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cry2Aa9m抗虫基因植物表达载体构建及对大豆的遗传转化 被引量:6
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作者 朱延明 郜庭 +4 位作者 张凤 柏锡 才华 纪巍 罗晓 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期1-6,共6页
cry2Aa9m基因编码的杀虫晶体蛋白(ICPs)对鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Dipter)昆虫具有显著的毒杀作用,可防治大豆食心虫等害虫。试验构建了由豆荚特异性启动子Pmsg调控的cry2Aa9m基因的植物表达载体pCMB2A,以抗除草剂bar基因为筛选标... cry2Aa9m基因编码的杀虫晶体蛋白(ICPs)对鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Dipter)昆虫具有显著的毒杀作用,可防治大豆食心虫等害虫。试验构建了由豆荚特异性启动子Pmsg调控的cry2Aa9m基因的植物表达载体pCMB2A,以抗除草剂bar基因为筛选标记,通过农杆菌介导法对绥农28大豆子叶节进行遗传转化,获得抗性株系8株。经PCR和RT-PCR检测结果证明,cry2Aa9m基因已经整合到大豆基因组中并得以表达。研究为抗大豆食心虫转基因育种产业化奠定基础。 展开更多
关键词 大豆 cry2aa9m基因 农杆菌介导 转基因株系
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Cry2Aa2和PamPAP双价表达载体的构建及其对辣椒的遗传转化 被引量:3
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作者 高玉尧 陈长明 +2 位作者 陈国菊 曹必好 雷建军 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期1285-1292,共8页
为了获得既抗虫又抗病毒病,又对人体和环境安全的转基因辣椒(Capsicum annuum L.)材料,将启动子CaMV35S、终止子Nos-ter及缺失无毒型商陆抗病毒蛋白基因PamPAP一起插入到植物表达载体pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI的多克隆位点上,构建双价表... 为了获得既抗虫又抗病毒病,又对人体和环境安全的转基因辣椒(Capsicum annuum L.)材料,将启动子CaMV35S、终止子Nos-ter及缺失无毒型商陆抗病毒蛋白基因PamPAP一起插入到植物表达载体pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI的多克隆位点上,构建双价表达载体,采用农杆菌介导法将其转入辣椒中,并用PMI/甘露糖筛选体系对转化植株筛选。经PCR扩增和Southern杂交检测,结果表明Cry2Aa2和PamPAP已经整合到辣椒基因组中。进一步经RT-PCR分析,证实Cry2Aa2和PamPAP在T0代转基因辣椒植株中共表达。经抗虫性、抗病毒病表型鉴定:T0代转基因辣椒植株对黄瓜花叶病毒(CMV)和斜纹夜蛾幼虫的抗性均显著高于非转基因植株。 展开更多
关键词 辣椒 PMI/甘露糖筛选体系 cry2aa2 PamPAP 遗传转化 抗病毒 抗虫害
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磁珠筛选抗Cry2Aa人源化单链抗体及检测方法的建立 被引量:2
3
作者 武爱华 王耘 +2 位作者 刘媛 胡晓丹 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期945-950,共6页
为了建立转基因成分的快速检测方法,利用亲和磁珠偶联Cry2Aa毒素蛋白从人源化噬菌体抗体库Tomlinson I中液相淘选特异性单链抗体(sc Fv)。通过4轮"扩增-吸附-洗脱",从洗脱产物计数板上随机挑取单克隆进行初步鉴定。选取相对... 为了建立转基因成分的快速检测方法,利用亲和磁珠偶联Cry2Aa毒素蛋白从人源化噬菌体抗体库Tomlinson I中液相淘选特异性单链抗体(sc Fv)。通过4轮"扩增-吸附-洗脱",从洗脱产物计数板上随机挑取单克隆进行初步鉴定。选取相对结合活性最好的阳性克隆建立间接竞争ELISA,确定其检测范围。筛选后第4轮相对产出率较第1轮提高了4.07×106倍;单克隆ELISA鉴定出8个含有完整外源基因片段的阳性克隆,测序后获得3个不同序列的阳性克隆。D5克隆的噬菌体上清对Cry2Aa的检测灵敏度(IC10)为6.632 ng/ml,线性范围为0.016~2.881μg/ml。该克隆对Cry2Aa具有良好的特异性和板内板间重现性。 展开更多
关键词 cry2aa毒素 单链抗体 磁珠 间接竞争ELISA
