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猪瘟病毒E2基因部分表位区重组猪伪狂犬病病毒的构建及生物学特性研究
1
作者 王林青 张刘辉 +3 位作者 陈曦艋 马世杰 宋月 陈红英 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第4期1815-1824,共10页
【目的】猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)是当前影响生猪产业发展的两种重要病原,目前无高效的药物治疗方法,主要依靠疫苗接种进行预防。本试验旨在构建含有CSFV E2基因部分表... 【目的】猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)是当前影响生猪产业发展的两种重要病原,目前无高效的药物治疗方法,主要依靠疫苗接种进行预防。本试验旨在构建含有CSFV E2基因部分表位区的重组PRV毒株,并探究其生物学特性,为开发同时预防CSFV和PRV的二联疫苗提供参考。【方法】首先使用基因工程技术将包含CSFV E2蛋白B/C/D/A 4个表位区的一段基因插入pG-EGFP重组质粒的BamHⅠ位点,构建重组质粒pG-E2AD-EGFP;然后将质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV NY-gE^(-)/gI^(-)/TK^(-)的ST细胞,在ST细胞内发生同源重组,利用蚀斑纯化法拯救出带绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-E2AD-EGFP。使用CRISPR/Cas9敲除载体敲除EGFP基因,经蚀斑纯化得到无荧光的重组病毒rPRV-E2AD。利用PCR扩增和Western blotting检测重组病毒rPRV-E2AD的E2基因A-D表位区表达情况。通过半数组织培养感染剂量(TCID50)法检测不同理化性质处理后病毒增殖情况,对重组病毒培养特性、理化特性进行评价。【结果】通过细胞内同源重组和病毒蚀斑纯化,得到了同时表达CSFV E2AD抗原和EGFP的重组病毒rPRV-E2AD-EGFP。通过CRISPR/Cas9技术敲除EGFP基因,得到了无EGFP基因表达的重组病毒rPRV-E2AD。Western blotting检测结果显示,该毒株表达蛋白大小约27 ku,与预期CSFV E2AD抗原大小一致。rPRV-E2AD毒株与亲本株在ST、IPEC-J2、PK-15、Vero细胞中生长特性基本一致,均在感染后12 h引起细胞融合,36 h出现细胞脱落。理化特性检测结果显示,重组毒株与亲本株在相同理化条件处理下,培养特性相似。【结论】本研究成功获得重组病毒rPRV-E2AD,且外源基因不影响亲本株的增殖特性,试验结果为研发重组CSFV E2基因活载体疫苗提供了候选毒株,也为PRV活载体疫苗的开发提供了研究基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒(CSFV) 伪狂犬病病毒(PRV) 重组病毒 e2基因
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12株猪瘟病毒E2基因主要抗原区域的序列差异分析 被引量：23
2
作者 王琴 王在时 +2 位作者 赵耘 李博 丘惠深 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期614-621,共8页
用RT PCR扩增了 1 2个不同时期分离的HCV毒株E2基因主要抗原区域的cDNA片段并对其进行了序列测定。应用DNAstar序列分析软件对所测的 1 2个HCV毒株与国内外已知的 6个毒株Alfort株、Ald株、Brescia株、Gpe株、C株、CW株及早期已测定的H... 用RT PCR扩增了 1 2个不同时期分离的HCV毒株E2基因主要抗原区域的cDNA片段并对其进行了序列测定。应用DNAstar序列分析软件对所测的 1 2个HCV毒株与国内外已知的 6个毒株Alfort株、Ald株、Brescia株、Gpe株、C株、CW株及早期已测定的HCLV株、HCVSM株和北京顺义株 (BJSY2 /96) 3个毒株的相应片段进行了同源性比较分析。E2基因主要区域长度均为 2 2 4bp ,包括从HCV 2 4 85到 2 70 8位的E2基因B、C区域。所测的疫苗株HCLV与国外测得的疫苗株C株核苷酸及氨基酸同源性分别为 99 1 %和 1 0 0 % ,表明目前应用的疫苗株是稳定的 ;用目前我国流行的部分野毒株对HCLV株免疫猪的攻击试验表明 ,HCLV对野毒株均具有很好的免疫力 ,这与序列分析结果相吻合。根据系统树分析 ,可将HCV分为两大群 ,5株 90年代的野毒株及 1株 80年代的野毒株 (其中北京 3株、河南 2株、广东 1株 )均与国内外C株、标准株属同一群 (即第一群 ) ,其核苷酸及氨基酸的同源性分别为85 7%～ 1 0 0 %和 83 8%～ 1 0 0 % ;与Alfort株同属第二群的有 6个野毒株 (广西北海、辽宁、河北黄骅、吉林、深圳光明、四川成都 ) ,其中 80年代与 90年代的野毒株各有三株 ,核苷酸及氨基酸的同源性分别为 84 3%～ 1 0 0 %和 85 1 %～ 1 0 0 % ;2 1株HCV的核苷酸? 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 序列分析
