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外泌体递送CRISPR/Cas系统在靶细胞内可实现基因编辑
1
作者 王白燕 杨树 +5 位作者 王弋鸣 吴梦晴 肖瑀 郭梓璇 张博艺 冯书营 《中国组织工程研究》 北大核心 2026年第7期1839-1849,共11页
背景:CRISPR/Cas基因编辑系统具有精准基因编辑、靶向设计简单、低成本以及高效率等特性,已被广泛应用于科学研究和相关临床治疗。然而,CRISPR/Cas系统如何更安全、更高效、更精准地递送到靶细胞内,仍是一个急需解决的难题。目的:从递送... 背景:CRISPR/Cas基因编辑系统具有精准基因编辑、靶向设计简单、低成本以及高效率等特性,已被广泛应用于科学研究和相关临床治疗。然而,CRISPR/Cas系统如何更安全、更高效、更精准地递送到靶细胞内,仍是一个急需解决的难题。目的:从递送CRISPR/Cas系统的外泌体来源及工程化策略、外泌体对CRISPR/Cas系统的装载方法、CRISPR/Cas系统的生物形式及其在细胞内的作用途径等方面进行全方面综述,为该领域的研究者提供更直观、更系统的视角。方法:以“exosome,drug delivery systems,delivery,CRISPR/Cas,gene editing,engineered exosomes,targeting”为英文检索词,以“外泌体,药物递送,CRISPR/Cas,工程化”为中文检索词,分别检索Pub Med数据库及中国知网,检索时限为2014-2024年。通过仔细阅读文献的标题和摘要进行初步筛选,排除研究内容相关性差及内容重复的文献,最终纳入了78篇文献进行归纳和探讨。结果与结论:(1)外泌体是一种直径30-150 nm的脂质囊泡,具有循环半衰期长、靶向组织的内在能力、良好的生物相容性以及较小的固有毒性等优势,显现出强大的靶向递送能力;(2)CRISPR/Cas系统虽是一种强大的基因编辑工具,然而现有的CRISPR/Cas系统递送载体各有利弊,无法完全满足需求;(3)递送CRISPR/Cas系统的外泌体主要来源于高产外泌体的细胞或组织,但研究者们依然需要根据研究所需进行选择或进一步工程化;(4)递送CRISPR/Cas系统的外泌体主要通过基因工程修饰、化学修饰、外泌体-脂质体杂交等策略实现工程化;(5)外泌体装载CRISPR/Cas系统的方法包括电穿孔、孵育、转染和主动装载途径等,选择合适的装载方法取决于CRISPR/Cas系统的理化性质;(6)外泌体递送CRISPR/Cas系统的生物形式包括质粒和核糖核蛋白复合体,两种形式各具特点,成功递送的CRISPR/Cas系统在靶细胞内实现基因编辑。 展开更多
关键词 外泌体 CRISPR/cas系统 基因编辑 药物负载 靶向递送 工程化
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基于CRISPR/Cas9技术构建猪GRSF1基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析
2
作者 杜鹏飞 彭听雨 +3 位作者 范双旗 郑海学 朱紫祥 陈金顶 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第2期161-167,共7页
利用CRISPR/Cas9技术构建鸟嘌呤富含序列因子1(GRSF1)基因敲除的PK-15细胞并探究GRSF1基因敲除对于细胞活性的影响。首先,设计了4条靶向猪源GRSF1基因的sgRNAs(sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3和sgRNA-4),经退火后与慢病毒载体质粒(Lenti-CRI... 利用CRISPR/Cas9技术构建鸟嘌呤富含序列因子1(GRSF1)基因敲除的PK-15细胞并探究GRSF1基因敲除对于细胞活性的影响。首先,设计了4条靶向猪源GRSF1基因的sgRNAs(sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3和sgRNA-4),经退火后与慢病毒载体质粒(Lenti-CRISPR v2)连接。