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棉铃虫中肠钙粘蛋白、氨肽酶N及碱性磷酸酯酶的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响 被引量:1
4
作者 王冰洁 袁向东 +3 位作者 赵曼 刘臣 陈琳 梁革梅 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期977-984,共8页
【目的】Cry1A和Cry2A类Bt蛋白通过特异性地与昆虫中肠上的受体蛋白结合而发挥杀虫作用,现已广泛应用于转基因抗虫作物。本研究旨在进一步明确Cry2A类蛋白的作用机制和Cry1A受体蛋白在Cry2A发挥毒力中的作用。【方法】本研究首先提取了... 【目的】Cry1A和Cry2A类Bt蛋白通过特异性地与昆虫中肠上的受体蛋白结合而发挥杀虫作用,现已广泛应用于转基因抗虫作物。本研究旨在进一步明确Cry2A类蛋白的作用机制和Cry1A受体蛋白在Cry2A发挥毒力中的作用。【方法】本研究首先提取了棉铃虫Helicoverpa armigera的BBMV,制备了钙粘蛋白(CAD)、氨肽酶N(APN)和碱性磷酸酯酶(ALP)3种受体蛋白的抗体和抗血清;然后,利用Western blot检测BBMV上这3种受体蛋白后,利用抗体封闭技术比较了敏感棉铃虫和Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中3种受体蛋白的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响。【结果】对敏感品系棉铃虫,这3种已知的Cry1Ac受体蛋白抗血清显著地降低了Cry1Ac和Cry2Aa的毒力。其中APN抗血清对Cry1Ac毒力的影响最大,棉铃虫幼虫的死亡率降低了84.44%;ALP抗血清对Cry2Aa的毒力影响最大,棉铃虫幼虫死亡率比对照降低了71.04%。Cry1Ac对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力显著降低,Cry2Aa的毒性也减弱。在Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中,3种受体抗血清对Cry1Ac的影响比在敏感棉铃虫中的影响小,尤其是CAD和APN抗血清对Cry1Ac毒力的抑制率显著低于在敏感棉铃虫中的抑制作用;CAD和ALP抗血清对Cry2Aa毒力的影响与在敏感棉铃虫中的影响差异不显著,但APN抗血清可以显著降低Cry2Aa对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力。【结论】棉铃虫CAD,APN和ALP不仅参与了Cry1Ac的杀虫过程,也对Cry2Aa毒力有一定的影响,而且这3种蛋白可能与棉铃虫对Cry1Ac和Cry2Aa产生抗性及交互抗性相关。 展开更多
关键词 棉铃虫 受体蛋白 抗血清 CRY1AC cry2aa 抗性 交互抗性
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Cry2Aa毒素结合十二肽的筛选与鉴定 被引量:2
5
作者 武爱华 张霄 +5 位作者 刘媛 赵扬 赵岩岩 张存政 谢雅晶 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第4期929-941,共13页
利用Cry-2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选,并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆,进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序,鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示,这20个克隆均能与c巧也Aa毒素发生特... 利用Cry-2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选,并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆,进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序,鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示,这20个克隆均能与c巧也Aa毒素发生特异性结合,并推导出8条不同的序列。挑取阳性值最高的克隆GT(氨基酸序列为GTPWHHHRHLIV)建立了基于十二肽的Cry-2Aa毒蛋白的间接竞争ELISA检测方法。该方法的抑制中浓度(IC50)为1|1390μg/ml,最低检测限IC10为O.0211μg/ml,线性检测范围为0.0478~22.691Oμg/ml(Y=23.09lgx+48.692,R^2=0.9963)。噬菌体展示肽库筛选方法为快速、准确地检测Cry2Aa毒蛋白提供了新的途径。 展开更多
关键词 cry2aa毒素 噬菌体展示肽库:ELISA
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苏云金芽胞杆菌Rpp39杀虫晶体蛋白基因的鉴定及cry2Aa12基因的克隆表达
