹波 陈慧敏 陈建 魏颖 何雷 余祖华 马雪连 丁轲 陈松彪 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期63-70,共8页
为建立基于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C的间接ELISA检测方法,通过PCR扩增出BVDV C基因,克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-C,经IPTG诱导表达纯化后免疫BABL/c小鼠制备多克隆抗体,以C蛋白为包被抗原,建立间接ELISA检... 为建立基于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C的间接ELISA检测方法,通过PCR扩增出BVDV C基因,克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-C,经IPTG诱导表达纯化后免疫BABL/c小鼠制备多克隆抗体,以C蛋白为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,pET-32a-C重组质粒构建成功,重组C蛋白大小约为30 k Da,能够以可溶形式表达,30℃、0.8 mmol/L IPTG诱导6 h可溶性表达最佳;该蛋白免疫BABL/c小鼠后制备血清抗体效价为1∶128000,能够特异性识别C蛋白。该ELISA检测方法的最适条件为:0.5μg/m L抗原37℃包被2 h,10 g/L BSA溶液37℃封闭3 h,1∶16000稀释血清孵育2 h,二抗孵育40 min,避光显色10 min,阴阳性临界值判定标准为0.224,具有良好的特异性和重复性。利用本方法对未免疫接种的疑似BVDV感染的牛血清进行检测,与RT-qPCR核酸检测方法相比,二者阳性符合率达94.73%。上述结果表明,基于C蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为BVDV临床诊断及开发基于C蛋白的间接ELISA检测试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 核心蛋白C 原核表达 多克隆抗体 间接elisa
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牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立
10
作者 赵嘉豪 李树凡 +4 位作者 薛凤 王君 张灿 刘文华 徐守振 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期56-62,共7页
为了制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体及建立抗原捕获ELISA检测方法,采用大肠杆菌原核表达的BVDV Erns截短蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后利用细胞融合和杂交瘤筛选,选用效价高的单克隆抗体,通过条件优化建立BVDV抗原捕获ELISA检测方法... 为了制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体及建立抗原捕获ELISA检测方法,采用大肠杆菌原核表达的BVDV Erns截短蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后利用细胞融合和杂交瘤筛选,选用效价高的单克隆抗体,通过条件优化建立BVDV抗原捕获ELISA检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行了验证,并与IDEXX商品化试剂盒及RT-PCR进行临床样品符合。结果显示,获得2株效价较高的Ig G1型单克隆抗体杂交瘤细胞2B3、2B10,轻链均为κ链。选用效价更高的2B10单克隆抗体作为检测抗体,家兔源BVDV多克隆抗体作为捕获抗体,建立的BVDV抗原捕获ELISA与临床常见病原(牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛支原体)无交叉反应,最低可检测102.53TCID50的BVDV病毒液,批内和批间变异系数均低于5%,与IDEXX试剂盒和RT-PCR的总体符合率分别为91.76%~93.33%和94.12%~96.67%。结果表明,基于2B10单克隆抗体建立的BVDV抗原捕获ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为BVDV的检测和防控提供了借鉴和技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 Erns蛋白 单克隆抗体 elisa
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动物源弯曲杆菌免疫显性抗原鉴定及间接ELISA检测方法的建立
