动物模型是将治疗方法从实验室转化到临床应用的重要工具。随着基因编辑技术的不断发展,基于成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9,CRI...动物模型是将治疗方法从实验室转化到临床应用的重要工具。随着基因编辑技术的不断发展,基于成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)构建的动物模型为研究发病机制、开发新的治疗方法以及评估药物疗效提供了新的可能。论文简述了CRISPR/Cas9相关技术及原理,总结了基因编辑动物模型在人类和动物转化医学研究中的应用,探讨了CRISPR/Cas9应用过程中面临的挑战和解决策略,以期促进基因编辑技术在动物模型构建中的应用。展开更多
为了实现精子的内源性分离,本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过基因双链断裂后的同源修复机制,将睾丸特异性启动子SP-10和干扰精子发育重要基因SPAG6、PPP1CC的shRNA偶联后定点整合进宁乡猪肾成纤维细胞X染色体的ZFX基因,构建并验证基因定...为了实现精子的内源性分离,本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过基因双链断裂后的同源修复机制,将睾丸特异性启动子SP-10和干扰精子发育重要基因SPAG6、PPP1CC的shRNA偶联后定点整合进宁乡猪肾成纤维细胞X染色体的ZFX基因,构建并验证基因定点整合的细胞系。通过构建2个递送载体,根据人工多顺反子-tRNA-gRNA(PTG策略)基因串联表达系统原理,靶向ZFX基因设计多对sgRNA,验证sgRNA剪切效率,并构建sgRNA双顺反子切割载体。基于同源修复机制和同源介导末端连接(Homology Mediated End Joining,HMEJ)策略,构建含有新霉素抗性、EGFP标记基因等筛选标记的外源基因敲入载体,细胞电穿孔共转染后通过新霉素抗性筛选在混合细胞中验证基因敲入策略的可行性。并根据EGFP标记基因使用细胞流式分选技术在混合细胞基础上挑选基因定点敲入阳性的单克隆细胞株,通过PCR和Sanger测序验证单克隆细胞系构建是否成功。结果构建并验证了sgRNA切割效率,其中sgRNA3和sgRNA4剪切效率最高,为20.86%,成功构建了sgRNA双顺反子切割载体并验证了切割活性。成功构建外源DNA基因敲入载体,并在混合细胞中确定该基因敲入策略的可行性。通过细胞流式分选、PCR、Sanger测序成功筛选并验证出一株SP-10-shRNA在ZFX基因定点敲入的细胞系。最终利用CRISPR/Cas9技术成功构建SP-10-shRNA基因定点敲入猪X染色体阳性克隆细胞系,为实现猪后代性别的选择性偏移提供了重要参考。展开更多
很多未知功能结构域DUF(domain of unknown function)在植物生长发育中扮演着重要的角色,本研究以含有DUF1005结构域的基因为研究对象,通过CRISPR/Cas系统对拟南芥中AT1G10020进行基因编辑,在AT1G10020的第二外显子上设计sg RNA靶点序列...很多未知功能结构域DUF(domain of unknown function)在植物生长发育中扮演着重要的角色,本研究以含有DUF1005结构域的基因为研究对象,通过CRISPR/Cas系统对拟南芥中AT1G10020进行基因编辑,在AT1G10020的第二外显子上设计sg RNA靶点序列,构建重组质粒,获得CRISPR/Cas9-AT1G10020重组质粒,并采用农杆菌介导的花序浸染法转化至野生型拟南芥。结果分析发现,经抗性筛选和测序鉴定,共筛选获得6种不同的编辑类型,包括插入、缺失等;且拟南芥幼苗时期的根长发育表型观察显示,基因编辑株系与野生型比较,具有更短的初生根和更少的侧根。本研究获得了AT1G10020编辑纯合突变体,并为DUF1005的生物学功能的研究提供基础,也有助于对未知功能DUF新基因的挖掘和阐释。展开更多
文摘动物模型是将治疗方法从实验室转化到临床应用的重要工具。随着基因编辑技术的不断发展,基于成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)构建的动物模型为研究发病机制、开发新的治疗方法以及评估药物疗效提供了新的可能。论文简述了CRISPR/Cas9相关技术及原理,总结了基因编辑动物模型在人类和动物转化医学研究中的应用,探讨了CRISPR/Cas9应用过程中面临的挑战和解决策略,以期促进基因编辑技术在动物模型构建中的应用。
文摘为了实现精子的内源性分离,本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过基因双链断裂后的同源修复机制,将睾丸特异性启动子SP-10和干扰精子发育重要基因SPAG6、PPP1CC的shRNA偶联后定点整合进宁乡猪肾成纤维细胞X染色体的ZFX基因,构建并验证基因定点整合的细胞系。通过构建2个递送载体,根据人工多顺反子-tRNA-gRNA(PTG策略)基因串联表达系统原理,靶向ZFX基因设计多对sgRNA,验证sgRNA剪切效率,并构建sgRNA双顺反子切割载体。基于同源修复机制和同源介导末端连接(Homology Mediated End Joining,HMEJ)策略,构建含有新霉素抗性、EGFP标记基因等筛选标记的外源基因敲入载体,细胞电穿孔共转染后通过新霉素抗性筛选在混合细胞中验证基因敲入策略的可行性。并根据EGFP标记基因使用细胞流式分选技术在混合细胞基础上挑选基因定点敲入阳性的单克隆细胞株,通过PCR和Sanger测序验证单克隆细胞系构建是否成功。结果构建并验证了sgRNA切割效率,其中sgRNA3和sgRNA4剪切效率最高,为20.86%,成功构建了sgRNA双顺反子切割载体并验证了切割活性。成功构建外源DNA基因敲入载体,并在混合细胞中确定该基因敲入策略的可行性。通过细胞流式分选、PCR、Sanger测序成功筛选并验证出一株SP-10-shRNA在ZFX基因定点敲入的细胞系。最终利用CRISPR/Cas9技术成功构建SP-10-shRNA基因定点敲入猪X染色体阳性克隆细胞系,为实现猪后代性别的选择性偏移提供了重要参考。
文摘很多未知功能结构域DUF(domain of unknown function)在植物生长发育中扮演着重要的角色,本研究以含有DUF1005结构域的基因为研究对象,通过CRISPR/Cas系统对拟南芥中AT1G10020进行基因编辑,在AT1G10020的第二外显子上设计sg RNA靶点序列,构建重组质粒,获得CRISPR/Cas9-AT1G10020重组质粒,并采用农杆菌介导的花序浸染法转化至野生型拟南芥。结果分析发现,经抗性筛选和测序鉴定,共筛选获得6种不同的编辑类型,包括插入、缺失等;且拟南芥幼苗时期的根长发育表型观察显示,基因编辑株系与野生型比较,具有更短的初生根和更少的侧根。本研究获得了AT1G10020编辑纯合突变体,并为DUF1005的生物学功能的研究提供基础,也有助于对未知功能DUF新基因的挖掘和阐释。