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猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性 被引量：14
3
作者 余兴龙 涂长春 +3 位作者 徐兴然 张茂林 陈义祥 刘伯华 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期439-443,共5页
用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平... 用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平均可达菌体蛋白总量的 2 8%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 定点突变 大肠杆菌 表达产物 免疫原性
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猪瘟病毒流行毒株E2基因密码子优化及在酵母中的高效表达 被引量：13
4
作者 韩雪清 刘湘涛 +2 位作者 张永国 张涌 谢庆阁 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期560-568,共9页
密码子的偏嗜性是影响基因异源表达的重要参数之一 ,优化密码子序列能够提高外源基因的表达水平。野生型猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达量较低 ,为了提高E2基因在毕赤酵母中的表达水平 ,利用PCR基础上的定点突变技术将E2基因上的毕... 密码子的偏嗜性是影响基因异源表达的重要参数之一 ,优化密码子序列能够提高外源基因的表达水平。野生型猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达量较低 ,为了提高E2基因在毕赤酵母中的表达水平 ,利用PCR基础上的定点突变技术将E2基因上的毕赤酵母低利用密码子突变为其高利用率的简并密码子。结果表明 ,替换野生型E2基因上 2 4个酵母低利用密码子后 ,E2基因在酵母中表达水平有较显著提高 。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 密码子优化 酵母中 表达
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急、慢性猪瘟病毒分离株和疫苗株E2基因的序列分析 被引量：10
5
作者 刘伯华 刘湘涛 +3 位作者 韩雪清 赵启祖 李明晖 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期568-575,共8页
利用反转录 (RT)及套式PCR(N -PCR)扩增并测定了 6株具有不同表症近期甘肃省猪瘟流行野毒及C -株细胞疫苗毒的主要免疫原E2基因的核苷酸序列。序列分析比较结果表明 ,6株流行野毒与C -株疫苗毒的核苷酸同源性为 82 %～ 84 % ,流行野毒... 利用反转录 (RT)及套式PCR(N -PCR)扩增并测定了 6株具有不同表症近期甘肃省猪瘟流行野毒及C -株细胞疫苗毒的主要免疫原E2基因的核苷酸序列。序列分析比较结果表明 ,6株流行野毒与C -株疫苗毒的核苷酸同源性为 82 %～ 84 % ,流行野毒之间的核苷酸同源性在 89%～99%之间 ,并且明显可分为二个组群 ,病毒株所属组群与其临床症状有一定的相关性。流行野毒与C -株毒在中和抗原决定簇上有部分氨基酸存在性质差异 ,可能影响C -株毒对流行野毒的中和滴度。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 序列分析 分离株 疫苗株
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猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究 被引量：9
6
作者 韩雪清 刘湘涛 +2 位作者 张涌 谢庆阁 田波 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期208-211,共4页
将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中 ,酶切线性化后电穿孔导入Pichiapastoris进行整合 ,经G418筛选得到高拷贝转化子 ,甲醇诱导表达。SDS PAGE和Westernblot结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P .
