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基于RPA-CRISPR/Cas13a-LFD的鸭星状病毒2型快速可视化检测方法的建立
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作者 何书海 陶梦筱 +4 位作者 王露遥 周德方 周静 成子强 黄立 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第7期1372-1377,共6页
为了实现鸭星状病毒2型(duck astrovirus type 2,DAstV-2)的高效快速检测,根据DAstV-2的ORF2基因保守序列设计合成了RPA引物和crRNA,构建了集RPA核酸扩增、LwCas13a切割和胶体金试纸条可视化显色于一体的DAstV-2检测方法,并评估了该检... 为了实现鸭星状病毒2型(duck astrovirus type 2,DAstV-2)的高效快速检测,根据DAstV-2的ORF2基因保守序列设计合成了RPA引物和crRNA,构建了集RPA核酸扩增、LwCas13a切割和胶体金试纸条可视化显色于一体的DAstV-2检测方法,并评估了该检测方法的灵敏性、特异性和符合性。结果显示,该方法对DAstV-2重组质粒标准品的检测限为1.2×10^(1)copies/μL,优于常规RT-PCR方法;可特异性检测DAstV-2病原核酸,对DAstV-1、DAstV-3、DAstV-4、鸭瘟病毒(duck plague virus,DEV)和鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)无交叉反应;在对疑似DAstV-2感染病鸭肝脏组织样本进行检测时,本方法与实时荧光定量PCR的检测结果完全一致,符合率为100%,但操作更加简便快捷。研究结果表明,所建立的RPA-CRISPR/Cas13a-LFD检测体系灵敏度高、特异性强、准确性高,能够在37℃恒温条件下1 h内完成DAstV-2核酸的快速可视化检测,为DAstV-2的快速诊断提供了新的技术平台。 展开更多
关键词 鸭星状病毒2型 重组酶聚合酶扩增 CRISPR/cas13a 横向侧流层析试纸条 核酸检测
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猪塞内卡病毒RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法的建立及应用
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作者 李晨钰 沙洲 +10 位作者 郑辉 崔进 迟田英 陈峰 曹振山 张慧 戈胜强 魏荣 南福龙 古少鹏 尼博 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第2期195-203,共9页
建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR Cas13a技术检测猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的快速检测方法。根据猪SVA保守基因序列设计8对RT-RAA引... 建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR Cas13a技术检测猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的快速检测方法。根据猪SVA保守基因序列设计8对RT-RAA引物,筛选最适扩增引物、最佳反应温度、最优RT-RAA反应体系。针对优化的RT-RAA体系设计并筛选最佳CRISPR-derived RNA(crRNA),构建最优RT-RAA-CRISPR反应体系。利用6种常见猪群病原核酸验证已建立方法特异性。用数字PCR标定的SVA cRNA标准品验证已建立方法敏感性。通过重复试验验证方法的稳定性。应用已建立的方法与临床样品进行符合检验。RT-RAA及CRISPR反应体系优化结果显示,RT-RAA反应温度为37℃,扩增效果最佳;从8条crRNA中筛选出crRNA 5检测信号最强。建立的RT-RAA-CRISPR Cas13a方法特异性好,与ASFV、PRRSV、PEDV、PCV2、CSFV、PRV等常见猪群疫病均无交叉反应;方法敏感性高,对SVA最低检测限为0.86 copy/μL;对3个稀释度标准品检测均能稳定产生荧光,重复性好;能够在50 min内完成临床样品检测,对临床检毕的6份阳性样品及58份阴性样品进行符合检测,结果表明检测结果一致,符合率100%。结果表明,本研究建立了一种高特异性、高敏感性的RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法,有望应用于SVA的现场快速检测。 展开更多
关键词 RT-RAA CRISPR/cas13a SVA
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CRISPR-Cas13a蛋白结合RT-RPA技术检测H5N6和H9N2亚型禽流感病毒
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作者 吴晶晶 翁育伟 +1 位作者 黄枝妙 陈宏彬 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第3期235-242,共8页