6
作者 谭芙蓉 朱军 +2 位作者 李云艳 郑爱萍 李平 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期684-689,共6页
【目的】本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究。【方法】本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-R... 【目的】本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究。【方法】本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-RFLP鉴定法和SDS-PAGE分析法研究菌株的特性;采用PCR直接克隆法克隆cry2Aa全长基因,并亚克隆到原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-2Aa,再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)中进行诱导表达;采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾和水稻二化螟的毒力。【结果】经扫描电镜观察菌株Rpp39主要产生菱形、方形和圆形3种伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明主要产生130kDa和60kDa左右2种蛋白;经PCR-RFLP鉴定,该菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia和cry2Aa五类杀虫晶体蛋白基因;1种cry2Aa类杀虫晶体蛋白全长基因被克隆,序列分析显示该基因的开放阅读框(ORF)为1902bps,编码由634个氨基酸组成的蛋白质,氨基酸序列与Cry2Aa1蛋白同源性为99.7%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Aa12。重组表达质粒pET-2Aa在E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有65kDa表达蛋白。生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对小菜蛾和二化螟具有杀虫活性,LC50分别为5.4μg/mL和22.3μg/mL。【结论】菌株Rpp39及从中分离克隆的cry2Aa12基因来自四川生态条件,丰富了菌株及基因的资源,在资源积累方面具有重要意义。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 鉴定 cry2aa12基因 克隆表达 杀虫活性
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二化螟APN1的原核表达及其与Cry2Aa蛋白的结合特性研究
7
作者 刘慧 李博 +2 位作者 牛林 邱林 王永 《生物安全学报》 2018年第4期255-259,共5页
【目的】Bt杀虫蛋白发挥杀虫活性的重要前提是Cry蛋白能够与昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊(BBMVs)上的受体蛋白结合。在前期获得二化螟氨肽酶N1(Aminopeptidase N,APN1)基因全长序列的基础上,明确二化螟APN1多肽片段与Cry2Aa的结合能力。... 【目的】Bt杀虫蛋白发挥杀虫活性的重要前提是Cry蛋白能够与昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊(BBMVs)上的受体蛋白结合。在前期获得二化螟氨肽酶N1(Aminopeptidase N,APN1)基因全长序列的基础上,明确二化螟APN1多肽片段与Cry2Aa的结合能力。【方法】将二化螟APN1序列片段在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用蛋白质单向电泳和ligand blotting技术分析二化螟APN1多肽片段与Cry2Aa的结合能力。【结果】重组载体可在表达菌株BL21(DE3)中表达一个约70 ku的蛋白,纯化后的多肽条带单一,纯度较好。Ligand blot分析结果显示,表达的二化螟APN1多肽片段可以与活化的Cry2Aa杀虫蛋白结合,且结合条带随着重组蛋白上样量的降低而减弱。【结论】APN1多肽片段可以与Cry2Aa结合,为阐明APN1基因的功能奠定基础,也为其他Bt蛋白的受体蛋白相关研究提供新的借鉴。 展开更多
关键词 cry2aa 二化螟 APN1 原核表达 结合能力
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苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化
8
作者 高洁荣 何颖 +1 位作者 邹泽红 艾云灿 《湖北农业科学》 北大核心 2013年第3期702-705,共4页
