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COLD-PCR技术的原理及应用 被引量:6
1
作者 徐琳琳 王文兵 《生物学杂志》 CAS CSCD 2012年第6期84-86,共3页
低变性温度下的复合PCR(COLD-PCR)技术是一种新开发的PCR方法,能够从大量野生型DNA中选择性扩增低水平未知突变。该技术显著地提高了低浓度突变的检测灵敏度,已经被应用于医药的很多领域,包括肿瘤检测、产前诊断以及传染性疾病检测等。... 低变性温度下的复合PCR(COLD-PCR)技术是一种新开发的PCR方法,能够从大量野生型DNA中选择性扩增低水平未知突变。该技术显著地提高了低浓度突变的检测灵敏度,已经被应用于医药的很多领域,包括肿瘤检测、产前诊断以及传染性疾病检测等。同时COLD-PCR可以与很多分子生物学检测方法结合使用,在临床诊断上具有较好的应用前景。对COLD-PCR技术做基本的介绍,并结合其在医药领域的应用进行综述。 展开更多
关键词 cold-pcr 突变 肿瘤 诊断
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COLD-PCR/Sanger法检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR和KRAS基因突变的价值 被引量:3
2
作者 周建英 刘震天 朱伟锋 《南昌大学学报(医学版)》 CAS 2015年第6期38-41,共4页
目的评价COLD-PCR/Sanger法检测晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血EGFR和KRAS基因突变的价值。方法采用COLD-PCR/Sanger对67例晚期NSCLC患者外周血中EGFR及KRAS基因突变进行检测,同时采用普通PCR/Sanger法进行平行检测。结果 67例样本... 目的评价COLD-PCR/Sanger法检测晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血EGFR和KRAS基因突变的价值。方法采用COLD-PCR/Sanger对67例晚期NSCLC患者外周血中EGFR及KRAS基因突变进行检测,同时采用普通PCR/Sanger法进行平行检测。结果 67例样本中,COLD-PCR/Sanger检测EGFR的突变率高于普通PCR/Sanger法(43.3%比26.87%,P<0.05),主要表现在外显子19、21的突变,二者的一致性较好(Kappa=0.582);COLD-PCR/Sanger检测KRAS的突变率高于普通PCR/Sanger法(16.4%比5.97%,P<0.05),二者的一致性较好(Kappa=0.49)。结论 COLD-PCR/Sanger是一种高灵敏度检测肺癌患者外周血EGFR和KRAS基因突变的方法。 展开更多
关键词 非小细胞肺癌 cold-pcr/Sanger EGFR基因突变 KRAS基因突变
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COLD-PCR-HRM检测结直肠癌患者外周血KRAS基因突变 被引量:1
3
作者 李艳丽 赵冬梅 +1 位作者 徐育红 张雁 《肿瘤代谢与营养电子杂志》 2017年第1期51-54,共4页
目的评价COLD-PCR-HRM检测结直肠癌患者外周血KRAS基因突变的临床应用价值。方法将已知突变型KRAS组织DNA与野生型DNA做系列稀释,突变DNA所占比例分别为50%、25%、10%、5%、3%、2%和1%。分别应用常规PCR-HRM法和COLD-PCR-HRM法对不同比... 目的评价COLD-PCR-HRM检测结直肠癌患者外周血KRAS基因突变的临床应用价值。方法将已知突变型KRAS组织DNA与野生型DNA做系列稀释,突变DNA所占比例分别为50%、25%、10%、5%、3%、2%和1%。分别应用常规PCR-HRM法和COLD-PCR-HRM法对不同比例KRAS突变DNA样本进行检测,验证两种检测方法的灵敏度;同时应用COLD-PCR-HRM法对62例外周血和肿瘤组织配对样本进行一致性验证。结果 PCR-HRM法最低检测浓度为3%;COLD-PCR-HRM法最低检测浓度为1%,两种方法的检测灵敏度均明显高于直接测序法(P<0.05)。应用COLD-PCRHRM法检测两种样本中KRAS基因突变状态,其中血清样本中检测出13例突变(突变率21.0%,13/62),组织中检测出12例突变(突变率19.4%,12/62),两种标本同时存在突变的有9例,以组织中检测的KRAS状态为准,两者突变一致性为75.0%(9/12)。KRAS基因突变在组织与外周血中存在一致性(κ=0.649;P<0.001)。结论 COLD-PCR结合HRM明显提高了KRAS突变检测灵敏度,为其应用于低丰度突变样本检测提供了有利条件。 展开更多
