目的:探讨人染色质解旋酶DNA结合蛋白4(recombinant chromodomain helicase DNA binding protein 4,CHD4)基因表达对急性T细胞淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定。方法:使用siRNA-CHD4瞬时转染T淋巴细胞白血病细胞(Jurk...目的:探讨人染色质解旋酶DNA结合蛋白4(recombinant chromodomain helicase DNA binding protein 4,CHD4)基因表达对急性T细胞淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定。方法:使用siRNA-CHD4瞬时转染T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat)敲低CHD4基因表达,实时荧光定量q RT-PCR和Western blot检测细胞转染后CHD4表达量,流式细胞术测定细胞凋亡率及细胞周期变化;CCK-8分析测定CHD4基因对Jurkat细胞增殖的影响。根据生物信息学分析,以Jurkat细胞提取的全基因组DNA为模板,PCR扩增CHD4基因候选启动子区2 091 bp片段,以pGL3-Basic为载体,克隆含有CHD4基因候选启动子区的序列,制备重组质粒,并且构建一系列含CHD4基因候选启动子5′侧翼区截短序列质粒。将含CHD4启动子序列的质粒及截短序列质粒转染至Jurkat细胞和人胚胎肾T细胞(HEK293T),双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,确定CHD4基因启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析该区域转录因子结合位点,构建结合位点突变的质粒,通过双荧光素酶报告基因检测,分析结合位点对CHD4转录的影响。结果:流式细胞检测结果发现,与对照组比较,CHD4抑制Jurkat细胞凋亡,转染siRNA-CHD4的Jurkat细胞G0/G1期比例显著升高,而S期比例下降(P<0.01);CCK-8检测CHD4基因对Jurkat细胞的增殖有促进作用(P<0.05);成功构建含有CHD4基因候选启动子序列的质粒及其截短序列质粒,与pGL3-Basic空载体相比,含有CHD4基因候选启动子序列的质粒活性明显增加(P<0.05)。CHD4基因最小活性区域位于转录起始位点-233~-13 bp,其中包含NF-κB、MZF1等转录因子结合位点;NF-κB对CHD4启动子活性具有正向调控作用。结论:CHD4基因对Jurkat细胞凋亡有抑制作用,并且促进其增殖。CHD4最小活性区域位于转录起始位点-233~-13 bp,转录因子NF-κB对CHD4基因启动子活性具有正向调控作用。展开更多