根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cry2Aa基因进行优化,并合成全长基因,将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a上,转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达,优化表达条件,采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化,W... 根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cry2Aa基因进行优化,并合成全长基因,将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a上,转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达,优化表达条件,采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化,Western blot鉴定回收产物。结果表明,IPTG浓度为0.50 mmol/L、27℃诱导4 h时Cry2Aa蛋白表达量最高,SDS-PAGE胶回收Cry2Aa纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) cry2aa蛋白 表达 纯化
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Cry2Aa毒素对小菜蛾的杀虫机理
9
作者 刘媛 林洁茹 +5 位作者 林曼曼 张霄 徐重新 陈蔚 罗楚平 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期762-768,共7页
为研究苏云金杆菌Cry2Aa毒素的生物活性及杀虫机理,先利用浸叶法测定了商品化的Cry2Aa毒素对小菜蛾的杀虫活性,并用石蜡包埋切片后进行免疫组化分析,再用ELISA法测定了Cry2Aa毒素与小菜蛾刷状缘膜囊泡(BBMV)的结合曲线,最后通过Ligand b... 为研究苏云金杆菌Cry2Aa毒素的生物活性及杀虫机理,先利用浸叶法测定了商品化的Cry2Aa毒素对小菜蛾的杀虫活性,并用石蜡包埋切片后进行免疫组化分析,再用ELISA法测定了Cry2Aa毒素与小菜蛾刷状缘膜囊泡(BBMV)的结合曲线,最后通过Ligand blot法和肽指纹质谱对小菜蛾BBMV与Cry2Aa毒素的结合蛋白进行了分离与鉴定。结果表明,Cry2Aa毒素对小菜蛾的半数致死浓度(LC_(50))为27.90μg/ml。Cry2Aa毒素与小菜蛾中肠上皮细胞存在结合,与小菜蛾BBMV的表观结合亲和力为266.6 nmol/L。小菜蛾BBMV与Cry2Aa毒素存在5条主要结合条带,其中分子量2.45×10~5上方的主结合条带酶解后得到ATYSEGPNGSVR片段,通过数据库比对分析,匹配到一个分子量为3.32×10~5的小菜蛾未鉴定蛋白,其功能注释为脂质运载蛋白。 展开更多
关键词 cry2aa 小菜蛾 杀虫活性 刷状缘膜囊泡(BBMV) 免疫组化分析
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苏云金芽孢杆菌Cry2Aa型杀虫晶体蛋白的分类与构效
10
作者 施茹玲 郭幼红 《现代盐化工》 2020年第3期14-16,共3页
通过同源建模法构建Cry2Aa型杀虫晶体蛋白16种成员的活性区空间结构,基于空间结构将其分为4类,并比较分析。结果表明,Cry2Aa的DomainⅠ非常保守,几乎完全重叠;Cry2AaⅡ、Cry2AaⅣ与其他成员的DomainⅡ存在差异;Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ与其... 通过同源建模法构建Cry2Aa型杀虫晶体蛋白16种成员的活性区空间结构,基于空间结构将其分为4类,并比较分析。结果表明,Cry2Aa的DomainⅠ非常保守,几乎完全重叠;Cry2AaⅡ、Cry2AaⅣ与其他成员的DomainⅡ存在差异;Cry2AaⅡ、Cry2AaⅢ与其他成员的DomainⅢ存在较大差异。研究确定了影响Cry2Aa型杀虫晶体蛋白结构差异的关键氨基酸及其关键结构片段。 展开更多
关键词 苏云金芽孢菌 cry2aa型杀虫晶体蛋白 空间构象 构效
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抗-Cry2Aa单链抗体分子互作及荧光免疫检测研究
11
作者 王耘 武爱华 +1 位作者 张存政 刘贤金 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2017年第6期309-312,292,共5页