随后将构建成功的慢病毒载体与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染人胚胎肾细胞(HEK-293T),获得慢病毒并感染PK-15细胞。最终经嘌呤霉素筛选和梯度稀释法获得GRSF1敲除的PK-15单克隆细胞系。通过Western-blot及测序验证GRSF1的敲除效率,然后进行单克隆细胞活性检测及IL-6水平检测。结果表明,本研究成功获得3株GRSF1基因敲除成功的PK-15单克隆细胞系,并证实GRSF1基因敲除影响PK-15细胞中IL-6表达的上调,为后续研究猪GRSF1的生物学功能提供细胞模型。 展开更多
关键词 GRSF1 PK-15 CRISPR/cas9 基因敲除
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利用CRISPR/Cas9技术创制糯稻新种质
3
作者 潘月云 黄雨青 +3 位作者 丁正权 施扬 黄海祥 李白 《浙江农业学报》 北大核心 2026年第1期17-23,共7页
稻米直链淀粉含量直接影响其蒸煮食味品质,该性状主要由Waxy(Wx)基因控制。本研究基于Wx基因上SNP的表型关联分析,选择其第3、第4外显子设计编辑靶点。利用CRISPR/Cas9技术,以水稻品种嘉禾香1号为受体,对Wx基因进行编辑。经PCR与Sanger... 稻米直链淀粉含量直接影响其蒸煮食味品质,该性状主要由Waxy(Wx)基因控制。本研究基于Wx基因上SNP的表型关联分析,选择其第3、第4外显子设计编辑靶点。利用CRISPR/Cas9技术,以水稻品种嘉禾香1号为受体,对Wx基因进行编辑。经PCR与Sanger测序验证,获得4个不同类型的双位点纯合突变体。4个双位点纯合T 2代突变体株系的稻米均呈蜡质状,其直链淀粉含量由野生型的16.9%降至0.83%~1.23%,达到糯稻水平。结果表明,利用CRISPR/Cas9技术可快速创制优质香糯型水稻种质资源。 展开更多
关键词 水稻 WX基因 CRISPR/cas9 直链淀粉
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类食品乳杆菌LBM 12001基于CRISPR/Cas9技术多基因编辑平台的构建
4
作者 黄宗潇 侯倩 +2 位作者 徐岩 黄卫宁 穆晓清 《食品与发酵工业》 北大核心 2026年第3期11-19,共9页
作为传统发酵食品的核心功能菌株,类食品乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)的代谢调控网络解析常受限于低效的遗传操作体系。该研究旨在开发一种高效、无痕的CRISPR/Cas9基因编辑平台,以解决类食品乳杆菌多基因编辑的技术瓶颈。通... 作为传统发酵食品的核心功能菌株,类食品乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)的代谢调控网络解析常受限于低效的遗传操作体系。该研究旨在开发一种高效、无痕的CRISPR/Cas9基因编辑平台,以解决类食品乳杆菌多基因编辑的技术瓶颈。通过优化质粒大小以及引入λ-Red重组酶辅助同源重组,构建了双质粒系统(pCRI01/pCRI02)。实验结果表明,该系统显著提升了转化效率[单基因敲除转化子达(63±11)个,阳性突变率75%],并实现了三基因同步敲除[转化子(57±8)个,突变率(46±7)%]。创新性整合BioBricks模块化组装、温度敏感型复制子及自靶向诱导型sgRNA技术,使多基因编辑周期缩短40%以上。该体系突破了传统方法的效率限制,成功实现多基因无痕编辑,为构建类食品乳杆菌高效细胞工厂提供了关键性技术支撑。 展开更多
关键词 类食品乳杆菌 CRISPR/cas9 多基因编辑 λ-Red重组酶 BioBricks组装
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CRISPR-Cas系统的小型化研究进展 被引量：1
