目的通过重叠延伸PCR技术构建CD74-ROS1-L1951R点突变质粒。方法根据CD74-ROS1融合基因序列和真核表达质粒p CM V-C-Flag上的多克隆位点设计引物,利用重叠延伸PCR技术对CD74-ROS1融合基因进行基因定点突变得到CD74-ROS1-L1951R点突变融...目的通过重叠延伸PCR技术构建CD74-ROS1-L1951R点突变质粒。方法根据CD74-ROS1融合基因序列和真核表达质粒p CM V-C-Flag上的多克隆位点设计引物,利用重叠延伸PCR技术对CD74-ROS1融合基因进行基因定点突变得到CD74-ROS1-L1951R点突变融合基因,随后将其酶切定向连入真核表达质粒p CMV-C-Flag启动子下游,构建p CMV-C-Flag-CD74-ROS1-L1951R重组质粒。重组质粒经菌落PCR、双酶切鉴定和测序,鉴定目的基因是否插入p CM V-CFlag质粒及定点突变是否成功。结果通过双酶切鉴定和测序结果显示,质粒的方向及序列正确,阅读框正确无误,表明CD74-ROS1-L1951R基因成功插入p CMV-C-Flag质粒,且CD74-ROS1-L1951R基因定点突变正确。结论成功构建了p CM V-C-Flag-CD74-ROS1-L1951R真核表达重组质粒,为研究CD74-ROS1点突变导致的耐药机制奠定了基础,可用于后续研究。展开更多
文摘目的通过重叠延伸PCR技术构建CD74-ROS1-L1951R点突变质粒。方法根据CD74-ROS1融合基因序列和真核表达质粒p CM V-C-Flag上的多克隆位点设计引物,利用重叠延伸PCR技术对CD74-ROS1融合基因进行基因定点突变得到CD74-ROS1-L1951R点突变融合基因,随后将其酶切定向连入真核表达质粒p CMV-C-Flag启动子下游,构建p CMV-C-Flag-CD74-ROS1-L1951R重组质粒。重组质粒经菌落PCR、双酶切鉴定和测序,鉴定目的基因是否插入p CM V-CFlag质粒及定点突变是否成功。结果通过双酶切鉴定和测序结果显示,质粒的方向及序列正确,阅读框正确无误,表明CD74-ROS1-L1951R基因成功插入p CMV-C-Flag质粒,且CD74-ROS1-L1951R基因定点突变正确。结论成功构建了p CM V-C-Flag-CD74-ROS1-L1951R真核表达重组质粒,为研究CD74-ROS1点突变导致的耐药机制奠定了基础,可用于后续研究。