关键词 KRAS基因突变 cold-pcr-HRM 结直肠癌 外周血
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高分辨率溶解曲线分析结合COLD-PCR快速检测绵羊低丰度FecB基因 被引量:4
4
作者 李国忠 陈创夫 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2017年第6期122-126,131,共6页
本文利用高分辨率熔解曲线分析结合COLD-PCR建立绵羊骨形态发生蛋白受体IB(BMPR-IB)基因低丰度A746G点突变的检测方法,为Fec B基因大面积高通量筛查提供方便快捷和低成本的检测技术。实验分别提取绵羊BMPR-IB基因A746G点突变阳性纯合子... 本文利用高分辨率熔解曲线分析结合COLD-PCR建立绵羊骨形态发生蛋白受体IB(BMPR-IB)基因低丰度A746G点突变的检测方法,为Fec B基因大面积高通量筛查提供方便快捷和低成本的检测技术。实验分别提取绵羊BMPR-IB基因A746G点突变阳性纯合子和阴性纯合子的基因组,分别PCR扩增223 bp的目的片段,测定浓度和纯度后,分别稀释至0.05 ng/μL,将阳性纯合子用阴性纯合子进行系列稀释作为模板标准品。根据模板标准品序列设计合成3对引物,以标准品为模板进行COLD-PCR,其产物进行高分辨率熔解曲线分析,生成的归一化温度转移差异图(Normlized and Temp-Shifted Differines Plot)即为标准曲线图,作为待测样品Fec B检测的依据,对其可靠重复性做了进一步验证。结果表明:2对引物COLD-PCR HRM标准曲线图曲线分离清晰可靠,检测下限均为0.5%,与传统q PCR HRM相比,灵敏度提高到4倍。本实验建立的绵羊低丰度Fec B基因检测方法可以用于绵羊Fec B基因大面积高通量快速筛查工作。 展开更多
关键词 绵羊 FECB基因 cold-pcr 高分辨率熔解曲线分析
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EGFR基因T790M突变COLD-PCR扩增体系的Tc值筛选 被引量:1
5
作者 罗凯 王倩 +1 位作者 仇秦威 贺智敏 《检验医学与临床》 CAS 2016年第10期1328-1330,1333,共4页
目的筛选表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M突变PCR扩增体系的Tc值并初步建立具T790M突变富集效果的低变性温度下的复合聚合酶链反应(COLD-PCR)体系,同时探讨Tc值的筛选策略以及注意事项。方法以肺癌MSTO-211H、NCI-H1975细胞为T790M突... 目的筛选表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M突变PCR扩增体系的Tc值并初步建立具T790M突变富集效果的低变性温度下的复合聚合酶链反应(COLD-PCR)体系,同时探讨Tc值的筛选策略以及注意事项。方法以肺癌MSTO-211H、NCI-H1975细胞为T790M突变野生型和突变型标准样品,通过目标片段关键变性温度筛选实验、COLD-PCR反应模式比较实验以及Tc值的验证实验,确定COLD-PCR体系的Tc值并初步验证其效果。结果本实验体系T790M突变的目的扩增片段关键变性温度低于野生型片段,据此体系反应模式选择为快速COLD-PCR反应模式,同时确定Tc值为89.6℃,验证实验显示本体系可检出1%的T790M突变,较常规PCR提高5倍。至此T790M突变富集COLD-PCR扩增体系已成功建立。结论成功完成体系Tc值的筛选并建立T790M突变富集COLD-PCR扩增体系。 展开更多
关键词 表皮生长因子受体基因 Tc值 低变性温度下的复合聚合酶链反应
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糙皮侧耳PoLIM基因家族鉴定与表达分析 被引量:1
6
作者 戚元成 王贺莲 +3 位作者 申进文 文晴 胡延如 王风芹 《食用菌学报》 CSCD 北大核心 2024年第2期19-25,共7页