Cry2Aa毒素是一种新型生物农药,分析该毒素与特异性单链抗体分子互作,并建立快速检测毒素残留的方法对保障食品和生态安全有重要意义。本研究以同源蛋白为模板对单链抗体进行建模,并进行了Cry2Aa毒素与单链抗体的分子对接模拟,确定关键... Cry2Aa毒素是一种新型生物农药,分析该毒素与特异性单链抗体分子互作,并建立快速检测毒素残留的方法对保障食品和生态安全有重要意义。本研究以同源蛋白为模板对单链抗体进行建模,并进行了Cry2Aa毒素与单链抗体的分子对接模拟,确定关键结合位点,以此为基础将单链抗体作为检测抗体,建立了间接竞争时间分辨荧光免疫分析方法,对大米样品中Cry2Aa毒素进行了检测。利用生物信息学工具模拟获得单链抗体三维结构模型,分子对接结果显示重链可变区81NY82和121SGNY124区域及轻链可变区的245YSSN248氨基酸残基在与毒素结构Ⅱ区识别过程中起关键作用,为建立高效检测方法奠定基础,进一步基于该单链抗体建立的时间分辨检测方法灵敏度(IC10)为0.08 ng/m L,中抑制浓度(IC50)为7.99 ng/m L,线性检测范围(IC20~IC80)为0.24~263.77 ng/m L,且与常规双抗夹心ELISA法检测呈良好线性关系。 展开更多
关键词 cry2aa毒素 单链抗体 时间分辨荧光免疫分析 同源模建 分子对接
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采用饲喂法和微注射法评价Cry2Aa蛋白对二化螟盘绒茧蜂的安全性
12
作者 董欣鑫 李梦雨 +2 位作者 马伟华 蔡万伦 华红霞 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期413-420,共8页
为评价转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂Cotesia chilonis的安全性,采用饲喂法和微注射法综合评价转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂的影响。结果表明,寄生饲喂转Cry2Aa基因水稻T2A-1的二化螟Chilo suppressalis后,二化螟盘... 为评价转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂Cotesia chilonis的安全性,采用饲喂法和微注射法综合评价转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂的影响。结果表明,寄生饲喂转Cry2Aa基因水稻T2A-1的二化螟Chilo suppressalis后,二化螟盘绒茧蜂体内未检出Cry2Aa蛋白,其每茧块茧数、茧长、雄成虫寿命和雌雄比分别为20.00个、2.58 mm、2.34 d和3.10,均显著小于对照,而卵及幼虫的总历期、蛹期、雌成虫寿命、茧质量和成虫质量均与对照差异不显著;寄生微注射Cry2Aa蛋白的二化螟后,除卵及幼虫的总历期和蛹期外,二化螟盘绒茧蜂其他生命表参数和体内过氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)活力均与阳性对照之间差异显著;寄生微注射Cry2Aa蛋白的二化螟后,二化螟盘绒茧蜂所有生命表参数及体内POD、SOD和GR活力均与阴性对照之间无显著差异。表明饲喂法中转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂产生的影响是由寄主介导效应引起的,而非Cry2Aa蛋白本身,因此转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂安全。 展开更多
关键词 cry2aa基因水稻 寄主介导效应 生命表参数 二化螟盘绒茧蜂 二化螟
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苏云金芽孢杆菌cry2 Aa操纵元蛋白对杀虫蛋白晶体形成作用的研究 被引量:4
13
作者 姚江 张杰 +5 位作者 陈中义 李长友 黄大旸 宋福平 刘旭光 檀建新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期115-118,共4页
利用重叠PCR的方法 ,通过两次PCR扩增 ,分别获得cry2Aa1 0操纵元的orf1、orf1 +orf2与cry2Ab5基因的融合片段。融合片段经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切与pHT31 5连接 ,分别构建了基因融合片段的原核表达载体pFU(orf1 +2Ab)和pFU(orf1 +orf2 +2A... 利用重叠PCR的方法 ,通过两次PCR扩增 ,分别获得cry2Aa1 0操纵元的orf1、orf1 +orf2与cry2Ab5基因的融合片段。融合片段经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切与pHT31 5连接 ,分别构建了基因融合片段的原核表达载体pFU(orf1 +2Ab)和pFU(orf1 +orf2 +2Ab) ,电转化Bt无晶体突变株 4Q7后 ,扫描电镜下可观察到典型的方形晶体 ,通过SDS PAGE可检测到 6 0kD大小的蛋白表达带。结果表明 ,cry2Ab5可在cry2Aa1 0的启动子帮助下有效转录和表达 。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 cry2aa操纵元 杀虫蛋白晶体 晶体形成