11
作者 杨欢 王策 +6 位作者 王玉飞 赵晶 张会强 曹易博 姬钰浩 邓兴梅 张辉 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第3期1418-1433,共16页
【目的】筛选胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)血清免疫显性抗原,初步建立动物弯曲杆菌病血清学ELISA诊断方法。【方法】利用生物信息学分析软件对候选抗原进行分析筛选,用pET-28a(+)原核表达载... 【目的】筛选胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)血清免疫显性抗原,初步建立动物弯曲杆菌病血清学ELISA诊断方法。【方法】利用生物信息学分析软件对候选抗原进行分析筛选,用pET-28a(+)原核表达载体构建重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白。通过SDS-PAGE和His标签抗体Western blotting检测蛋白表达情况。制备兔源弯曲杆菌多克隆抗体并将其作为Western blotting一抗验证抗原与多克隆抗体反应原性。建立间接ELISA检测方法,优化抗原包被浓度、封闭液及封闭时间、一抗和二抗稀释度及反应时间等反应条件,确定临界值,评价其特异性、灵敏性、重复性。【结果】利用生物信息学分析软件筛选出胎儿弯曲杆菌抗原SapA、空肠弯曲杆菌抗原FlaA。原核表达纯化后,Western blotting检测SapA蛋白大小为101 ku,FlaA蛋白大小为59 ku。制备的胎儿弯曲杆菌兔多克隆抗体血清效价为1∶64000,空肠弯曲杆菌兔多克隆抗体效价为1∶128000。Western blotting结果表明,抗原SapA、FlaA特异性识别弯曲杆菌多克隆抗体,具有良好的反应原性。以纯化的SapA蛋白作为包被抗原,确定的最优包被浓度为2.5μg/mL,封闭液为5%BSA,封闭时间30 min,一抗、二抗稀释度分别为1∶500和1∶8000,孵育时间分别为30和90 min。以纯化的FlaA蛋白作为包被抗原,确定最优包被浓度为0.4μg/mL,封闭时间1 h,其余条件与前者一致。二者与结核分枝杆菌(MTB)、副结核分枝杆菌(MAP)及布鲁氏菌(Brucella)均无交叉反应,特异性强。SapA间接ELISA方法的灵敏性最低达到1∶6400,FlaA间接ELISA方法的灵敏性达到1∶12800。批内和批间重复性试验变异系数均<10%,证明其重复性好。【结论】本研究成功鉴定了胎儿弯曲杆菌免疫显性抗原SapA、空肠弯曲杆菌免疫显性抗原FlaA,建立了动物弯曲杆菌病血清学间接ELISA诊断方法,为弯曲杆菌病防控提供了有效的诊断抗原及快速诊断方法。 展开更多
关键词 弯曲杆菌 免疫显性抗原 原核表达 Western blotting 间接elisa
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小鼠莱姆病血清学间接ELISA实验室诊断方法的建立
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作者 翟斌涛 包碧波 +4 位作者 马少霞 李甲 周雅馨 李冰 张继瑜 《中国比较医学杂志》 北大核心 2026年第3期93-99,共7页
目的本研究建立了一种基于伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)SZ株全菌抗原的小鼠莱姆病血清学间接ELISA实验室诊断方法,为莱姆病的实验室诊断及流行病学监测提供标准化技术支撑。方法通过系统优化实验条件,确定最佳抗原包被浓度、血清稀... 目的本研究建立了一种基于伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)SZ株全菌抗原的小鼠莱姆病血清学间接ELISA实验室诊断方法,为莱姆病的实验室诊断及流行病学监测提供标准化技术支撑。方法通过系统优化实验条件,确定最佳抗原包被浓度、血清稀释比和酶标二抗浓度。制备小鼠感染模型,采集不同时间点血清,评估伽氏疏螺旋体与伯氏疏螺旋体B31株及阿氏疏螺旋体BO23株的交叉反应。结果确定间接ELISA最佳反应体系为:抗原包被浓度0.2μg/μL、血清稀释比1∶200、酶标二抗浓度1∶2000。该方法在保持高灵敏度(OD值>0.8)的同时,显著降低了抗原用量。小鼠感染后12~25 d抗体水平达到峰值,特异性抗体比率(ABR%)阈值为41.7%,用于区分阳性和阴性样本。交叉反应分析表明,该方法与BO23株存在一定交叉,与B31株无明显交叉。结论本研究成功建立了一种操作简便、经济高效的小鼠莱姆病间接ELISA诊断方法,适用于基层实验室及小规模筛查,为莱姆病的实验室诊断和流行病学监测提供了可靠的技术支持。 展开更多
关键词 莱姆病 间接elisa 小鼠模型 伽氏疏螺旋体 血清学诊断
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猪瘟病毒双抗原夹心ELISA抗体检测方法的建立与应用