在NCBI、JGI数据库中检索糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)PoLIMs,进行生物信息学分析;测定PoLIM 1~PoLIM 6在25℃培养7 d(菌丝期),16℃培养5 d(扭结前期)、10 d(扭结后期)、15 d(原基期)、22 d(子实体期)的相对表达量以及菌丝在4℃冷胁... 在NCBI、JGI数据库中检索糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)PoLIMs,进行生物信息学分析;测定PoLIM 1~PoLIM 6在25℃培养7 d(菌丝期),16℃培养5 d(扭结前期)、10 d(扭结后期)、15 d(原基期)、22 d(子实体期)的相对表达量以及菌丝在4℃冷胁迫12、24、48 h的相对表达量。结果表明:PoLIM1~PoLIM6的氨基酸数量为353~1 673;等电点为7.26~9.98;亚细胞定位预测均在细胞核中;有10个保守基序;启动子序列中包含光、生长素、MYB转录因子以及低温胁迫等响应元件。就相对表达量而言,PoLIM1在子实体期较高;Po LIM2在扭结后期和子实体期较高;Po LIM3、Po LIM4、Po LIM6在菌丝期较高;Po LIM5在扭结后期较高,在原基期及子实体期降低。与对照(25℃)相比,4℃冷胁迫时Po LIM1、Po LIM3、Po LIM5、Po LIM6的相对表达量升高。 展开更多
关键词 糙皮侧耳 LIM结构域 发育 QRT-PCR 冷胁迫
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草地贪夜蛾的冷识别温度及低温胁迫下Hsp70和Hsp90基因的响应 被引量:2
7
作者 田彩红 张俊逸 +4 位作者 党菁 黄建荣 尹新明 李国平 封洪强 《热带生物学报》 2024年第6期664-671,共8页
为了探明草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)幼虫和蛹的抗寒能力,室内测定了草地贪夜蛾1~6龄幼虫和蛹在低温条件下的死亡率,拟合线性回归方程,统计各发育阶段的冷识别温度,得到1~6龄幼虫和蛹的冷识别温度分别为-7.80℃、-9.70℃、-9.61... 为了探明草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)幼虫和蛹的抗寒能力,室内测定了草地贪夜蛾1~6龄幼虫和蛹在低温条件下的死亡率,拟合线性回归方程,统计各发育阶段的冷识别温度,得到1~6龄幼虫和蛹的冷识别温度分别为-7.80℃、-9.70℃、-9.61℃、-8.78℃、-8.29℃、-8.05℃和-9.51℃。通过实时荧光定量PCR对常温饲养和低温处理的草地贪夜蛾的Hsp 70基因(GenBank登录号:NC_064223.1)和Hsp 90基因(GenBank登录号:MN832694)进行表达分析,结果表明2种处理的草地贪夜蛾的Hsp 70基因和Hsp 90基因在不同发育阶段表达量均不同,经过低温处理后,Hsp70基因在1龄幼虫中表达量显著降低(P<0.05),在2~6龄幼虫和蛹中表达量极显著增加(P<0.01);Hsp90基因在1~6龄幼虫中表达量极显著增加(P<0.01),在蛹中表达量极显著降低(P<0.01)。 展开更多
关键词 草地贪夜蛾 冷识别温度 HSP70 HSP90 实时荧光定量PCR
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ASFV和PRV野毒及PRV疫苗毒多重纳米PCR检测方法的建立及应用 被引量:1
8
作者 赵越 姚来顺 +7 位作者 涂忠忠 曹泽昭 王炳量 薛珺 王改丽 贺文琦 宋德光 兰云刚 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1345-1350,共6页
为建立一种可同时检测ASFV、PRV野毒和PRV疫苗毒(缺失g E基因)的方法,本研究以ASFV的B646L基因、PRV的g E基因以及PRV的g D基因为检测对象,建立了可同时检测ASFV、PRV野毒和PRV疫苗毒的多重纳米PCR方法,并对其特异性、敏感性进行了研究... 为建立一种可同时检测ASFV、PRV野毒和PRV疫苗毒(缺失g E基因)的方法,本研究以ASFV的B646L基因、PRV的g E基因以及PRV的g D基因为检测对象,建立了可同时检测ASFV、PRV野毒和PRV疫苗毒的多重纳米PCR方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。