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湖南金丝皇菊花叶病害病原物鉴定
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作者 侯嘉怡 李灵 +4 位作者 陈雪峰 吴柏顺 向理理 于晓英 许璐 《湖南农业科学》 2025年第6期90-95,共6页
为明确引发湖南地区金丝皇菊(Chrysanthemum morifolium'Jinsi Huangju')典型花叶病害的病原物种类,研究以湖南洪慈菊花种植基地内出现花叶症状的金丝皇菊植株病叶为试验样本,通过RT-PCR扩增测序、负染色电镜观察法和酶联免疫... 为明确引发湖南地区金丝皇菊(Chrysanthemum morifolium'Jinsi Huangju')典型花叶病害的病原物种类,研究以湖南洪慈菊花种植基地内出现花叶症状的金丝皇菊植株病叶为试验样本,通过RT-PCR扩增测序、负染色电镜观察法和酶联免疫吸附法,从核酸序列、形态结构及蛋白质特异性3个维度明确导致金丝皇菊花叶病害的病原物种类。结果表明:通过RTPCR从病叶样本中扩增到2条目的条带,分别与菊花褪绿斑驳类病毒(CChMVd)和菊花B病毒(CVB)的目的基因片段长度相近;经酶联免疫吸附法检测确定病叶样本中含有CVB的特异性蛋白;病叶样本制备的悬浮液经负染色电镜观察发现了两种形态的病原组分,分别与CChMVd和CVB形态结构相似;系统发育树显示,湖南病叶样本分离物(类病毒)与西班牙发现的4个参考分离物(CChMVd,FJ647546.1等)聚在同一分支,序列相似度为87%;湖南病叶样本分离物(病毒)与南京分离物(CVB,JQ904595.1)同属一个分支,高度同源(100%)。综上,引发当地金丝皇菊叶片呈现典型花叶症状的病原物为CChMVd和CVB,这两种病原物的复合侵染导致了花叶病害的发生。 展开更多
关键词 金丝皇菊 病毒鉴定 cchmvd CVB RT-PCR
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3种菊花病毒/类病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的构建与准确性评价 被引量：4
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作者 姜自红 殷培峰 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期169-180,共12页
菊花容易受到病毒感染而造成品质下降,目前国内对菊花病毒的检测主要根据外观表现或者定性PCR检测,无法准确判定病毒载量。为构建一种可同时用于检测菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)和... 菊花容易受到病毒感染而造成品质下降,目前国内对菊花病毒的检测主要根据外观表现或者定性PCR检测,无法准确判定病毒载量。为构建一种可同时用于检测菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)和菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chloritic mottle viroid,CChMVd)的实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究分别以保守区域作为靶标设计相应的引物探针,通过优化扩增体系中CVB、TAV、CChMVd 3种病毒/类病毒探针浓度、引物浓度、Mg^(2+)浓度、dNTPs浓度,摸索扩增程序中反转录时间、退火温度和扩增循环数,构建了一种可同时用于CVB、TAV、CChMVd的3重实时荧光定量RT-PCR检测体系,优化后的扩扩增体系中CVB、TAV和CChMVd的探针浓度分别为100 nmol/L、120 nmol/L和80 nmol/L,引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和160 nmol/L,Mg^(2+)浓度为3.0 mmol/L;dNTPs浓度200μmol/L;最适反转录时间为25 min,退火温度为60℃,循环数为40。敏感性实验结果表明,该反应体系对3种病毒/类病毒的敏感性为1.0×^(10)3拷贝/mL,敏感性好;定量线性范围为1.0×^(10)3拷贝/mL~1.0×^(10)10拷贝/mL,线性范围宽;特异性好,对菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒核酸检测结果为阴性;对1.0×^(10)4拷贝/mL的低浓度参考品平行检测10次,定量结果lg值偏差(CV%)为4.81%,重复性好。在南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"基地随机选择菊花20株进行本研究试剂检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,其病毒载量为2.5×^(10)4拷贝/mL~5.5×^(10)7拷贝/mL,随机选择1株CVB病毒株定量PCR,产物进行TA克隆后经测序与NCBI Blast比对,其与MH678704.1的同源性为100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB、TAV、CChMVd 3种菊花常见病毒/类病毒的灵敏、快速、可定量的检测方法。 展开更多
关键词 菊花B病毒(CVB) 番茄不孕病毒(TAV) 菊花褪绿斑驳类病毒(cchmvd) 实时荧光定量RT-PCR
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