关键词 猪瘟病毒 e2基因 毕赤酵母 表达 免疫活性
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22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的序列分析 被引量：9
7
作者 赵耘 王在时 +2 位作者 王琴 李博 丘惠深 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期42-48,共7页
利用RT PCR方法获得了 1 3株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的扩增片段 ,并对其进行了测序 ,得到了 2 5 1bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中 2 2 4bp的片段进行了... 利用RT PCR方法获得了 1 3株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的扩增片段 ,并对其进行了测序 ,得到了 2 5 1bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中 2 2 4bp的片段进行了序列分析 ,并与已发表的Alfort、Brescia等毒株进行比较 ,结果 1 3株猪瘟分离株所测片段均为猪瘟病毒E2基因的序列 ,与石门系强毒的序列相比所有毒株的碱基替换随机地分布于整个序列 ,无碱基缺失和碱基插入。其中变化较大的区域位于序列的 3′端。 2 2株HCVE2基因部分编码序列的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为 :78 1 %～ 1 0 0 %、 78 4%～ 1 0 0 % ,其中 1 3株猪瘟病毒流行毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为 :78 1 %～ 1 0 0 %、 78 4%～ 1 0 0 % ,4株 70～ 80年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为 :79 0 %～ 88 3%、 81 1 %～87 8% ,9株 90年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为 :80 8%～ 1 0 0 %、83 8%～ 1 0 0 % ; 展开更多
关键词 猪瘟病毒 序列分析 同源性 变异 e2基因
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猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达 被引量：7
8
作者 李红卫 涂长春 +5 位作者 余兴龙 金扩世 吕宗吉 李茂祥 章金钢 殷震 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期146-152,共7页
应用ＲＴＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因，然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点，将它们连接成为完整的Ｅ２基因，并克隆到ｐＵＣ１９质粒中，获得重组质粒ｐＨＣＥ２。另设计一对引物，... 应用ＲＴＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因，然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点，将它们连接成为完整的Ｅ２基因，并克隆到ｐＵＣ１９质粒中，获得重组质粒ｐＨＣＥ２。另设计一对引物，以ｐＨＣＥ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因，然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ｐＥＴ２８ａ（＋）中，获得重组质粒ｐＢＶＥ２和ｐＥＴＥ２，用酶切、ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插入位置、方向和读码框架的正确性。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和直接ＥＬＩＳＡ检测表明重组质粒ｐＢＶＥ２和ｐＥＴＥ２转化、诱导的受体菌均能表达Ｅ２抗原。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 克隆 表达 原核细胞 猪瘟 诊断
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异源猪瘟病毒C株E2基因保护性抗原编码区的序列分析与比较 被引量：13
9
作者 李红卫 涂长春 +4 位作者 吕宗吉 孙明 金扩世 余兴龙 殷震 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第2期112-114,共3页
应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了我国南京、成都、吉林３个兽医生物制品厂提供的猪瘟病毒兔化弱毒株（Ｃ株）的Ｅ２基因保护性抗原编码区，然后将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，用Ｓａｎｇｅｒ′ｓ双脱氧法对重组质粒中的插入片段进行了序列分析... 应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了我国南京、成都、吉林３个兽医生物制品厂提供的猪瘟病毒兔化弱毒株（Ｃ株）的Ｅ２基因保护性抗原编码区，然后将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，用Ｓａｎｇｅｒ′ｓ双脱氧法对重组质粒中的插入片段进行了序列分析。将测得的这３个厂生产的Ｃ株的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与作者实验室测得的国内石门株和国外测得的Ｃ株相同区域进行同源性比较，发现不同来源的Ｃ株及石门株之间存在不同程度的差异，核苷酸同源性为９３．６％～９９．６％，氨基酸同源性为９０．６％～９８．９％。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 免化弱毒株 e2基因 序列分析
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猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达 被引量：9
10
作者 张永国 刘湘涛 +3 位作者 韩雪清 胡建和 张彦明 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期182-185,共4页