结果显示,该方法可特异性扩增ASFV、PRV野毒和PRV疫苗毒的目的基因,而检测塞内卡病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪水疱性口炎病毒、猪圆环病毒2型时结果均呈阴性;B646L基因、g D基因和g E基因的检测限分别为4、7和8 copies/μL。此外,将商品化试剂盒检验结果与本试验建立的多重纳米PCR检测结果进行比对,结果表明符合率为100%。综上所述,本试验建立的多重纳米PCR方法具有特异性好、灵敏度高的优点,且能够同时检测ASFV、PRV野毒和PRV疫苗毒,可用于猪重大疾病的鉴别诊断和疫病防控。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 非洲猪瘟病毒 多重纳米PCR检测方法 冷链猪肉
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橡胶树蛋白激酶基因SnRK2.7的克隆及表达
9
作者 刘云飞 李言 田维敏 《热带生物学报》 2024年第1期1-9,共9页
为了探索蔗糖非发酵相关蛋白激酶2(Sucrose non-fermentating1-related protein kinase 2,SnRK2)在巴西橡胶树响应低温胁迫应答中的作用,采用RT-PCR技术,从橡胶树抗寒无性系93-114的叶片中克隆了SnRK2亚家族的一个成员,命名为HbSnRK2.7... 为了探索蔗糖非发酵相关蛋白激酶2(Sucrose non-fermentating1-related protein kinase 2,SnRK2)在巴西橡胶树响应低温胁迫应答中的作用,采用RT-PCR技术,从橡胶树抗寒无性系93-114的叶片中克隆了SnRK2亚家族的一个成员,命名为HbSnRK2.7。该基因包含一个1095 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。HbSnRK2.7的分子量为41.39 kD,等电点为4.70,具有保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,预测其能催化磷酸基从ATP转移到蛋白质底物上的丝氨酸/苏氨酸残基上,也是磷酸化位点的集中区域,还具有非生物胁迫所需的结构域和ABA(脱落酸)依赖的HbSnRK2.7激活所需结构域。q-PCR结果显示,HbSnRK2.7基因响应ABA诱导,呈下调表达模式。在ABA处理8 h时,表达量下调到最低点。在低温胁迫下,HbSnRK2.7的表达量极显著降低。低温胁迫4 h和8 h时,HbSnRK2.7持续下调表达,低温胁迫24 h时,HbSnRK2.7表达量下调到最低,大约为非胁迫表达量的1/2。而且,HbSnRK2.7在不抗寒种质中的表达量显著高于抗寒种质。这些结果表明,HbSnRK2.7可能作为负调控因子介导橡胶树依赖ABA的低温胁迫抗性形成。 展开更多
关键词 巴西橡胶树 蔗糖非发酵相关蛋白激酶 荧光定量PCR 低温胁迫抗性 脱落酸信号途径
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冷应激对民猪肌肉组织中抗氧化相关基因表达的影响
10
作者 王芳 马红 刘娣 《黑龙江动物繁殖》 2024年第2期1-5,23,共6页
为了明确冷应激对民猪肌肉组织抗氧化相关基因表达的影响,试验选取1~2月龄的民猪仔猪9头,随机分为3组,分别饲养在常温(22~25℃,对照)、短期低温(4℃3 d)和长期低温(4℃15 d)环境下。通过实时荧光定量PCR的方法检测常温组、短期低温组和... 为了明确冷应激对民猪肌肉组织抗氧化相关基因表达的影响,试验选取1~2月龄的民猪仔猪9头,随机分为3组,分别饲养在常温(22~25℃,对照)、短期低温(4℃3 d)和长期低温(4℃15 d)环境下。通过实时荧光定量PCR的方法检测常温组、短期低温组和长期低温组民猪仔猪的背最长肌中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)基因、核因子E2相关因子2(Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)mRNA表达量的变化。结果表明:与常温对照组相比,短期低温组和长期低温组民猪肌肉组织中SOD基因表达量变化不显著(P>0.05),而GPX表达量显著升高(P<0.05);短期低温组Nrf2基因表达量显著升高(P<0.05),但是长期低温组降低;短期低温组Keap1基因表达量变化不显著(P>0.05),而长期低温组中其表达量显著下降(P<0.05)。说明冷应激对民猪肌肉组织抗氧化物相关基因的表达有一定的影响。 展开更多