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作者 谢亚格 罗俊聪 +9 位作者 石正旺 廖焕程 陈婕 朱昱茜 王琳 杨倩倩 武嘉惠 茹毅 田宏 何继军 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第3期1571-1580,共10页
旨在建立检测猪瘟病毒E2蛋白抗体的双抗原夹心ELISA方法。利用BioEdit软件对比猪瘟病毒与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白完整序列,筛选猪瘟病毒E2蛋白特异性序列,构建pCDNA3.1-2×rE2-His重组表达载体,通过CHO细胞表达2×rE2-His蛋白,... 旨在建立检测猪瘟病毒E2蛋白抗体的双抗原夹心ELISA方法。利用BioEdit软件对比猪瘟病毒与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白完整序列,筛选猪瘟病毒E2蛋白特异性序列,构建pCDNA3.1-2×rE2-His重组表达载体,通过CHO细胞表达2×rE2-His蛋白,采用凝血酶切除蛋白His标签,将切除His标签的2×rE2蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的2×rE2-His蛋白作为检测抗原,经过一系列的反应条件优化,建立了双抗原夹心ELISA方法,对其特异性、敏感性、重复性进行评估,并比较与商品化试剂盒的符合率。结果表明,该方法的抗原包被浓度为0.5μg·mL^(-1),血清稀释度为1∶4,酶标抗原稀释度为1∶40000;该方法与其他常见猪病(塞内卡病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒)阳性血清无交叉反应、与血清学检测中易发生交叉反应的牛病毒性腹泻病毒阳性血清不反应,具有良好的特异性;可检测抗体阳性血清的最大稀释比例达1∶2048;批内、批间变异系数均小于10%,具有良好的重复性;与IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒的检测结果符合率为97.1%。本研究建立的双抗原夹心ELISA检测方法和IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒同时评价猪瘟活疫苗(C株)联合E2亚单位疫苗免疫的2只健康猪抗体消长规律,本方法可提前6 d检出抗体应答,两种方法均显示抗体水平在免疫后37 d达到高峰,随后趋于稳定。本研究建立的猪瘟病毒双抗原夹心ELISA抗体检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,适用于猪瘟的临床诊断与免疫效果评估。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 elisa
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羊副结核分枝杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用
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作者 高云洁 郭若男 +9 位作者 陈春文 段祎凡 张镇均 聂蝉蝉 李梦雨 王慧 冯婷婷 崔莹莹 党光辉 刘思国 《中国农业科学》 北大核心 2026年第3期655-667,共13页
【目的】建立一种基于间接ELISA法的检测技术,用于检测羊副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis, MAP)特异性抗体,以期为羊副结核病(Johne’s disease, JD)的流行病学监测与防控提供一种高效、可靠的血清学方法。... 【目的】建立一种基于间接ELISA法的检测技术,用于检测羊副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis, MAP)特异性抗体,以期为羊副结核病(Johne’s disease, JD)的流行病学监测与防控提供一种高效、可靠的血清学方法。【方法】选用前期分离菌株(MAP-XJB13)的培养上清作为MAP包被抗原,通过对包被液和包被条件、封闭液和封闭条件、抗原包被浓度、血清稀释比例、抗体孵育和显色时间、显色液品牌、样品稀释液和酶标二抗保护液的筛选和优化,确定间接ELISA最佳反应条件和临界值。通过敏感性、特异性、重复性、保存期和符合率评价已建立的羊MAP间接ELISA抗体检测方法的效果。最后,使用初步组装的试剂盒应用于黑龙江和内蒙古羊的临床样品检测。