采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM Teasy载体上,测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域,切出目的基因,将目的基因克隆到表达质粒pProEX HTb中,获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因... 采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM Teasy载体上,测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域,切出目的基因,将目的基因克隆到表达质粒pProEX HTb中,获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确,SDS PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白,Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因抗原结构域 A区 B区 C区 D区 大肠杆菌 基因表达
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共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性研究 被引量：10
11
作者 何雷 张彦明 +7 位作者 徐彦召 唐青海 王静 杨小云 代晨 向华 常鹏祥 林鸷 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期385-391,共7页
为研制猪瘟活载体疫苗,构建共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒并研究其免疫原性。应用PCR方法从pMD19-T-E2质粒和pMD19-T-pIL2质粒中分别扩增E2基因和pIL-2基因,将扩增的全长E2基因和pIL-2的编码区基因序列通过柔性... 为研制猪瘟活载体疫苗,构建共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒并研究其免疫原性。应用PCR方法从pMD19-T-E2质粒和pMD19-T-pIL2质粒中分别扩增E2基因和pIL-2基因,将扩增的全长E2基因和pIL-2的编码区基因序列通过柔性接头序列(5个甘氨酸密码子)串联,插入腺病毒穿梭载体AdTrack中,在受体菌中与骨架载体AdEasy同源重组。重组质粒AdEasy-E2-pIL-2转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒rAd-E2-pIL-2。用rAd-E2-pIL-2免疫家兔,经兔体交互免疫试验评定其免疫效果。结果显示,经RT-PCR和West-ern blot检测,成功构建了rAd-E2-pIL-2,重组病毒滴度达108.12PFU/mL。rAd-E2-pIL-2接种家兔后刺激接种兔产生猪瘟病毒特异性抗体,淋巴细胞转化试验结果显示猪瘟病毒诱导兔淋巴细胞特异性增殖,攻毒后rAd-E2-pIL-2接种兔和猪瘟病毒C株接种兔均未出现定型热反应。研究结果表明,rAd-E2-pIL-2免疫兔可以预防猪瘟病毒C株接种引发的体温反应,rAd-E2-pIL-2可望成为猪瘟候选疫苗。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 猪白细胞介素2 重组腺病毒 细胞因子佐剂
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福建地区猪瘟病毒流行株基因分型及E2基因遗传变异分析 被引量：10
12
作者 魏春华 刘建奎 +3 位作者 戴爱玲 曾宇坤 李晓华 杨小燕 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期2009-2013,共5页
为了解福建地区2013—2014年猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,采集了福建地区多个猪场的40份疑似猪瘟样品,应用RT-PCR技术对E2基因的主要抗原编码区进行扩增及序列分析,其中31份为猪瘟阳性。序列分析结果表明,31株CSF... 为了解福建地区2013—2014年猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,采集了福建地区多个猪场的40份疑似猪瘟样品,应用RT-PCR技术对E2基因的主要抗原编码区进行扩增及序列分析,其中31份为猪瘟阳性。序列分析结果表明,31株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为78.5%~100.0%和82.2%~100.0%,与国内外分离株的核苷酸同源性为81.1%~98.9%,氨基酸同源性为79.8%~95.6%;遗传进化树分析表明,31株CSFV属于1.1和2.1亚群,其中23株为1.1亚型,8株为2.1b和2.1c亚群,没有发现2.2和2.3亚群毒株。氨基酸序列分析表明,流行株在免疫逃逸相关位点705,713,729和734位氨基酸发生变异,FJ02毒株B细胞表位关键位点771位氨基酸发生变异,表明福建地区CSFV流行毒株呈现遗传变异多样性。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 RT-PCR 遗传变异
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猪瘟病毒E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点整合载体的构建 被引量：8
13
作者 杨宗岐 李轶女 +2 位作者 张志芳 王勇 沈桂芳 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期2648-2654,共7页
【目的】构建猪瘟病毒主要抗原E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点转化载体,为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体生产动物可直接食用疫苗奠定基础。【方法】通过用BLAST、DNAMAN等分子生物学分析软件对百脉根叶绿体基因组序列进行分析选定同... 【目的】构建猪瘟病毒主要抗原E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点转化载体,为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体生产动物可直接食用疫苗奠定基础。【方法】通过用BLAST、DNAMAN等分子生物学分析软件对百脉根叶绿体基因组序列进行分析选定同源重组片段,采用PCR、分子克隆技术进行载体构建和鉴定。【结果】在百脉根叶绿体基因组中选择合适的外源基因整合位点,设计引物用PCR扩增叶绿体同源片段,将同源片段克隆后,构建百脉根特异的叶绿体转化载体;构建的百脉根叶绿体定点转化载体pAKE2以扩增的1.35kbpsbA和1.5kbtrnK两段相邻叶绿体DNA为定点整合外源基因的同源重组片段,包含以叶绿体基因特异强启动子Prrn和终止子TpsbA为调控序列的E2基因表达盒和aadA壮观霉素抗性基因表达盒。【结论】经PCR和酶切验证,所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。 展开更多
