目的:探讨使用CRSIPR/Cas9技术删除CTL的免疫检查点CTLA-4后CTL的抗裸鼠结肠癌移植瘤的效果及其作用机制。方法:针对CTLA-4设计特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)并构建sgRNA/Cas9质粒,使用慢病毒载体转染质粒至CTL获得删除CTLA-4...目的:探讨使用CRSIPR/Cas9技术删除CTL的免疫检查点CTLA-4后CTL的抗裸鼠结肠癌移植瘤的效果及其作用机制。方法:针对CTLA-4设计特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)并构建sgRNA/Cas9质粒,使用慢病毒载体转染质粒至CTL获得删除CTLA-4的CTL(CTLA-4 KO CTL),并验证质粒的转染效率和CTLA-4的删除效率。BALB/c裸鼠随机分为2组进行实验,预防性注射CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组),3 d后接种结肠癌细胞株LS174-T,观察成瘤率及成瘤时间。建立结肠癌移植瘤裸鼠模型,成瘤后裸鼠随机分为2组,分别给予CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组)进行细胞治疗,观察移植瘤的体积、裸鼠的生存时间,并检测移植瘤裸鼠血清中TNF-α及IFN-γ分泌水平。结果:设计sgRNA并成功构建以慢病毒为载体的CRSIPR/Cas9系统,使用构建好的CRSIPR/Cas9系统转染CTL细胞,转染效率最高可达(28.80±0.62)%,转染后以流式细胞术检测CTLA-4的删除效率,CTLA-4 KO CTL组的CTLA-4表达较CTL组显著降低[(0.91±0.25)%vs(42.70±2.72)%,P<0.01]。预防实验中,实验组结肠癌移植瘤发生率明显低于对照组(33.33%vs 100.00%,P<0.01)。治疗实验中,实验组肿瘤体积较对照组显著减少[(503.0±23.9)vs(911.2±51.4)mm^3,P<0.05],实验组裸鼠相较于对照组生存时间明显延长(中位生存期:78 vs 42 d,P<0.05),实验组裸鼠血清TNF-α[(268.93±17.04)vs(148.26±20.07)pg/ml,P<0.05]及IFN-γ[(315.38±18.67)vs (202.92±29.32) pg/ml,P<0.05]的分泌水平较对照组明显增高。结论:以CRSIPR/Cas9技术成功删除CTL中免疫检查点CTLA-4后可以显著抑制裸鼠结肠癌移植瘤的成瘤率、增强CTL对荷结肠癌裸鼠的抗肿瘤作用,并明显增高荷瘤鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平。展开更多
非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein,nsLTPs)广泛存在于植物界中,参与许多关键的生物学过程,如花粉的发育、种子发育及细胞壁的延伸等。OsLTPL166基因编码区长度是465 bp,其编码的蛋白质由154个氨基酸组成;根据...非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein,nsLTPs)广泛存在于植物界中,参与许多关键的生物学过程,如花粉的发育、种子发育及细胞壁的延伸等。OsLTPL166基因编码区长度是465 bp,其编码的蛋白质由154个氨基酸组成;根据跨膜结构域及信号肽预测,OsLTPL166在13~35氨基酸处含有跨膜结构域,N端存在一个32个氨基酸残基的信号肽,切割位点位于氨基酸残基32和33之间,产生具有122个氨基酸残基的成熟蛋白质。组织表达分析发现,OsLTPL166仅在种子中特异性表达,且种子发育后期表达量较高。为了研究水稻Os LTPL166在种子发育中的功能,本研究以‘浙辐粳83’为遗传背景构建了敲除载体,利用CRISPR/Cas9技术对OsLTPL166进行定点编辑,共获得24个独立的转基因株系,其中纯合突变株系有7株,编辑方式主要为碱基的插入和缺失,导致氨基酸序列发生移码,成功获得OsLTPL166功能缺陷型突变体。本研究为进一步探究该基因在种子发育进程中的生物学功能提供了遗传材料。展开更多