关键词 冷应激 民猪 肌肉 抗氧化相关基因 QRT-PCR
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通过富集母血浆中胎儿游离DNA无创性产前诊断β地中海贫血 被引量:5
11
作者 王青青 张媛 +2 位作者 章钧 郝秀兰 侯红瑛 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1861-1867,共7页
目的:评价富集母血浆中胎儿游离DNA的实验平台在母血浆中富集、鉴定胎儿游离DNA的适用范围。方法:(1)筛选与父源性β地中海贫血基因连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点:利用Haploview软件对20例β地中海贫血患者(其中CD41-42型11例,IVS-II-... 目的:评价富集母血浆中胎儿游离DNA的实验平台在母血浆中富集、鉴定胎儿游离DNA的适用范围。方法:(1)筛选与父源性β地中海贫血基因连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点:利用Haploview软件对20例β地中海贫血患者(其中CD41-42型11例,IVS-II-654型9例)的β地中海贫血基因(HBB基因)进行SNP与单倍型自动化分析,检索出HBB基因内杂合度较高的SNP位点并检测与CD41-42位点及IVS-II-654位点连锁的SNP位点。(2)选取4例孕妇外周血标本,且夫妇双方为不同的β地中海贫血基因类型,利用快速耐受温度-低变性温度共扩增PCR技术(TT-FAST-COLD-PCR)检测父源性β地中海贫血基因类型为IVS-II-654型的孕妇外周血标本,若未直接检测到IVS-II-654位点,则检测仅与IVS-II-654位点连锁的SNP位点;同样的原理,利用完全耐受温度-低变性温度共扩增技术(TT-FULL-COLD-PCR)检测父源性β地中海贫血基因类型为CD41-42型的孕妇外周血标本;同时利用普通PCR技术对上述标本进行检测。结果:(1)检测出IVS-II654位点与rs7480526位点连锁9例;CD41-42位点与rs10768683位点连锁11例;(2)通过TT-FAST-COLD-PCR技术在孕妇外周血中检测出1例父源性致病突变基因(IVS-II-654位点),另外1例未直接检测到父源性致病突变基因,但检测到与其连锁的SNP位点(rs7480526位点),与羊水细胞培养检测结果一致,检出率为100%(2/2);通过TT-FULL-COLD-PCR技术在孕妇外周血中检测出2例父源性致病突变基因(CD41-42位点),与羊水细胞培养检测结果一致,检出率为100%(2/2);而普通PCR技术均未检测到上述父源性致病突变基因及与父源性等位基因连锁的SNP位点。结论:TT-COLD-PCR技术适用于富集母血浆中胎儿游离DNA突变,可用于无创性产前诊断单基因遗传病。 展开更多
关键词 无创性产前诊断 胎儿游离DNA 耐受温度-低变性温度共扩增技术 Β地中海贫血 单核苷酸多态性
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冷驯化和冷冻条件下不同抗寒性冬小麦品种三个COR基因表达差异的实时荧光定量分析 被引量:11
12
作者 关涛 李卓夫 +1 位作者 王晓楠 付连双 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期230-235,共6页
COR基因是含有CRT/DRE调控元件的一类冷响应基因,在植物抗寒耐寒过程中发挥着重要作用。为了分析不同抗寒性的冬小麦品种中COR基因表达的差异,明确在抗寒中起关键作用的COR基因,本实验以抗寒品种东农冬麦1号和不抗寒品种济麦22为材料,... COR基因是含有CRT/DRE调控元件的一类冷响应基因,在植物抗寒耐寒过程中发挥着重要作用。为了分析不同抗寒性的冬小麦品种中COR基因表达的差异,明确在抗寒中起关键作用的COR基因,本实验以抗寒品种东农冬麦1号和不抗寒品种济麦22为材料,设定一系列低温处理,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析低温下Wrab17、Wcor80和Wcs120三个基因的表达差异。结果表明,在所有冷处理中,这三个基因在抗寒品种东农冬麦1号的相对表达量均比不抗寒品种济麦22高,上调表达时间更长,响应时间更短。处理组和对照组中也出现较大差异,在某些处理组中的相对表达量明显更高。其中冷驯化处理8~12h和冷冻处理4h时Wrab17在东农冬麦1号中分别上调表达11.2、14.7和26倍,同时期同处理的济麦22中此数值分别为2.7、6.2和4.3倍;冷冻处理6h时Wcor80在东农冬麦1号中上调表达6.5倍,在济麦22中则出现小幅下调;冷驯化处理1h后Wcs120在东农冬麦1号中上调8.7倍,在济麦22中未发现上调表达。 展开更多