【结果】确定ELISA最佳反应条件为:包被液为CBS缓冲液,包被条件为37℃4 h,封闭液为5%鱼明胶+5%海藻糖+12%PEG4000,封闭条件为37℃2 h,抗原包被浓度为80µg·mL-1,血清稀释度为1﹕40,酶标二抗血清稀释度为1﹕30 000,孵育条件为25℃条件下、一抗孵育30 min、酶标二抗孵育30 min、显色15 min,显色液为博奥龙,样品稀释液为1%卵清蛋白+0.5%海藻糖,酶标二抗保护液为0.1%卵清蛋白;建立的羊MAP间接ELISA抗体检测方法临界值为0.460,敏感性为95.89%,特异性为96.12%;交叉反应结果显示,在阴阳性结果成立的前提下,与羊布鲁氏菌阳性血清、绵羊丝状支原体阳性血清、山羊伪结核棒状杆菌阳性血清、羊结核阳性血清、山羊小反刍兽疫阳性血清、绵羊小反刍兽疫阳性血清和羊痘病毒阳性血清无交叉反应性;批内和批间变异系数分别在0.754%—7.812%和1.252%—7.277%之间,可稳定保存8个月;羊MAP间接ELISA抗体检测试剂盒与ID.vet副结核菌ELISA抗体检测试剂盒阳性符合率为95.89%,阴性符合率为95.55%,总符合率为95.56%。黑龙江和内蒙古两地的羊MAP的抗体阳性率为10.81%。【结论】成功开发了一种针对羊MAP的间接ELISA抗体检测方法。该方法表现出优良的特异性、较高的敏感性以及较长的保存期限,为JD的防控提供了有力的技术支持。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 羊副结核 间接elisa 抗体检测 MAP-XJB13菌株
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ELISA法与UPLC-MS/MS法检测水产品中喹诺酮类药物残留的比较分析
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作者 张乐 徐加兵 +2 位作者 孙伟翔 江翰 杨海峰 《中国饲料》 北大核心 2026年第3期156-163,共8页
采用酶联免疫法(ELISA)和超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)检测市售6种水产品中14种喹诺酮类药物(QNs)残留的效果,旨在比较两种方法结果的差异性和相关性。其中,UPLC-MS/MS法参考国家标准GB/T 20366-2006进行检测分析,建立14... 采用酶联免疫法(ELISA)和超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)检测市售6种水产品中14种喹诺酮类药物(QNs)残留的效果,旨在比较两种方法结果的差异性和相关性。其中,UPLC-MS/MS法参考国家标准GB/T 20366-2006进行检测分析,建立14种QNs药物标准曲线,外标法进行定量分析的结果与ELISA法比较。结果表明:ELISA法检测QNs类药物样品阳性检出率为78.57%,UPLC-MS/MS法检出率为64.29%,环丙沙星最高残留量在黄颡鱼头中为15.76μg/kg,恩诺沙星UPLC-MS/MS法的阳性检出率为64.29%,且最高残留量高达2128.41μg/kg。其中ELISA法样品检出率普遍高于UPLC-MS/MS法,说明ELISA法存在假阳性的情况。鉴于ELISA法分析速度快,样品前处理方法简单等优点,适合用于大批量的样品初筛,UPLC-MS/MS法准确度高,重现性好,可用于ELISA法阳性结果的验证和更精确的药物残留含量测定。本实验为水产品中监测QNs药物残留提供新的检测思路,可结合实际工作情况,选择更快更好的方法,为水产品中用药或水产养殖饲料添加剂的QNs类药物残留检测提供技术支持。 展开更多
关键词 elisa法 UPLC-MS/MS法 喹诺酮类药物 水产品
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小鼠细小病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立
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作者 陈莉 张旭亮 +3 位作者 刘彪 吴伟 马畅 赵迎峰 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第3期326-334,共9页
制备小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白单克隆抗体,建立一种基于双抗体夹心ELISA的实验动物小鼠MVM抗原检测方法。应用原核表达质粒表达VP2蛋白,纯化蛋白免疫雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体,以获得的单抗1C5作为捕获抗体,HRP标记的单抗8B9作为检... 制备小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白单克隆抗体,建立一种基于双抗体夹心ELISA的实验动物小鼠MVM抗原检测方法。应用原核表达质粒表达VP2蛋白,纯化蛋白免疫雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体,以获得的单抗1C5作为捕获抗体,HRP标记的单抗8B9作为检测抗体,优化条件建立双抗体夹心ELISA检测方法,并对其灵敏性、特异性和重复性进行系统评价并与qPCR检测进行比对分析。