关键词 猪瘟病毒e2基因 叶绿体转化 同源重组 定点整合 百脉根
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牛病毒性腹泻病病毒Changchun184株E2基因的克隆及在大肠杆中的高效表达 被引量：9
14
作者 徐兴然 涂长春 +5 位作者 余兴龙 肖昌 张青婵 张丽颖 查云峰 史子学 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期98-101,共4页
根据GenBank已发表的多个BVDV_1序列的比较分析结果设计引物 ,应用RT_PCR及套式PCR克隆得到包含Changchun184 (CC_184 )株E2基因的片段F2 /R2 ,克隆、测序分析结果表明该片段大小为 1391bp ,软件分析结果表明CC_184株E2基因长度为 112 2... 根据GenBank已发表的多个BVDV_1序列的比较分析结果设计引物 ,应用RT_PCR及套式PCR克隆得到包含Changchun184 (CC_184 )株E2基因的片段F2 /R2 ,克隆、测序分析结果表明该片段大小为 1391bp ,软件分析结果表明CC_184株E2基因长度为 112 2bp(GenBankaccessionnumber:AF5 2 6 380 )。通过基因操作构建得到表达完整E2蛋白和去除E2蛋白C_端疏水区的重组质粒 pET2 8a_BE2和 pET2 8a_BE2m ,转化大肠杆菌并诱导目的蛋白表达 ,SDS_PAGE检测结果表明重组菌能表达目的蛋白 ,其表达量分别占菌体总蛋白的 6 2 5 %和 35 7%。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病病毒 e2基因 克隆 表达
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猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析 被引量：9
15
作者 尹革芬 朱建波 +3 位作者 姚俊 高华峰 信爱国 张念祖 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期167-169,共3页
用RT_nPCR方法 ,选择猪瘟病毒 2 0 0 0年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析 ,并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示 ,云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90 % ;但与... 用RT_nPCR方法 ,选择猪瘟病毒 2 0 0 0年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析 ,并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示 ,云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90 % ;但与中国标准强毒石门株差异较大 ,其核苷酸及氨基酸同源性均小于 80 %。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 序列分析
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猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究 被引量：7
16
作者 汤德元 李春燕 +4 位作者 罗险峰 黄涛 曾智勇 甘振磊 王凤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1649-1653,共5页
本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析。并将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD... 本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析。并将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 原核表达 免疫原性
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23株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列差异分析 被引量：17
17
作者 赵耘 王在时 +2 位作者 王琴 李博 丘惠深 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2002年第3期3-7,共5页
用RT PCR及测序获得了 17株猪瘟病毒 (HCV) 2 5 1bp的E2基因主要抗原编码区序列 ,经DNAstar软件对获得的 17株HCV及已发表的 6株HCV毒株序列进行了比较和分析 ,并构建了HCV遗传发生树。结果 ,这 2 3株与石门株的序列相比 ,所有毒株的碱... 用RT PCR及测序获得了 17株猪瘟病毒 (HCV) 2 5 1bp的E2基因主要抗原编码区序列 ,经DNAstar软件对获得的 17株HCV及已发表的 6株HCV毒株序列进行了比较和分析 ,并构建了HCV遗传发生树。结果 ,这 2 3株与石门株的序列相比 ,所有毒株的碱基变化随机地分布于整个序列 ,无缺失和插入 ,其中变化较大的区域位于序列的 3′端。 2 3株HCVE2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别为 74.1%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 % ,其中 4株 2 0世纪 70～ 80年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 76.3 %～ 86.2 %、81.1%～ 87.8% ,10株 2 0世纪 90年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 75 .4%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 %。所绘制的遗传发生树分为 2个组群 (group) ,每个组群分为 2个亚组群 (subgroup) ,14株猪瘟 (HC)流行毒株在 2个组群中均有分布 ,2 0世纪 70～ 80年代分离的 3株 (75 % )在组 群 2 ,2 0世纪 90年代分离的 5株 (5 0 % )在组群 展开更多