关键词 小麦 低温驯化 QRT-PCR Wrab7 Wcor80 Wcs120
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木薯耐寒相关microRNA的差异表达分析 被引量:9
13
作者 薄维平 曾长英 +2 位作者 宋顺 周玉飞 王文泉 《热带作物学报》 CSCD 2010年第8期1260-1265,共6页
采用荧光实时定量PCR(quantitative Real Time-PCR,qRT-PCR)技术对低温胁迫处理及对照的两个木薯品种C4和KU50材料进行差异表达分析。结果表明,该6个miRNA在胁迫材料与对照中的表达不同,不同品种及器官中也存在差异表达,且6个miRNA属于... 采用荧光实时定量PCR(quantitative Real Time-PCR,qRT-PCR)技术对低温胁迫处理及对照的两个木薯品种C4和KU50材料进行差异表达分析。结果表明,该6个miRNA在胁迫材料与对照中的表达不同,不同品种及器官中也存在差异表达,且6个miRNA属于受低温诱导与上游调节基因相关的miRNA,这将成为今后研究的主要对象。 展开更多
关键词 miRNA 木薯 耐低温 QRT-PCR 差异表达
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黄瓜耐冷相关基因的表达分析 被引量:5
14
作者 董洪霞 沈镝 +1 位作者 李锡香 宋江萍 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期3446-3453,共8页
低温胁迫是影响黄瓜正常生长的主要障碍因子之一,其耐冷性强弱直接影响黄瓜产量。关于黄瓜耐冷性的鉴定及耐冷机制已有较多研究,鲜有耐冷基因的报道。为挖掘黄瓜耐冷基因,提高其耐冷性,本研究根据拟南芥及其他作物中已报道的耐冷基因并... 低温胁迫是影响黄瓜正常生长的主要障碍因子之一,其耐冷性强弱直接影响黄瓜产量。关于黄瓜耐冷性的鉴定及耐冷机制已有较多研究,鲜有耐冷基因的报道。为挖掘黄瓜耐冷基因,提高其耐冷性,本研究根据拟南芥及其他作物中已报道的耐冷基因并结合相关转录组信息,筛选出12个耐冷相关基因。并利用5份不同耐冷级别的黄瓜材料,对12个耐冷相关基因进行表达分析,进一步确定5个差异表达基因,明确5个基因在低温胁迫中的表达模式,为下一步对其进行功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 黄瓜 耐冷基因 RT-PCR 低温胁迫
原文传递
甘薯S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与表达 被引量:10
15
作者 岳昌武 何博文 +1 位作者 何明雄 张义正 《中国农学通报》 CSCD 2007年第6期121-125,共5页
从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次... 从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次获得全长1182bp的甘薯SAMS完全编码区,NCBI比对分析结果表明:该片段与不同种属植物sams基因的编码区序列的核苷酸相似性达85.48%,所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。根据核苷酸序列和氨基酸序列分别构建了SAMS系统进化树,从分子水平阐明了植物种属间的亲缘进化关系,为其种质资源利用提供理论依据。利用该序列与原核表达载体pET32a连接构建融合表达载体pET-SAMS,酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21,在不同温度下诱导3h后均表达出一63KDa大小融合蛋白。 展开更多
关键词 S-腺苷甲硫氨酸合成酶 冷胁迫 RT-PCR 序列分析 原核表达
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桃花芽自然休眠期间水孔蛋白基因的转录表达 被引量:3
16