结果显示,表达纯化了MVM VP2蛋白,免疫雌性BALB/c小鼠,免疫程序结束后筛选获得2株单克隆抗体,命名为1C5和8B9,Western-blot和间接免疫荧光鉴定发现这2株抗体可与MVM病毒和重组蛋白特异性结合。以1C5作为捕获抗体,HRP标记的8B9作为检测抗体建立了双抗体夹心ELISA方法,其对MVM病毒和重组蛋白最低检测限分别为103.4TCID50/m L和50 ng/m L;与4种常见病毒感染的小鼠血清均无交叉反应,包被ELISA板条的批间变异系数均小于10%,与qPCR检测结果相比总符合率为100%。结果表明,成功制备了2株MVM单克隆抗体,应用这2株抗体建立的MVM双抗体夹心ELISA方法具有较好的灵敏性和特异性,与qPCR检测法相比一致性较好,为实验动物小鼠的临床诊断、高通量筛查监测提供了有效的检测方法,从而保障实验动物的SPF状态,为生命科学研究提供健康可靠的实验动物。 展开更多
关键词 小鼠细小病毒 单克隆抗体 双抗体夹心elisa 抗原检测
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E种牛肠道病毒VP1蛋白的截短表达及抗体间接ELISA检测方法的建立
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作者 崔平 刘澜 +3 位作者 李本科 白耀国 李玉坤 管宇 《中国兽医杂志》 北大核心 2026年第2期40-48,共9页
为了开展E种牛肠道病毒(BEV-E)的流行病学调查和抗体筛查,本试验采用原核表达技术对BEV-E外衣壳蛋白VP1进行体外截短表达,采用His-Tag蛋白纯化柱对VP1重组蛋白进行纯化,采用蛋白免疫印迹(WB)方法对重组蛋白进行鉴定。以纯化的VP1重组蛋... 为了开展E种牛肠道病毒(BEV-E)的流行病学调查和抗体筛查,本试验采用原核表达技术对BEV-E外衣壳蛋白VP1进行体外截短表达,采用His-Tag蛋白纯化柱对VP1重组蛋白进行纯化,采用蛋白免疫印迹(WB)方法对重组蛋白进行鉴定。以纯化的VP1重组蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化和确定临界值,建立了检测BEV-E抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,并进行特异性、灵敏性、重复性、符合率试验和临床样品检测。结果显示,成功表达VP1重组蛋白;间接ELISA检测方法的最佳抗原工作浓度为15.0μg/mL,最佳一抗稀释倍数为1∶80,最佳酶标二抗稀释倍数为1∶3000,最佳封闭液为10%马血清,最佳一抗、酶标二抗、封闭液工作时间分别为30、30、60 min;临界值为0.386;与牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、产肠毒素性大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,特异性良好;BEV-E阳性血清1∶25600稀释时仍可检测出阳性,灵敏性较高;批内和批间变异系数均小于10%,重复性良好;该方法与间接免疫荧光检测方法的符合率为92.5%;临床样品检测结果显示,BEV-E抗体平均阳性率为7.88%。结果表明,本试验建立的BEV-E VP1抗体间接ELISA检测方法为开展BEV-E临床诊断和流行病学调查提供了试验依据。 展开更多
关键词 E种牛肠道病毒(BEV-E) VP1蛋白 截短表达 抗体检测 间接elisa
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基于猪流行性腹泻病毒S蛋白夹心ELISA定量的疫苗质控方法的建立及验证
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作者 张承凤 杜久斌 +4 位作者 曹光辉 陈晓洁 黎明 贺笋 杨延丽 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第2期216-224,共9页
本试验旨在建立一种准确、灵敏的定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的夹心ELISA方法,用于PED疫苗的质量控制。采用重组PEDV全长S蛋白作为标准品,测定家兔源单克隆抗体GC44F3-1和GC32C11-5与PEDV S蛋白标准品的亲和力;优化夹心ELISA条... 本试验旨在建立一种准确、灵敏的定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的夹心ELISA方法,用于PED疫苗的质量控制。采用重组PEDV全长S蛋白作为标准品,测定家兔源单克隆抗体GC44F3-1和GC32C11-5与PEDV S蛋白标准品的亲和力;优化夹心ELISA条件,验证方法的检测线性、检测限、准确性、重复性、稀释平行性及特异性;监测PEDV S蛋白标准品与预包被的ELISA酶标板保存稳定性,验证方法作为质控方法的可行性。