关键词 e2基因 抗原编码区序列 差异分析 猪瘟病毒 遗传发生树 基因组群 进化关系
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猪瘟病毒石门株E2基因4个抗原结构域的原核表达 被引量：8
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作者 徐璐 范学政 +3 位作者 王琴 蒋春燕 宁宜宝 王泰健 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期814-818,共5页
目的对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达,以期获得可溶性表达产物,为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。方法用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD,A1A2,B和C。分别将4个片段克隆于... 目的对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达,以期获得可溶性表达产物,为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。方法用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD,A1A2,B和C。分别将4个片段克隆于pMAL-p2X载体中,经PCR、双酶切和测序鉴定,E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21-CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中,共得到16株重组表达菌,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。结果E2基因的4个主要抗原结构域均可在这4种表达菌中表达,但以BL21-CodonPlus(DE3)-RP的表达效果最好,可表达出可溶性并且产量较高的目的蛋白。免疫印迹结果表明,表达的目的蛋白可以被猪瘟阳性血清和针对E2蛋白的单克隆抗体所识别。结论只表达目的基因的抗原结构域,可以缩短表达片段的长度,有利于获得可溶性目的蛋白,并且具有良好的血清学反应的特异性。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 e2基因 抗原结构域原核表达
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猪瘟病毒E2基因部分核苷酸序列的遗传进化关系的研究 被引量：6
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作者 赵耘 王在时 +2 位作者 王琴 李博 丘惠深 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期157-164,共8页
本研究利用RT-PCR及测序获得了16株猪瘟病毒E2基因部分核苷酸序列。利用DNAStar软件对其6株已发表的猪瘟病毒毒株序列进行了比较和分析,构建了猪瘟病毒遗传发生树。结果可以看出所绘制的遗传发生树分为2个组群,每个组群分为3个亚组群。1... 本研究利用RT-PCR及测序获得了16株猪瘟病毒E2基因部分核苷酸序列。利用DNAStar软件对其6株已发表的猪瘟病毒毒株序列进行了比较和分析,构建了猪瘟病毒遗传发生树。结果可以看出所绘制的遗传发生树分为2个组群,每个组群分为3个亚组群。13株猪瘟流行毒在2个组群中均有分布,猪瘟石门系强毒和C株属于同一组群、同一亚组群。70～80年代分离的4株猪瘟病毒75％和Alfort株（法国）在同一组群,25％和Brescia株（意大利）是同一组群,90年代分离的9株猪瘟病毒33.3％和Alfort株（法国）在同一组群,66.7％和Brescia株（意大利）是同一组群。13株猪瘟流行毒株中7株和C株在同一组群,其中70～80年代的1株,90年代的6株。其余的6株猪瘟流行毒株均在另一组群。不同地区及不同材料C-株疫苗的E2基因的核苷酸序列有一定的差异,GPE株与中国的C株有较近的遗传进化关系,而法国的Thiverval株则与中国C株的遗传进化关系较远。本研究的结果对了解我国猪瘟分子流行病学的特点具有重要的意义。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 遗传发生树 基因组群 e2基因 核苷酸序列 遗传进化关系
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表达猪瘟病毒E2基因和gfp报道基因的伪狂犬病病毒双基因转移载体的构建 被引量：9
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作者 潘兹书 张楚瑜 +1 位作者 陈玉栋 闵平 《武汉大学学报（理学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期466-470,共5页
将以PRVgG为启动子 ,SV4 0polyA为加尾信号的CSFVE2表达盒克隆于包含伪狂犬病病毒 (PRV)tk基因和gH基因片段的重组质粒pTK2 .5 ,替换掉tk基因的SalⅠ与XhoⅠ酶切位点之间的序列 ,构建了携带CSFVE2基因的转移载体pTKE2 免疫荧光检测证... 将以PRVgG为启动子 ,SV4 0polyA为加尾信号的CSFVE2表达盒克隆于包含伪狂犬病病毒 (PRV)tk基因和gH基因片段的重组质粒pTK2 .5 ,替换掉tk基因的SalⅠ与XhoⅠ酶切位点之间的序列 ,构建了携带CSFVE2基因的转移载体pTKE2 免疫荧光检测证实 ,转染BHK2 1细胞的pTKE2在感染PRV的情况下 ,能表达E2蛋白 采用特异性引物PCR方法扩增gfp表达盒 ,对酶切位点进行改造 ,将其克隆到pTKE2的SalⅠ位点 ,构建了用PRVgG启动子和HCMVIE启动子分别控制E2基因和gfp基因表达、两基因取向相反的双基因转移载体pTKE2 .GFP 将双基因转移载体pTKE2 .GFP转染BHK2 1细胞中 ,12h后在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的GFP表达 。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 转移载体 绿色荧光蛋白 e2基因
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