目的将逆转录-重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)和成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas13a蛋白结合,建立一种快速、高灵敏度和高特异性禽流感病毒(AIV)H5N6和H9N2亚型的核酸检测方法。方法选择AIV H5、H6、H9和N2基因的保守序列,分别... 目的将逆转录-重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)和成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas13a蛋白结合,建立一种快速、高灵敏度和高特异性禽流感病毒(AIV)H5N6和H9N2亚型的核酸检测方法。方法选择AIV H5、H6、H9和N2基因的保守序列,分别设计特异性RT-RPA引物及crRNA序列,建立RT-RPA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测反应体系,评价检测方法的灵敏度和特异性。使用AIV外环境核酸阳性和阴性样本进行检测,并与荧光定量RT-PCR法结果进行比较,评价RT-RPA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白的检测效果。结果H5、H9和N2亚型的检测灵敏度可达1拷贝/μL,N6亚型的检测灵敏度为10拷贝/μL,不同拷贝数浓度的质粒样本在蓝光切胶仪中能显示荧光,且4种亚型特异性良好,与其余AIV亚型无交叉反应。H5、N6和H9亚型外环境核酸阳性、阴性样本与荧光定量RT-PCR法结果一致,准确率均为100%;N2亚型的外环境核酸阳性样本全部检出,另检出1份阴性样本,准确率为97.9%。结论建立的CRISPR-Cas13a蛋白结合RT-RPA技术检测方法能灵敏、特异且可视化的检出H5N6和H9N2亚型AIV,可为AIV病原监测和AIV亚型分型提供新的核酸检测方法。 展开更多
关键词 CRISPR-cas13a 重组酶聚合酶扩增技术 禽流感病毒 核酸检测
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牛轮状病毒RAA-CRISPR/Cas13a快速检测方法的建立
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作者 袁炫帅 赵琳琳 龙淼 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第11期70-76,共7页
为建立一种快速检测牛轮状病毒(BRV)的方法,本试验结合重组酶介导等温扩增(RAA)技术和簇状规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白13a(CRISPR/Cas13a)系统,以BRV保守基因序列VP6设计Target RNA、RAA扩增引物和crRNA,并筛选最佳RAA引物和... 为建立一种快速检测牛轮状病毒(BRV)的方法,本试验结合重组酶介导等温扩增(RAA)技术和簇状规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白13a(CRISPR/Cas13a)系统,以BRV保守基因序列VP6设计Target RNA、RAA扩增引物和crRNA,并筛选最佳RAA引物和反应条件,建立BRV的RAA-CRISPR/Cas13a检测方法,同时验证该方法的特异性、敏感性和重复性,并与逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法进行临床样本检测对比。结果显示,RAA-CRISPR/Cas13a检测方法与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛星状病毒(BoAstV)和大肠杆菌(Escherichia coli)未发生交叉反应,特异性强;最低检测限为1.9×10^(2) copies/μL,敏感性强;组内、组间变异系数分别为3.9%和7.4%,分别小于5%和10%,重复性良好。检测108份牛粪样本,RAA-CRISPR/Cas13a与RT-qPCR检测的阳性检出率均为44%(47/108),符合率为100%。结果表明,本试验建立的BRV RAA-CRISPR/Cas13a快速检测方法灵敏度高、特异性强,可为BRV临床快速检测提供有力技术支撑。 展开更多
关键词 牛轮状病毒(BRV) 重组酶介导等温扩增(RAA) CRISPR/cas13a 实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR) 病毒检测
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基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a的寨卡病毒检测方法的建立
5
作者 张雅路 石耀强 +3 位作者 刘金胜 李世林 陈利民 杨春晖 《临床输血与检验》 2025年第3期393-401,共9页