制备的PEDV S蛋白纯度>90%,尺寸均一性较好;GC44F3-1和GC32C11-5的结合速率常数k_(on)分别为4.294×10^(5)和9.445×10^(4)(mol/L)^(-1)·s^(-1),二者解离速率常数k_(off)<1×10^(-7)s^(-1),解离常数Kd<10^(-12)mol/L。ELISA最优检测条件为:捕获抗体2μg/m L,检测抗体0.125μg/m L,捕获抗体4℃过夜包被,抗原37℃孵育1 h,检测抗体37℃孵育1 h,Streptavidin-HRP 37℃孵育25 min,37℃显色15 min。方法学验证表明,该方法具有良好的检测线性(R^(2)=0.9993,n=7),检测限为0.098 ng/m L;高、中、低3个浓度的PEDV S蛋白标准品回收率为94.5%~100.2%,加标回收率为84.3%~98.1%;批内和批间检测CV<5%,重复性良好;不同稀释倍数下检测值CV<5%,稀释平行性好;仅对PEDV检测时结果呈阳性,特异性良好。PEDV S蛋白标准品和预包被的ELISA酶标板稳定保存12个月。该方法能够用于不同生产过程样品的检测和不同批次乳化样品的保存稳定性监测。本研究建立的PEDV S蛋白夹心ELISA定量检测方法具有灵敏、准确、稳定等优点,对PED疫苗质量控制具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 双抗体夹心elisa 疫苗 质量控制
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QC实验室自动化ELISA平台的开发与应用
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作者 陈婧 李博洋 《中国药品标准》 2026年第1期109-116,共8页
目的:生物活性检测作为生物药质量控制的核心环节,其方法可靠性直接影响药效评估。基于ELISA的活性检测虽能精准表征药物-靶点结合特性,但传统手动操作存在操作误差累积、变异度高、人为失误高及检测通量低等问题。方法:基于Microlab ST... 目的:生物活性检测作为生物药质量控制的核心环节,其方法可靠性直接影响药效评估。基于ELISA的活性检测虽能精准表征药物-靶点结合特性,但传统手动操作存在操作误差累积、变异度高、人为失误高及检测通量低等问题。方法:基于Microlab STARplus构建全自动化ELISA平台,整合了高精度移液模块及外接设备。结果:自动化系统不仅满足准确度及精密度的要求,且较手动操作显著降低了变异性。结论:自动化平台实现从样品预处理到检测的全闭环操作,且标准化操作程序与数据可追溯功能,有效保障了数据完整性。 展开更多
关键词 elisa 相对活性 自动化 质量控制 生物药
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5种国产狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的比对
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作者 王培 李佳 +11 位作者 郑博君 赵浩军 张跃 程汝佳 殷雨晴 郑雪莹 刘海莹 史记 朱琳琳 杨金鹏 余琦 梅力 《中国动物检疫》 2026年第2期140-146,共7页
为评估国产狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的性能,以荧光抗体病毒中和试验(FAVN)为“金标准”,对74份包含不同狂犬病病毒抗体水平的临床血清样品,分别使用FAVN和5种ELISA试剂盒(A—E)进行检测,分析评估试剂盒的诊断效能、一致性和差异性... 为评估国产狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的性能,以荧光抗体病毒中和试验(FAVN)为“金标准”,对74份包含不同狂犬病病毒抗体水平的临床血清样品,分别使用FAVN和5种ELISA试剂盒(A—E)进行检测,分析评估试剂盒的诊断效能、一致性和差异性,并对定量试剂盒A和B进行相关性评估。结果显示:试剂盒A性能最佳,敏感性、特异性及符合率均超过90%,Kappa系数为0.835,其检测结果与FAVN方法一致性极强,且无统计学差异(P>0.05);试剂盒B、D、E性能次之,敏感性、特异性及符合率均超过80%,Kappa系数均大于0.6,检测结果与FAVN方法具有高度一致性,且无统计学差异(P>0.05);试剂盒C敏感性较低(66.67%),Kappa系数为0.578,且检测结果与FAVN差异显著(P<0.05)。依据不同抗体效价范围分别计算各试剂盒的符合率,当抗体效价接近临界值(0.5 IU/mL)时,所有试剂盒符合率均下降;定量试剂盒A和B检测结果与FAVN呈高度正相关(r值分别为0.888和0.794)。研究表明,国产试剂盒适用于血清样品的定性评估,也可较好地反映中和抗体水平的变化。本研究为国产狂犬病ELISA试剂盒的选择和应用提供了依据。 展开更多
关键词 狂犬病 抗体检测 elisa FAVN 试剂盒比对
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