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莱茵衣藻光敏通道蛋白质ChR1的原核表达纯化及多克隆抗体制备
1
作者 王久荣 薛斌 樊振川 《食品与生物技术学报》 北大核心 2025年第6期59-65,共7页
【目的】制备一支高特异性的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,C.reinhardtii)光敏通道蛋白质1(channelrhodopsin 1,ChR1)抗体,研究ChR1调控细胞趋/避光性的机制。【方法】构建重组表达载体pET-28a(+)-chr1并转入大肠杆菌(Escherichi... 【目的】制备一支高特异性的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,C.reinhardtii)光敏通道蛋白质1(channelrhodopsin 1,ChR1)抗体,研究ChR1调控细胞趋/避光性的机制。【方法】构建重组表达载体pET-28a(+)-chr1并转入大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达6×His∷ChR1融合蛋白,后经镍柱亲和纯化后免疫新西兰大白兔获得ChR1抗血清,利用protein A纯化对ChR1抗血清进行IgG亚型抗体富集获得ChR1抗体,免疫印迹检测ChR1抗体特异性,并通过免疫荧光确定ChR1在细胞中的定位。【结果】利用间接ELISA法测定ChR1的抗血清效价为1∶102400;纯化获得的ChR1抗体通过免疫印迹检测到CC-125细胞中含有ChR1条带且无非特异性条带,表明抗体特异性高;免疫荧光试验结果显示,ChR1在细胞眼点位置有明显定位且无非特异性染色,表明制备的ChR1多克隆抗体适用于免疫荧光试验。【结论】作者成功实现了莱茵衣藻ChR1的原核表达纯化和多克隆抗体的制备,为ChR1在莱茵衣藻中的定位和调控趋/避光的分子机制研究奠定了重要基础。 展开更多
关键词 莱茵衣藻 chr1 原核表达 多克隆抗体
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大豆查尔酮还原酶基因CHR1的功能研究 被引量：6
2
作者 吴楠 王丕武 +7 位作者 李丹 代力强 郑成忠 卢实 才源 张卓 曲静 夏海丰 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期707-712,共6页
为了验证查尔酮还原酶基因CHR1在大豆苷元合成中的作用,文章克隆了CHR1基因并构建了RNA干扰表达载体pCPB-CHR1-RNAi,将载体转化受体大豆品种"吉农28"中,以期抑制CHR1基因的转录。通过农杆菌介导的遗传转化和PCR检测得到4株T0... 为了验证查尔酮还原酶基因CHR1在大豆苷元合成中的作用,文章克隆了CHR1基因并构建了RNA干扰表达载体pCPB-CHR1-RNAi,将载体转化受体大豆品种"吉农28"中,以期抑制CHR1基因的转录。通过农杆菌介导的遗传转化和PCR检测得到4株T0代阳性植株,13株T1代阳性植株。Southern blotting结果表明,功能元件以单拷贝的形式整合到大豆的基因组中。利用实时荧光定量PCR法(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)测定CHR1基因在mRNA水平上的表达量,结果表明,转基因大豆植株中CHR1的表达量与未转化的受体大豆相比降低了60%～99%;高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测到合成大豆苷元过程中的前体物质异甘草素的含量降低了38.7%。该RNA干扰机制在转录水平上抑制了CHR1基因的表达。 展开更多
关键词 大豆 查尔酮还原酶chr1 大豆苷元 RNA干扰载体
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大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化
3
作者 李丹 吴楠 +6 位作者 郑成忠 张琳 马建 曲静 张卓 付永平 王丕武 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2015年第8期71-78,共8页
【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA... 【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。 展开更多
关键词 大豆查尔酮还原酶1基因 克隆 表达载体构建 农杆菌介导
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