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抗虫抗除草剂转基因水稻恢复系B2A68的培育 被引量:13
14
作者 翁绿水 蒋利平 肖国樱 《杂交水稻》 CSCD 北大核心 2013年第1期63-67,共5页
利用人工优化合成的抗虫基因Cry2Aa#与抗除草剂的Bar基因构建的植物表达载体转化水稻恢复系D68,经过分子鉴定获得1个单拷贝的转基因水稻株系B2A68。B2A68和杂交种株1S/B2A68叶片中Cry2Aa蛋白的表达量在齐穗期分别为10.45~26.84和9.0~1... 利用人工优化合成的抗虫基因Cry2Aa#与抗除草剂的Bar基因构建的植物表达载体转化水稻恢复系D68,经过分子鉴定获得1个单拷贝的转基因水稻株系B2A68。B2A68和杂交种株1S/B2A68叶片中Cry2Aa蛋白的表达量在齐穗期分别为10.45~26.84和9.0~13.45μg/g。草铵膦抗性试验和抗虫性测定结果显示,转基因水稻B2A68既抗除草剂草铵膦,又抗稻纵卷叶螟。 展开更多
关键词 水稻 cry2aa#基因 BAR基因 抗虫 抗除草剂
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基因枪法和农杆菌介导的Bt抗虫基因转化芥蓝 被引量:3
15
作者 陈长明 赵祥明 +2 位作者 雷建军 曹必好 陈国菊 《中国蔬菜》 北大核心 2016年第8期21-28,共8页
以芥蓝品种小香菇为试材,分别采用基因枪法和农杆菌介导转化法将Bt抗虫基因Cry2Aa2转化到芥蓝中,并对两种转化方法进行了优化和比较。结果表明:基因枪法在轰击距离为6cm、轰击次数为1次时转化效率最高,为0.43%;农杆菌介导转化法以带子... 以芥蓝品种小香菇为试材,分别采用基因枪法和农杆菌介导转化法将Bt抗虫基因Cry2Aa2转化到芥蓝中,并对两种转化方法进行了优化和比较。结果表明:基因枪法在轰击距离为6cm、轰击次数为1次时转化效率最高,为0.43%;农杆菌介导转化法以带子叶下胚轴为外植体、预培养2d、侵染10min、共培养2d、抑菌培养5d后转入筛选培养基为最佳参数,转化效率为0.37%。经PCR和PCR-Southern鉴定,基因枪法和农杆菌介导转化法均成功将目的基因导入芥蓝基因组中。经抗虫性表型鉴定,T_0代转基因芥蓝植株对甘蓝夜蛾幼虫的抗性高于非转基因植株。 展开更多
关键词 芥蓝 BT基因 cry2aa2 基因枪法 农杆菌介导转化法
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苏云金芽胞杆菌V4菌株cry杀虫基因的鉴定、表达及杀虫活性分析 被引量:2
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作者 何宝楠 李海涛 +2 位作者 刘荣梅 王博 高继国 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期125-130,共6页
旨在给生物防治提供更多的基因资源,以从本实验室分离的300株苏云金芽胞杆菌基因组为模板,利用cry1类全长通用引物进行PCR cry1类基因鉴定。经过PCR-RFLP鉴定出菌株V4含有cry1Ea基因,进一步研究发现该菌株还含有cry2Aa基因,并成功克隆... 旨在给生物防治提供更多的基因资源,以从本实验室分离的300株苏云金芽胞杆菌基因组为模板,利用cry1类全长通用引物进行PCR cry1类基因鉴定。经过PCR-RFLP鉴定出菌株V4含有cry1Ea基因,进一步研究发现该菌株还含有cry2Aa基因,并成功克隆到了这两个新基因,被Bt国际命名委员会正式命名为cry1Ea12和cry2Aa16。将两种基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,表达蛋白进行杀虫活性测定,结果表明两种蛋白杀虫活性不理想,但对试虫存在明显的体重抑制,而V4菌株蛋白具有较高的杀虫活性。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 杀虫晶体蛋白 cry1Ea12基因 cry2aa16基因 生物活性
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利用pmi作为筛选基因对辣椒进行Bt基因转化的研究 被引量:3
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作者 黄皓 雷建军 +3 位作者 曹必好 陈长明 陈清华 陈国菊 《辣椒杂志》 2013年第2期23-28,共6页