作者 李玲 谭钺 +4 位作者 王慧 冷传远 李冬梅 陈修德 高东升 《应用生态学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期2855-2860,共6页
以10年生大田栽培及3年生盆栽曙光油桃花芽为试材,利用荧光定量PCR测定了油桃休眠及休眠解除期间(2009年9月15日—2010年1月15日)曙光油桃水孔蛋白基因δTIP1、PIP1;1的表达量,以及低温胁迫下的转录表达.结果表明:在油桃休眠及休眠解除... 以10年生大田栽培及3年生盆栽曙光油桃花芽为试材,利用荧光定量PCR测定了油桃休眠及休眠解除期间(2009年9月15日—2010年1月15日)曙光油桃水孔蛋白基因δTIP1、PIP1;1的表达量,以及低温胁迫下的转录表达.结果表明:在油桃休眠及休眠解除期间,曙光油桃PIP1;1的转录水平呈现持续增高趋势,且1月的高水平表达使水分通过液泡膜和细胞质膜流出,减少了芽体水分含量,阻止细胞内冰晶的形成,从而抵御冻害;可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量均达到最高,防止细胞的脱水伤害.低温处理2周后高水平表达说明PIP1;1为冷诱导基因.δTIP1的转录水平在休眠期间呈现波动性变化,至休眠解除时大幅度增高,这可能与休眠解除时,其上调表达被休眠解除信号及植物活性的增强所诱导有关.低温处理2周后,其表达没有升高,说明δTIP1并非冷诱导基因. 展开更多
关键词 水孔蛋白 桃花芽 休眠 荧光实时定量 PCR 冷诱导
原文传递
茶树冷诱导基因的AFLP筛选及其表达分析 被引量:11
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作者 陈林波 李叶云 +2 位作者 房超 朱政 江昌俊 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期1-7,共7页
以中小叶茶树良种舒茶早和云南大叶种73-11为材料,于4℃低温处理4 d后,采用AFLP技术筛选出冷诱导下茶树差异表达基因并进行分析.结果显示,实验共获得41个差异片段(TDFs),其中舒茶早产生19条差异条带,73-11产生38条差异条带,两品种共有条... 以中小叶茶树良种舒茶早和云南大叶种73-11为材料,于4℃低温处理4 d后,采用AFLP技术筛选出冷诱导下茶树差异表达基因并进行分析.结果显示,实验共获得41个差异片段(TDFs),其中舒茶早产生19条差异条带,73-11产生38条差异条带,两品种共有条带16条.所获得的差异片段按功能可划分为4类,即信号传导蛋白、转录因子、基础代谢相关蛋白、抗逆蛋白质,此外还有一些假设蛋白质以及未知蛋白.利用qRT-PCR对Kh1、Kh3和Kh11差异片段进行验证,结果显示这3个片段均被低温诱导,表达量上升.研究表明,茶树在低温胁迫下的逆境反应非常复杂,涉及多种代谢过程中的众多基因,而且大叶种比中小叶种对低温反应更为敏感. 展开更多
关键词 茶树 冷诱导 CDNA-AFLP QRT-PCR
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鲤鱼耐寒性状研究 被引量:19
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作者 常玉梅 孙效文 梁利群 《上海水产大学学报》 CSCD 2003年第2期102-105,共4页
用80个随机引物对黑龙江野鲤(耐寒)、柏氏鲤(不耐寒)和杂交F1(越冬成活)的群体混合DNA样品进行RAPD PCR扩增,结果引物S1043、S1052和S1066扩增出与抗寒性状相关的分子标记各一个。至此,共获得9个与鲤鱼抗寒性状相关的分子标记,进一步表... 用80个随机引物对黑龙江野鲤(耐寒)、柏氏鲤(不耐寒)和杂交F1(越冬成活)的群体混合DNA样品进行RAPD PCR扩增,结果引物S1043、S1052和S1066扩增出与抗寒性状相关的分子标记各一个。至此,共获得9个与鲤鱼抗寒性状相关的分子标记,进一步表明抗寒性是数量性状(QTL)受微效多基因控制。此外,就RAPD PCR实验中需要注意的问题如模板纯度、水的去离子和不同商标酶的活性等进行了简单的讨论;并对目前所应用的淡水鱼类抗寒基因工程研究策略及现状进行了简单概述。 展开更多
关键词 随机扩增多态性DNA—聚合酶链式反应 抗寒基因工程 抗冻蛋白 基因 性状 鲤鱼
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青海湖裸鲤实时荧光定量PCR内参基因筛选与验证 被引量:2