目的寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种经伊蚊传播的新发黄病毒,近期研究提示其可能通过输血途径传播。现有检测方法存在灵敏度不足及覆盖范围有限等问题,亟需开发适用于中小型实验室或现场筛查的便捷检测技术。方法本研究基于CRISPR/Cas... 目的寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种经伊蚊传播的新发黄病毒,近期研究提示其可能通过输血途径传播。现有检测方法存在灵敏度不足及覆盖范围有限等问题,亟需开发适用于中小型实验室或现场筛查的便捷检测技术。方法本研究基于CRISPR/Cas13a系统联合逆转录重组酶介导链置换核酸扩增(RT-RAA)技术,建立并优化了一种胶体金试纸条检测法,用于ZIKV RNA的特异性识别。结果所构建的RT-RAA-CRISPR/Cas13a试纸条检测灵敏度达4 copies/μL,特异性为100%,可精准检测梯度浓度标准品及临床样本。对ZIKV阳性样本的检测符合率为100%,阴性符合率亦为100%。血浆样本检测的灵敏度、特异性、阳性预测一致性(positive predictive agreement,PPA)和阴性预测一致性(negative predictive agreement,NPA)均为100%。结论本研究成功开发了一种基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a技术的ZIKV快速可视化检测试纸条。该方法操作简便、灵敏度高、结果判读直观,为寨卡感染的现场筛查提供了可替代PCR检测的新型解决方案,特别适用于资源有限场景下的即时诊断需求。 展开更多
关键词 CRISPR/cas13a 逆转录重组酶介导链置换核酸扩增 寨卡病毒 即时检测
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RAA-CRISPR/cas13a(cpf1)-LFD兔出血症2型诊断方法的建立
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作者 林芸 王媛 +3 位作者 刘立荣 陈佳祺 陈蓓蕾 王全溪 《福建农业学报》 北大核心 2025年第2期151-157,共7页
【目的】兔出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHdV-2)于2020年在我国被发现,并呈地方性流行。本研究旨在建立一种适用于生产一线的快速、简便且无需昂贵仪器的检测方法。【方法】采用生物信息学软件(Vector NTI alignment... 【目的】兔出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHdV-2)于2020年在我国被发现,并呈地方性流行。本研究旨在建立一种适用于生产一线的快速、简便且无需昂贵仪器的检测方法。【方法】采用生物信息学软件(Vector NTI alignment)分析兔出血症1型(rabbit hemorrhagic disease type 1, RHdV-1)和兔出血症2型RHdV-2基因组,筛选出RHdV-2特异且保守的VP60基因片段。基于此片段,设计重组酶介导等温核酸扩增技术-侧流层析试纸条检测(recombinase aided amplification-lateral flow dipstick, RAA-LFD)的探针与特异性引物。然后在RAA扩增产物的基础上,设计并筛选最适CRISPR衍生RNA(CRISPR-derived RNA, crRNA),并对簇状规律间隔性成簇短回文重复序列相关蛋白13a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a, CRISPR-Cas13a)的反应体系进行优化。筛选针对RHdV-2的RAA-CRISPR/Cas13a (cpf1)-LFD诊断方法的最适反应时间,并对该方法的敏感性、特异性进行评价。最后使用该方法对临床31份疑似样品进行检测。【结果】同源性分析结果表明,RHdV-2的VP60基因上存在特异且保守的序列,合成VP60特异性引物进行RAA扩增。以RAA产物作为反应模板,发现crRNA1特异性最好。反应时间结果表明,在RAA基础反应后仅再需10 min即可在试纸条上出现明显阳性结果。敏感性试验结果显示,以重组质粒为模板,最低检出质粒拷贝数为6.7×10^(1) copies·μL^(-1)。特异性结果表明,只有RHdV-2为阳性,表明该方法特异性好。采用RAA-CRISPR/Cas13a(cpf1)-LFD法对31份临床样品进行检测,检出阳性样品10份,检出率为30.3%。【结论】本研究建立了一种针对RHdV-2的快速、简便的RAA-CRISPR/Cas13a (cpf1)-LFD检测方法,该方法对快速确诊RHdV-2以及科学防控该病具有十分重要的意义。 展开更多
关键词 重组酶介导的核酸等温扩增 CRISPR-cas13a系统 侧流层析试纸条 兔出血症病毒2型 诊断方法
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基于RAA-CRISPR/Cas13a技术的小鼠肝炎病毒预警方法的建立与应用
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作者 蔡何清 张旭亮 +3 位作者 陈晓娟 汪洌 戴方伟 李巍 《实验动物科学》 2025年第3期23-29,共7页
目的建立基于环境介质的小鼠肝炎病毒(MHV)快速监测方法,实现实验动物屏障环境的病原早期预警。方法分析MHV的保守序列,对特异重组酶介导等温扩增(RAA)引物及CRISPR/Cas13a反应的crRNA进行设计和优化,建立用于检测MHV的RAA-CRISPR/Cas13... 目的建立基于环境介质的小鼠肝炎病毒(MHV)快速监测方法,实现实验动物屏障环境的病原早期预警。方法分析MHV的保守序列,对特异重组酶介导等温扩增(RAA)引物及CRISPR/Cas13a反应的crRNA进行设计和优化,建立用于检测MHV的RAA-CRISPR/Cas13a检测体系,并验证其特异性、敏感性。为进一步验证其实用性,将该检测体系应用于动物环境粉尘样本的检测。结果针对实验动物生存环境的粉尘样本,建立了基于重组酶介导等温扩增(RAA)结合CRISPR/Cas13a技术的MHV快速检测方法。特异性实验结果表明,该方法对仙台病毒(SeV)、呼肠孤病毒3型(Reo-3)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠脑脊髓炎病毒(MEV)及小鼠诺如病毒(MNV)等常见小鼠病毒均无交叉反应;对MHV检测具有高度特异性,最低检测限可达10 copies/μL,具有优越的检测灵敏度。采用PCR法为对照进行临床样本验证,160份随机粉尘样本进行平行检测,两种方法检测结果完全一致,共检出26份核酸阳性样本。结论基于环境粉尘的RAA-CRISPR/Cas13a检测体系为实验动物设施病原监测提供了新的思路及高效灵敏的技术支持。 展开更多