根据Cry2Aa2的保守基因序列设计引物,从而扩增出完整的Cry2Aa2序列,连接到含有磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)的表达载体pCAMBIA1301-PMI上,采用农杆菌介导的方法转化辣椒,利用甘露糖筛选体系对辣椒转化体进行筛选,对转基因植株进行分子生... 根据Cry2Aa2的保守基因序列设计引物,从而扩增出完整的Cry2Aa2序列,连接到含有磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)的表达载体pCAMBIA1301-PMI上,采用农杆菌介导的方法转化辣椒,利用甘露糖筛选体系对辣椒转化体进行筛选,对转基因植株进行分子生物学检测和抗虫试验,72h后统计抗虫情况。结果表明:获得了含有Cry2Aa2转基因植株;食用转Bt基因辣椒叶片和果实的斜纹夜蛾幼虫的校正死亡率均高于阴性对照,且大多表现出僵化和厌食的状态,对转基因的辣椒伤害较小,说明Bt基因成功导入辣椒中。 展开更多
关键词 辣椒 cry2aa2基因 甘露糖 遗传转化
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双价杀虫蛋白基因在荧光假单胞菌中的表达及增效 被引量:11
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作者 丁之铨 张杰 +2 位作者 宋福平 黄大昉 李季伦 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期573-578,共6页
利用广宿主质粒载体 pJMS6α lac将苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis)杀虫晶体蛋白基因cry1Ac和cry2Aa基因分别及一起进行克隆 ,将重组质粒导入能在多种作物上定殖、对植物病菌有良好抑菌和防治作用的荧光假单胞菌 (Pseudomonasfl... 利用广宿主质粒载体 pJMS6α lac将苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis)杀虫晶体蛋白基因cry1Ac和cry2Aa基因分别及一起进行克隆 ,将重组质粒导入能在多种作物上定殖、对植物病菌有良好抑菌和防治作用的荧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescens)P30 3菌株 ,分别得到工程菌株IPP1 0 1、IPP2 0 1和IPP2 0 2。PCR RFLP和Southernblot检测均证明目的基因已经导入了工程菌。SDS PAGE电泳显示工程菌中存在明显的Cry1Ac蛋白带 ;透射电镜观察发现含cry1Ac基因的两个菌株IPP1 0 1和IPP2 0 2中杀虫蛋白形成了典型的菱形晶体和蛋白包含体 ,而在野生P30 3菌株中均无这些结构。这些结果说明 ,工程菌中cry1Ac基因得到了很好表达。室内杀虫试验表明 :工程菌对棉铃虫初孵幼虫的致死中浓度 (LC50 ) ,只含cry1Ac的IPP1 0 1为 0 0 0 81 2mL/g饲料 ,只含cry2Aa的IPP2 0 1为 0 0 2 60 4mL/g饲料 ,含双基因的IPP2 0 2为 0 0 0 1 86mL/g饲料 ;HD73为 0 0 0 1 70mL/g饲料。cry1Ac和cry2Aa双基因表达产物具有显著增效作用 ,共毒系数达 332 8。 展开更多
关键词 荧光假单胞菌 杀虫晶体蛋白基因 表达
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苏云金芽孢杆菌分子伴侣串联基因p19-p29的克隆和表达载体的构建 被引量:5
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作者 余健秀 曾少灵 +2 位作者 谢瑞瑜 蒙国基 庞义 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期567-572,共6页
根据已知序列设计一对PCR引物 (ORF 5S ,ORF 3N) ,可从cry2Aa或cry2Ac操纵子中扩增出包含串联分子伴侣基因p1 9 p2 9的DNA片段 ,预期大小分别为 1 6kb和 2 0kb。对 1 5 0株苏云金芽孢杆菌菌株进行PCR检测 ,从 2 6株中获得了大小为 1 ... 根据已知序列设计一对PCR引物 (ORF 5S ,ORF 3N) ,可从cry2Aa或cry2Ac操纵子中扩增出包含串联分子伴侣基因p1 9 p2 9的DNA片段 ,预期大小分别为 1 6kb和 2 0kb。对 1 5 0株苏云金芽孢杆菌菌株进行PCR检测 ,从 2 6株中获得了大小为 1 6kb的扩增片段 ,但未获得2 0kb的片段。这表明cry2Aa型操纵子p1 9 p2 9基因存在较广泛 ,而cry2Ac型较罕见。将来自Y2 菌株的 1 6kb片段回收 ,通过一系列亚克隆 ,最终构建成一个含有p1 9 p2 9串联基因的Bt表达载体 ,为进一步研究p1 9 p2 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 分子伴侣 串联基因 p19-p29 克隆 表达载体
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Use of a dietary exposure system for screening of insecticidal compounds for their toxicity to the planthopper Laodelphax striatellus
