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细胞色素P450 2C9*8与CYP2C9*27慢病毒表达载体的构建及在HEK239T细胞中的稳定表达 被引量：1
1
作者 廖凯 刘勇 +1 位作者 万子衿 李巍 《实用临床医药杂志》 CAS 2018年第7期1-6,共6页
目的构建人细胞色素P450 2C9(CYP2C9)及突变体CYP2C9*8与CYP2C9*27的慢病毒表达质粒,并于HEK293T细胞中稳定表达。方法反转录人肝总RNA获得c DNA,PCR扩增获得CYP2C9编码序列,并克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-CYP2C9。... 目的构建人细胞色素P450 2C9(CYP2C9)及突变体CYP2C9*8与CYP2C9*27的慢病毒表达质粒,并于HEK293T细胞中稳定表达。方法反转录人肝总RNA获得c DNA,PCR扩增获得CYP2C9编码序列,并克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-CYP2C9。以该质粒为模板,重叠PCR方法分别引入449G>A与449G>T点突变,并分别克隆至MigR1,获得MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9*27慢病毒表达质粒。在HEK 293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9*27的细胞,命名为293T-2C9、293T-2C9*8与293T-2C9*27。实时定量PCR(qRT-PCR)与Western blot检测胞内CYP2C9表达。采用CYP2C9的特异性底物双氯芬酸对CYP2C9的活性进行评价。结果成功构建MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9*27表达载体。采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-2C9、293T-2C9*8与293T-2C9*27在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100%,qRT-PCR与Western blot均表明有目标分子表达。提取自这三株细胞的微粒体均可催化双氯芬酸代谢为4-羟基双氯芬酸。结论成功构建稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9*27人源化细胞模型,该方法构建的细胞可用于CYP2C9*8与*27两个突变体的功能研究。 展开更多
关键词 细胞色素P4502C9(cyp2c9) cyp2c9*8 cyp2c9*27 慢病毒 HEK293T
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何首乌水提物及其主要成分对人肝细胞L02中CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1 mRNA表达的影响 被引量：25
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作者 王子建 李浩 +5 位作者 李登科 陈静 吴双 周明 全正扬 孙震晓 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2017年第23期4912-4920,共9页
目的分析何首乌水提物中主要化学成分及其量,阐明何首乌水提物及其主要成分对人正常肝实质细胞L02中CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1 mRNA表达的影响。方法 HPLC测定何首乌水提物中主要化学成分及其质量分数;MTT法确定何首乌水提物及其主要成分... 目的分析何首乌水提物中主要化学成分及其量,阐明何首乌水提物及其主要成分对人正常肝实质细胞L02中CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1 mRNA表达的影响。方法 HPLC测定何首乌水提物中主要化学成分及其质量分数;MTT法确定何首乌水提物及其主要成分对L02细胞活力的影响;实时荧光定量PCR测定L02细胞中CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1mRNA表达量。结果何首乌水提物主要含有二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素和大黄素甲醚,各成分在何首乌水提物中的质量分数分别为(1.14±0.03)%、(0.106 9±0.001 6)%、(0.010 8±0.000 9)%、(0.003 55±0.000 19)%;何首乌水提物及其主要成分作用L02细胞24 h,何首乌水提物和大黄素对细胞活力的影响随着药物浓度的增加抑制作用增强,IC50值分别为7.290 mg/m L和0.082 mmol/L,二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素甲醚在实验浓度范围内对细胞活力的抑制作用不明显;何首乌水提物、大黄素均可明显抑制L02细胞中CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1 mRNA的表达;大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷抑制CYP1A2和CYP2C9的mRNA表达;二苯乙烯苷抑制CYP1A2 mRNA表达,但激活CYP2C9mRNA表达;大黄素甲醚浓度依赖性抑制CYP1A2、CYP2C9 mRNA表达,却表现低浓度抑制、高浓度激活CYP2E1 mRNA表达。结论何首乌水提物抑制L02细胞中CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1 mRNA表达是其所含各种成分综合作用的结果,何首乌4种主要成分均可抑制CYP1A2 mRNA表达,蒽醌成分是抑制CYP2C9 mRNA表达的主要成分,游离蒽醌是抑制CYP2E1 mRNA表达的主要成分。 展开更多
关键词 何首乌水提物 蒽醌衍生物 CYP1A2 cyp2c9 CYP2E1 二苯乙烯苷 大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷 大黄素 大黄素甲醚
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