关键词 实验动物 病原预警方法 快速检测 CRISPR/cas13a MHV
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基于RAA-CRISPR/Cas13a的空肠弯曲杆菌检测方法的建立
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作者 罗如杏 梁子立 +3 位作者 何琪富 张炎 张志东 郭紫晶 《现代畜牧兽医》 2025年第8期14-19,共6页
研究旨在将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术结合,建立基于RAA-CRISPR/cas13a的空肠弯曲杆菌检测方法。针对空肠弯曲杆菌的保守基因设计特异... 研究旨在将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术结合,建立基于RAA-CRISPR/cas13a的空肠弯曲杆菌检测方法。针对空肠弯曲杆菌的保守基因设计特异性的CRISPR RNA序列和RAA引物,通过RAA扩增后进行CRISPR-Cas13a的荧光检测,优化检测体系中主要成分,之后对优化后的检测方法的特异性、敏感性、重复性进行评估,并通过检测临床样品与现有的实时荧光PCR(qPCR)检测方法进行比较。结果显示,优化后的检测方法对多种食源性致病菌无交叉反应,具有良好的特异性;检测下限低至9.3 copies/μL,具有较高的灵敏度。组内和组间的变异系数分别低于4.15%和3.51%,具有良好的重复性。该方法对40份猪腹泻粪便样品的检出率为30%(12/40),高于qPCR检测方法(20%,8/40),检测的12份阳性样品经测序进一步确认为空肠弯曲杆菌,证明该方法检测结果的准确性。研究表明,试验建立了灵敏高、特异性强的检测空肠弯曲杆菌的RAA-CRISPR/Cas13a方法,为空肠弯曲杆菌的检测提供了新技术,在食源性疾病监测和动物疫病防控领域展现出良好的应用前景。 展开更多
关键词 空肠弯曲杆菌 RAA CRISPR-cas13a
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基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a的猪流行性腹泻病毒检测方法的建立与初步应用 被引量:1
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作者 郑江涛 刘哲言 +2 位作者 王永富 青易 朱玲 《四川农业大学学报》 北大核心 2025年第4期1034-1042,共9页
【目的】开发一种针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高特异性、高灵敏度且便捷的检测方法。【方法】结合重组酶辅助扩增(RAA)技术与CRISPR-Cas13a系统,针对PEDV的M基因设计RT-RAA引物、CRISPR RNA及报告探针。通过优化反应条件,构建具备双... 【目的】开发一种针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的高特异性、高灵敏度且便捷的检测方法。【方法】结合重组酶辅助扩增(RAA)技术与CRISPR-Cas13a系统,针对PEDV的M基因设计RT-RAA引物、CRISPR RNA及报告探针。通过优化反应条件,构建具备双读数功能的RT-RAA-CRISPR/Cas13a可视化平台,并对其检测能力进行了评估。【结果】该方法可特异性检测PEDV,与猪德尔塔冠状病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,且检测灵敏度达到1 copy/µL;与行业标准RT-qPCR方法的检测结果相比,其符合率达到100%。【结论】建立的RT-RAA-CRISPR/Cas13a可视化检测方法可在1 h内完成对PEDV的检测,为快速现场诊断和防控提供了有力的技术保障。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 反转录-重组酶介导等温核酸扩增技术 规律间隔成簇短回文重复序列-关联蛋白13a 可视化检测
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猪流行性腹泻病毒RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的建立与初步应用 被引量:6
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作者 刘华 殷冬冬 +7 位作者 邵颖 宋祥军 王振宇 潘孝成 涂健 何长生 朱良强 祁克宗 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3991-3997,共7页
