【目的】试验旨在探究CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)基因在如皋黄鸡中的生物学特征、组织表达水平,并构建其表达载体。【方法】对如皋黄鸡CEBPA基因CDS区进行克隆并测序,与其他物种进行相似性比...【目的】试验旨在探究CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)基因在如皋黄鸡中的生物学特征、组织表达水平,并构建其表达载体。【方法】对如皋黄鸡CEBPA基因CDS区进行克隆并测序,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建,通过生物信息学软件对如皋黄鸡CEBPA蛋白的理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、功能结构域、互作蛋白及二级结构、三级结构进行预测。利用实时荧光定量PCR技术检测CEBPA基因在如皋黄鸡心脏、肝脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、腺胃、肌肉、睾丸中的表达情况。构建CEBPA基因过表达(OE-CEBPA)和干扰载体(CEBPA-sh12,CEBPA-sh167,CEBPA-sh727),并检测各载体活性。【结果】如皋黄鸡CEBPA基因CDS区序列全长975 bp,共编码324个氨基酸。相似性比对结果显示,如皋黄鸡与日本鹌鹑、鸿雁、野鸽、野鸭的CEBPA氨基酸序列相似性均>94%,其中与日本鹌鹑的相似性最高,达99.4%;系统进化树结果表明,如皋黄鸡与日本鹌鹑的亲缘关系较近,与哺乳动物的亲缘关系较远。如皋黄鸡CEBPA蛋白为亲水不稳定蛋白,存在25个磷酸化位点,含9个N-糖基化位点和109个O-糖基化位点;CEBPA蛋白具有1个转录激活区和1个与DNA结合的亮氨酸拉链结构bZIP;如皋黄鸡CEBPA蛋白二级结构主要由193个无规则卷曲、93个α-螺旋、25个延伸链和13个β-转角组成,三级结构预测结果与二级结构基本一致;CEBPA蛋白主要与TRIB1、PPARG、RXRA、MAPK9、MAPK10、JUN、ESR1等蛋白互作。CEBPA基因在如皋黄鸡各组织中均有表达,其中以肝脏中表达量最高。成功构建CEBPA过表达载体和3个干扰载体,将它们分别转染至鸡成纤维细胞,与对照组相比,过表达组(OE-CEBPA)CEBPA基因表达量显著升高(P<0.05),干扰组(CEBPA-sh167)CEBPA基因表达量显著下降(P<0.05)。【结论】试验获得如皋黄鸡CEBPA基因完整CDS区并成功构建与筛选出具有过表达/干扰活性最佳的鸡CEBPA表达载体,该基因在如皋黄鸡各组织中广泛表达,其中以肝脏中相对表达量较高。结果为进一步研究鸡CEBPA的功能提供了参考依据。展开更多
文摘【目的】试验旨在探究CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)基因在如皋黄鸡中的生物学特征、组织表达水平,并构建其表达载体。【方法】对如皋黄鸡CEBPA基因CDS区进行克隆并测序,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建,通过生物信息学软件对如皋黄鸡CEBPA蛋白的理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、功能结构域、互作蛋白及二级结构、三级结构进行预测。利用实时荧光定量PCR技术检测CEBPA基因在如皋黄鸡心脏、肝脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、腺胃、肌肉、睾丸中的表达情况。构建CEBPA基因过表达(OE-CEBPA)和干扰载体(CEBPA-sh12,CEBPA-sh167,CEBPA-sh727),并检测各载体活性。【结果】如皋黄鸡CEBPA基因CDS区序列全长975 bp,共编码324个氨基酸。相似性比对结果显示,如皋黄鸡与日本鹌鹑、鸿雁、野鸽、野鸭的CEBPA氨基酸序列相似性均>94%,其中与日本鹌鹑的相似性最高,达99.4%;系统进化树结果表明,如皋黄鸡与日本鹌鹑的亲缘关系较近,与哺乳动物的亲缘关系较远。如皋黄鸡CEBPA蛋白为亲水不稳定蛋白,存在25个磷酸化位点,含9个N-糖基化位点和109个O-糖基化位点;CEBPA蛋白具有1个转录激活区和1个与DNA结合的亮氨酸拉链结构bZIP;如皋黄鸡CEBPA蛋白二级结构主要由193个无规则卷曲、93个α-螺旋、25个延伸链和13个β-转角组成,三级结构预测结果与二级结构基本一致;CEBPA蛋白主要与TRIB1、PPARG、RXRA、MAPK9、MAPK10、JUN、ESR1等蛋白互作。CEBPA基因在如皋黄鸡各组织中均有表达,其中以肝脏中表达量最高。成功构建CEBPA过表达载体和3个干扰载体,将它们分别转染至鸡成纤维细胞,与对照组相比,过表达组(OE-CEBPA)CEBPA基因表达量显著升高(P<0.05),干扰组(CEBPA-sh167)CEBPA基因表达量显著下降(P<0.05)。【结论】试验获得如皋黄鸡CEBPA基因完整CDS区并成功构建与筛选出具有过表达/干扰活性最佳的鸡CEBPA表达载体,该基因在如皋黄鸡各组织中广泛表达,其中以肝脏中相对表达量较高。结果为进一步研究鸡CEBPA的功能提供了参考依据。