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作者 刘思嘉 祁得林 +4 位作者 祁洪芳 韩步鹰 牛依萌 赵凯 田菲 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期413-423,共11页
为探明青海湖裸鲤候选内参基因在低温环境下的表达稳定性,根据RNA-seq定量结果筛选表达稳定的候选内参基因,利用实时荧光定量PCR检测候选基因在0℃和17℃下,脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量,并通过GeNorm、Norm Finder和Best Keeper3种... 为探明青海湖裸鲤候选内参基因在低温环境下的表达稳定性,根据RNA-seq定量结果筛选表达稳定的候选内参基因,利用实时荧光定量PCR检测候选基因在0℃和17℃下,脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量,并通过GeNorm、Norm Finder和Best Keeper3种分析程序分析其表达稳定性,筛选出理想的内参基因。结果显示:根据RNA-seq定量结果,共筛选获得脱水酶(Abhd18)基因、微球蛋白(B2m)基因、延伸蛋白A(Eloa)基因、DAZ相关蛋白2(Dazap2)基因、肌动蛋白(Actb)基因、磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)基因、BCL细胞死亡激动因子(Bad)基因和脂肪酸结合蛋白3(Fabp3)基因等8个候选基因;对上述基因的表达稳定性进行分析,发现表达最稳定的是B2m和Eloa基因,表达最不稳定的是Fabp3基因;利用B2m和Eloa基因作为双内参基因对4个脂肪酸代谢相关基因在0℃和17℃脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量进行校正,其相对表达比值与RNA-seq结果高度正相关。研究结果可为高原鱼类极端环境适应的研究提供候选内参基因。 展开更多
关键词 青海湖裸鲤 低温适应 实时荧光定量PCR 内参基因
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肾上腺素对猪季节性基因表达的影响 被引量:3
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作者 刘宇 马红 +1 位作者 汪亮 刘娣 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期322-325,共4页
选用部分具有季节性表达的基因,探讨肾上腺素对这些基因mRNA表达量的影响。(1)将猪肾细胞(PK15)分别置于含有100,250,500,750,1 000 nmol/L肾上腺素的培养基中培养6 h,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ADRβ2、ARNTL、CLOCK、IL-6R、NR3C1... 选用部分具有季节性表达的基因,探讨肾上腺素对这些基因mRNA表达量的影响。(1)将猪肾细胞(PK15)分别置于含有100,250,500,750,1 000 nmol/L肾上腺素的培养基中培养6 h,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ADRβ2、ARNTL、CLOCK、IL-6R、NR3C1、VDR的mRNA表达量的变化。结果表明:1 000 nmol/L肾上腺素处理PK15细胞时,与对照组相比ADRβ2、IL-6R的mRNA表达量明显升高,差异极显著(P<0.01);VDR的mRNA表达量降低,差异极显著(P<0.01);CLOCK、NR3C1、ARNTL的mRNA表达量无明显变化。(2)选择1 000 nmol/L的肾上腺素分别处理PK15细胞6,12,24,36,48 h。qRT-PCR检测ADRβ2的mRNA表达量变化。结果表明:与对照组相比,培养12 h时ADRβ2的mRNA表达量达到1.6倍,差异极显著(P<0.01),随着培养时间延长,ADRβ2的mRNA表达量逐渐降低,36 h时降到最低,为对照组的0.4倍,差异显著(P<0.05)。这说明肾上腺素对部分季节周期性变化的基因具有调节作用,季节变化产生应激时可以通过肾上腺素影响ADRβ2、IL-6R、VDR的表达,从而影响机体功能。 展开更多
关键词 肾上腺素 季节性基因 实时荧光定量 冷应激
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