将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合,即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PE... 将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合,即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以RT-qPCR为对照方法,评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明,该方法最低可检测至101 copies·μL^(-1),且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-Cas13a方法灵敏度高、特异性强,为PEDV的临床诊断和流行病学监测提供了可靠的技术手段。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 CRISPR/cas13a 重组酶辅助扩增 N基因 检测
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与众不同的核酸酶Cas13a:编辑RNA的新CRISPR平台及其进展 被引量:2
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作者 刘贵生 MEKCNAY Supamit +3 位作者 吴俊静 乔木 彭先文 梅书棋 《湖北农业科学》 2018年第2期5-8,共4页
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,规律成簇的间隔短回文重复)平台是出色的基因组编辑工具,其中新型核酸酶Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)既可编辑DNA,也可编辑RNA,这一新平台可实现DNA或RNA... CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,规律成簇的间隔短回文重复)平台是出色的基因组编辑工具,其中新型核酸酶Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)既可编辑DNA,也可编辑RNA,这一新平台可实现DNA或RNA的摩尔灵敏度以及单碱基错配的特异性检测,同时拓展用于病毒与细菌的精细检测(甚至是寨卡与登革热的近亲病毒株)、癌症早期监测和遗传性疾病等治疗;其需要设计少,技术操作简单,具有广泛的应用潜力,是基因组编辑的又一项卓越成果。综述了Cas13a系统的最新进展。 展开更多
关键词 基因组编辑 CRISPR cas13a RNA 基因网络调控
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CRISPR/Cas13a在肺结核诊断中的效能研究
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作者 聂晓平 韩梅 +4 位作者 杨松 王乐乐 李同心 黄正谷 高雯琬 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第S02期35-37,共3页
目的:分析评价CRISPR/Cas13a对肺结核的检测诊断价值。方法:收集重庆市公共卫生医疗救治中心2023年2月至2023年5月收治住院的45例经病原学确诊(分枝杆菌培养阳性)的肺结核患者痰液标本作为结核病组,并收集同期收治入院的23例非结核病患... 目的:分析评价CRISPR/Cas13a对肺结核的检测诊断价值。方法:收集重庆市公共卫生医疗救治中心2023年2月至2023年5月收治住院的45例经病原学确诊(分枝杆菌培养阳性)的肺结核患者痰液标本作为结核病组,并收集同期收治入院的23例非结核病患者(包括社区获得性肺炎、慢性支气管炎、单纯疱疹病毒感染、细菌性肺炎、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病)痰液标本作为非结核病组。所有患者的标本均进行CRISPR-Cas13a检测,且至少进行一项分子检测:结核分枝杆菌复合群核酸扩增检测或Gene Xpert MTB/RIF检测。结果:以分枝杆菌培养结果作为参考,在结核病组中TB-DNA/Xpert检测方法检出阳性标本有42例,CRISPR/Cas13a检出阳性标本有43例;在非结核病组中TB-DNA/Xpert方法检出阳性1例,CRISPR/Cas13a检出均为阴性,差异均无统计学意义(P=1.0)。CRISPR/Cas13a检测肺结核的敏感度为95.6%,特异度为100%,阳性预测值为100%,阴性预测值为92.0%,Kappa值为0.94。结论:与传统的分子生物学方法相比,CRISPR/Cas13a在检测肺结核方面具有较高的敏感度和特异度,在实现对肺结核快速、高效检测具有巨大的潜力。 展开更多
关键词 肺结核 Gene Xpert MTB/RIF CRISPR/cas13a
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CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定 被引量:4
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作者 王勋 张雨杭 +6 位作者 孙亚宁 李青梅 李鸽 王丽 郭军庆 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2021年第4期147-153,共7页