以营养缺陷型筛选标记基因ura3为靶标,利用基于核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)的成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)...以营养缺陷型筛选标记基因ura3为靶标,利用基于核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)的成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术,对灵芝(Ganoderma lucidum)双核菌株‘沪农灵芝1号’G0119及从其分离的2个交配亲和的单核菌株L1、L2进行基因编辑,比较单双核的编辑效率;对编辑的2个单核,进行杂交,以获得ura3被编辑的双核基因位点纯合菌株。结果表明:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,获得G0119双核编辑株7个,经双单杂交实验鉴定,有6个G0119编辑株为L1核被编辑,1个为L2核被编辑,7个编辑株均为杂合子;获得L1、L2的单核编辑株分别为10、7个,其中L1核被编辑的效率为100%。将突变类型均为C碱基缺失的单核L1-2和L2-1编辑株以及A插入碱基的L1-5和L2-3编辑株分别进行单单杂交,获得2株ura3被破坏的双核纯合菌株。利用CRISPR/Cas9基因编辑与杂交技术靶向创制灵芝基因位点纯合菌株的方法,可为创制灵芝其他功能基因的基因位点纯合菌株提供新的方法,也可为灵芝双核菌株的基因表型分析研究提供新的途径。展开更多
文摘目的:探讨使用CRSIPR/Cas9技术删除CTL的免疫检查点CTLA-4后CTL的抗裸鼠结肠癌移植瘤的效果及其作用机制。方法:针对CTLA-4设计特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)并构建sgRNA/Cas9质粒,使用慢病毒载体转染质粒至CTL获得删除CTLA-4的CTL(CTLA-4 KO CTL),并验证质粒的转染效率和CTLA-4的删除效率。BALB/c裸鼠随机分为2组进行实验,预防性注射CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组),3 d后接种结肠癌细胞株LS174-T,观察成瘤率及成瘤时间。建立结肠癌移植瘤裸鼠模型,成瘤后裸鼠随机分为2组,分别给予CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组)进行细胞治疗,观察移植瘤的体积、裸鼠的生存时间,并检测移植瘤裸鼠血清中TNF-α及IFN-γ分泌水平。结果:设计sgRNA并成功构建以慢病毒为载体的CRSIPR/Cas9系统,使用构建好的CRSIPR/Cas9系统转染CTL细胞,转染效率最高可达(28.80±0.62)%,转染后以流式细胞术检测CTLA-4的删除效率,CTLA-4 KO CTL组的CTLA-4表达较CTL组显著降低[(0.91±0.25)%vs(42.70±2.72)%,P<0.01]。预防实验中,实验组结肠癌移植瘤发生率明显低于对照组(33.33%vs 100.00%,P<0.01)。治疗实验中,实验组肿瘤体积较对照组显著减少[(503.0±23.9)vs(911.2±51.4)mm^3,P<0.05],实验组裸鼠相较于对照组生存时间明显延长(中位生存期:78 vs 42 d,P<0.05),实验组裸鼠血清TNF-α[(268.93±17.04)vs(148.26±20.07)pg/ml,P<0.05]及IFN-γ[(315.38±18.67)vs (202.92±29.32) pg/ml,P<0.05]的分泌水平较对照组明显增高。结论:以CRSIPR/Cas9技术成功删除CTL中免疫检查点CTLA-4后可以显著抑制裸鼠结肠癌移植瘤的成瘤率、增强CTL对荷结肠癌裸鼠的抗肿瘤作用,并明显增高荷瘤鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平。
文摘以营养缺陷型筛选标记基因ura3为靶标,利用基于核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)的成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术,对灵芝(Ganoderma lucidum)双核菌株‘沪农灵芝1号’G0119及从其分离的2个交配亲和的单核菌株L1、L2进行基因编辑,比较单双核的编辑效率;对编辑的2个单核,进行杂交,以获得ura3被编辑的双核基因位点纯合菌株。结果表明:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,获得G0119双核编辑株7个,经双单杂交实验鉴定,有6个G0119编辑株为L1核被编辑,1个为L2核被编辑,7个编辑株均为杂合子;获得L1、L2的单核编辑株分别为10、7个,其中L1核被编辑的效率为100%。将突变类型均为C碱基缺失的单核L1-2和L2-1编辑株以及A插入碱基的L1-5和L2-3编辑株分别进行单单杂交,获得2株ura3被破坏的双核纯合菌株。利用CRISPR/Cas9基因编辑与杂交技术靶向创制灵芝基因位点纯合菌株的方法,可为创制灵芝其他功能基因的基因位点纯合菌株提供新的方法,也可为灵芝双核菌株的基因表型分析研究提供新的途径。