5
作者 董颖 马孟丹 黄卫人 《合成生物学》 北大核心 2025年第1期105-117,共13页
CRISPR-Cas基因编辑技术由于其简便性和高效性,已被广泛应用于生物学、医学、农学等领域的基础与应用研究。目前广泛使用的Cas核酸酶均具有较大的分子量(通常大于1000个氨基酸),而广泛应用于基因治疗中的腺相关病毒(AAV)载体的承载容量... CRISPR-Cas基因编辑技术由于其简便性和高效性,已被广泛应用于生物学、医学、农学等领域的基础与应用研究。目前广泛使用的Cas核酸酶均具有较大的分子量(通常大于1000个氨基酸),而广泛应用于基因治疗中的腺相关病毒(AAV)载体的承载容量却十分有限,在容纳CRISPR核酸酶与gRNA的编码序列之余往往难以承载更多其他功能元件,如碱基编辑、转录调控、多基因编辑等相应元件,这严重限制了其在基因治疗等领域的应用。使用紧凑型Cas蛋白变体的CRISPR-Cas系统可能有助于用AAV产生和传递基因组编辑和调节工具到人类细胞。因此,小型化的CRISPR-Cas系统开发是解决这一技术难题的重要途径,本文主要概括了基于Cas9、Cas12和Cas13蛋白系统在小型化方面的研究进展,包括筛选新型Cas蛋白、缩减蛋白结构域以及引导RNA的改造等,旨在为开发微型精准基因编辑和调控工具提供新思路。目前小型化的CRISPR-Cas系统的局限性主要体现在蛋白分子量的大小和基因编辑的效率、特异性不可兼得上,在未来的研究中若能解决这一问题,获得更小型化的结构域,相信不仅能够优化该系统在体内的传递,更有望为临床带来高效率且低损害的治疗方法。 展开更多
关键词 CRISPR-cas系统 小型化cas蛋白 cas蛋白工程化改造 紧凑型cas蛋白 基因调控工具
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基于环介导等温扩增和CRISPR/Cas系统的转基因玉米和大豆快速准确现场检测
6
作者 朱媛媛 杨天怡 +9 位作者 杜俊刚 马斯韩 陈艳菊 刘海荣 叶合肥 严忠军 黄之斌 虞子锋 杨群清 吴坚 《食品科学》 北大核心 2026年第2期21-29,共9页
为应对基于核酸扩增的分子生物学检测转基因粮食方法所面临操作复杂、检测时间长和设备昂贵等挑战,本研究以玉米和大豆为主要研究对象,研发了一种高效快速、无需纯化或稀释的核酸提取方法。同时筛选了高效、特异的转基因标签引物,建立... 为应对基于核酸扩增的分子生物学检测转基因粮食方法所面临操作复杂、检测时间长和设备昂贵等挑战,本研究以玉米和大豆为主要研究对象,研发了一种高效快速、无需纯化或稀释的核酸提取方法。同时筛选了高效、特异的转基因标签引物,建立了针对转基因玉米和大豆的转基因快速环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)体系和防污染体系。此外,建立了一种基于规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)系统的可视化快速检测方法。该检测方法可在45 min内完成转基因检测,对转基因大豆和玉米的代表性转基因成分检测限达0.1%。该方法可实现转基因粮食的快速精准检测,有助于提高粮食监管水平,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 转基因粮食 核酸提取 现场检测 环介导等温扩增 CRISPR/cas系统
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基于CRISPR/Cas9技术靶向突变番茄WRKY3基因
7
作者 宋茜茜 刘周圆 唐晓凤 《合肥工业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2026年第1期73-79,共7页