为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结... 为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白。对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16℃条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高。通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想。此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37℃条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L。综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法。 展开更多
关键词 CRISPR/cas13a蛋白 原核表达 镍柱亲和层析 连带剪切酶活性 核酸检测
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CRISPR-Cas13a辅助RAA快速检测金黄色葡萄球菌的研究 被引量:14
14
作者 苏璇 葛以跃 +10 位作者 张倩 朱小娟 陈银 吴涛 乔乔 赵康辰 吴斌 王祥喜 庞正 朱凤才 崔仑标 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第3期253-258,共6页
目的建立一种金黄色葡萄球菌快速分子检测技术。方法根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)保守区序列设计合成特异性引物,通过对反应条件进行优化,建立金黄色葡萄球菌重组酶介导的等温扩增技术(Recombi-naseaidedamplification,RAA);... 目的建立一种金黄色葡萄球菌快速分子检测技术。方法根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)保守区序列设计合成特异性引物,通过对反应条件进行优化,建立金黄色葡萄球菌重组酶介导的等温扩增技术(Recombi-naseaidedamplification,RAA);表达纯化CRISPR-Cas13a蛋白,设计特异的crRNA(CRISPR RNA),以crRNA引导CRISPR-Cas13a蛋白对RAA产物进行检测;对优化的方法进行灵敏性和特异性评价,同时采用该方法与real-timePCR法对食品标本中的金黄色葡萄球菌进行检测,评价方法的一致性。结果CRISPR-Cas13a辅助RAA检测金黄色葡萄球菌的灵敏度为101 CFU/ml,高于real-timePCR,约102 CFU/ml,检测时间仅需30min,与其他食源性致病菌无交叉反应;该方法和real-timePCR检测80份食品样品的阳性率均为8.75%,具有高度一致性(Kappa=1,P>0.05)。结论建立的CRISPR-Cas13a辅助RAA方法具有简便、快速、灵敏、特异等优点,为金黄色葡萄球菌的检测提供了新的技术手段。 展开更多
关键词 RAA CRISPR-cas13a 金黄色葡萄球菌 快速分子检测
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应用CRISPR/Cas13a快速鉴定布鲁氏菌 被引量:6
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作者 黄明耀 梁文立 +7 位作者 吴婉婷 刘足 谢淑媚 邓颖颖 傅俊方 姜长宏 龙军 江凌晓 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期426-429,共4页
目的建立一种基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法。方法以布鲁氏菌BCSP31基因的保守区为靶标区域设计特异的引物和crRNA,建立鉴定布鲁氏菌的CRISPR/Cas13a方法。通过对纯菌株以及临床需氧血培养阳性菌液检测评价该方法的特异性和敏感... 目的建立一种基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法。方法以布鲁氏菌BCSP31基因的保守区为靶标区域设计特异的引物和crRNA,建立鉴定布鲁氏菌的CRISPR/Cas13a方法。通过对纯菌株以及临床需氧血培养阳性菌液检测评价该方法的特异性和敏感性;通过梯度稀释法评估其检测下限。结果建立了基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌快速鉴定方法,其检测下限可达10 fg/μL。通过鉴定64株布鲁氏菌、56株非布鲁氏菌、人DNA以及57例临床需氧血培养阳性菌液,计算该方法的敏感性、特异性可达100%。结论建立了一种基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法,可用于临床需氧血培养阳性后快速鉴定布鲁氏菌。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 CRISPR/cas13a 快速诊断
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重组酶介导的等温扩增技术联合CRISPR-Cas13a快速检测4种腹泻病原菌 被引量:7