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作者 Zeng-Xia Wang Ke-Jian Lin +4 位作者 Jorg Romeis Yong-Lei Liu Ze-Wen Liu Yun-He Li Yu-Fa Peng 《Insect Science》 SCIE CAS CSCD 2014年第5期667-675,共9页
We developed a dietary exposure assay for screening insecticidal compounds for their toxicity and for assessing the side effects of insecticidal proteins produced by genetically engineered (GE) plants on the plantho... We developed a dietary exposure assay for screening insecticidal compounds for their toxicity and for assessing the side effects of insecticidal proteins produced by genetically engineered (GE) plants on the planthopper Laodelphax striatellus Fallen. The fitness bioassay confirmed that the diet fulfills the requirements to be used in the dietary exposure system. To validate the efficacy of the dietary exposure system, nymphs of L. striatellus were fed diets treated with different concentrations of an inorganic stomach poison, potassium arsenate (PA), or a cysteine protease inhibitor, E-64. The results showed that with increasing concentrations of E-64, the larval development time was prolonged, the adult weight was reduced and the survival rate of L. striatellus was decreased. Similarly the survival rates of L. striatellus consistently decreased with increasing PA content in the diet. The data indicate that the dietary exposure assay is able to detect the effects of insecticidal compounds on L. striatellus. Subsequently, this assay was successfully used for assessing the potential toxicity of Cry2Aa. The results showed that L. striatellus larvae were not negatively affected when fed the artificial diet containing purified Cry2Aa at 300 μg/g diet. In the assay, the stability and bioactivity of crystal (Cry) proteins in the food sources were confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay and sensitive-insect bioassays. These results show that L. striatellus is not sensitive to Cry2Aa. We conclude that the dietary exposure system is valid and useful for assessing the toxicity of insecticidal compounds produced by GE plants on planthoppers. 展开更多
关键词 cry2aa E-64 genetically engineered rice potassium arsenate risk assessment
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