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作者 安柏霖 苏璇 +4 位作者 郭悦 王祥喜 葛以跃 朱凤才 崔仑标 《中国食品卫生杂志》 CSCD 北大核心 2023年第3期381-389,共9页
目的重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H74种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a。方法设计4种腹泻病原菌... 目的重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H74种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a。方法设计4种腹泻病原菌的RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a恒温荧光检测,以实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)为对照方法,评价RAA-Cas13a优化方法的灵敏度与特异性。结果RAA-Cas13a方法可在35 min内完成检测。检测志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7的最低检测限为10 copies/μL,沙门菌最低检测限为1 copy/μL;特异性实验表明每一种病原菌与其余10种对照细菌均无交叉反应。应用建立的方法检测200份实际样本和40份人工污染样本,结果表明同RT-qPCR检测结果一致性高(分别为Kappa=0.927和Kappa=1.000)。结论RAA-Cas13a检测方法具有灵敏度高,特异性强等优点,能用于4种腹泻病原菌的快速检测。 展开更多
关键词 重组酶介导的等温扩增技术 CRISPR-cas13a 腹泻病原菌 快速分子检测
原文传递
PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统对MTB DNA检测方法的初步研究 被引量:5
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作者 于佳佳 张旭霞 +5 位作者 张雨晴 任卫聪 姚丛 李传友 刘毅 唐神结 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2020年第12期1280-1288,共9页
目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonuc... 目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-1crRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为101拷贝/μl的质粒和100拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于106拷贝/μl的MTB DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均=-9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。 展开更多
关键词 结核 分枝杆菌 聚合酶链反应 DNA探针 微阵列分析 CRISPR-cas13a
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重组酶辅助扩增结合CRISPR/Cas13a检测禽腺病毒4型方法的建立 被引量:2
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作者 殷冬冬 郭浩 +5 位作者 兰梦蝶 尹磊 王洁茹 沈学怀 戴银 潘孝成 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2023年第5期803-807,共5页
【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)检测方法。【方法】将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(clustered regularly i... 【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)检测方法。【方法】将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a,CRISPR-Cas13a)技术相结合,针对FAdV-4 Hexon基因保守区设计RAA引物及CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以qPCR为对照方法,评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR法的一致性。【结果】本研究所建立的方法反应过程均在37℃恒温条件下完成,反应体系可检测的最低扩增拷贝数为101 copies/μL,灵敏度高,且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。该方法检测30份临床样本与qPCR检测的阳性检出率一致。【结论】建立的RAA-Cas13a方法检测FAdV-4具有简便、灵敏、特异等特点,可用于FAdV-4的快速检测和流行病学监测。 展开更多
关键词 禽腺病毒4型 CRISPR/cas13a 重组酶辅助扩增 检测
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