WRKY转录因子在植物生长发育、次生代谢产物合成以及对生物和非生物胁迫的响应等方面发挥重要作用。为探究WRKY3在植株逆境应答中的功能及作用机制,文章通过生物信息法对不同物种WRKY3的结构域及进化树进行分析,发现WRKY3具有较高的保守... WRKY转录因子在植物生长发育、次生代谢产物合成以及对生物和非生物胁迫的响应等方面发挥重要作用。为探究WRKY3在植株逆境应答中的功能及作用机制,文章通过生物信息法对不同物种WRKY3的结构域及进化树进行分析,发现WRKY3具有较高的保守性;TomExpress数据库显示WRKY3在各种组织中均有表达,且在红果期果实中表达量最高;并构建WRKY3基因的CRISPR敲除载体,利用农杆菌介导法转化番茄获得WRKY3基因的转基因番茄材料,经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及测序鉴定发现,已成功获得敲除WRKY3基因的转基因番茄植株。该研究获得了番茄WRKY3基因敲除突变体稳定遗传株系,为探究WRKY3在逆境胁迫下植物的生长发育及果实成熟中所发挥的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 番茄 WRKY3基因 基因编辑 CRISPR/cas9技术 载体构建
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鲍曼不动杆菌CRP蛋白通过调控cas3基因表达增强细菌毒力的机制
8
作者 黄佳媛 黄心悦 +5 位作者 於亭 袁文杰 陈平 胡健 谢军 李国才 《微生物学报》 北大核心 2026年第2期867-880,共14页
【目的】探究鲍曼不动杆菌转录调控因子cAMP受体结合蛋白(cAMP receptor protein,CRP)对cas3基因的功能调控作用。【方法】利用原核表达系统表达并纯化CRP蛋白,采用电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)实验... 【目的】探究鲍曼不动杆菌转录调控因子cAMP受体结合蛋白(cAMP receptor protein,CRP)对cas3基因的功能调控作用。【方法】利用原核表达系统表达并纯化CRP蛋白,采用电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)实验探究CRP对cas3启动子的结合作用,并通过q PCR明确CRP对cas3基因的调控作用。为进一步确认CRP对cas3的功能调控作用,构建Δcrp突变株,通过生物被膜实验、黏附侵袭实验、大蜡螟毒力实验以及小鼠细菌感染模型分析crp对鲍曼不动杆菌毒力的影响。【结果】EMSA实验表明CRP蛋白可与cas3基因启动子特异性结合;qPCR结果表明,Δcrp突变株cas3转录水平显著下降(P<0.001)。与野生株相比,Δcrp突变株在生长能力方面无明显差异,但生物被膜形成能力显著增强(P<0.001),对A549细胞的黏附(P=0.003<0.050)和侵袭(P<0.001)能力也明显增强。Δcrp突变株在72 h内对大蜡螟的致死率显著提高,且小鼠感染实验结果表明,Δcrp突变株在肺部的定殖能力显著高于野生株(P<0.001)。【结论】CRP作为一种转录激活因子,可直接结合cas3启动子并激活其转录表达,进而降低鲍曼不动杆菌的毒力和致病性。 展开更多
关键词 鲍曼不动杆菌 cAMP受体结合蛋白 cas3 毒力
原文传递
基于CAS视角的北京超大城市治理体系及复杂适应性初探——以北京市接诉即办机制为个案
9
作者 林琳 闵贵植 《河北青年管理干部学院学报》 2026年第1期48-57,共10页
超大城市治理是国家治理体系现代化的重要场域之一。基于北京市接诉即办机制的超大城市治理实践,凸显出典型的复杂适应系统(CAS)特征。在治理链条的延伸上,“诉求吸纳”“治理回应”与“体系适应”构成三个相对独立且相互衔接的演化端口... 超大城市治理是国家治理体系现代化的重要场域之一。基于北京市接诉即办机制的超大城市治理实践,凸显出典型的复杂适应系统(CAS)特征。在治理链条的延伸上,“诉求吸纳”“治理回应”与“体系适应”构成三个相对独立且相互衔接的演化端口,共同揭示出治理过程中的复杂适应逻辑。其中,治理子系统对市民诉求的常态化回应与治理系统在整体结构、系统规则层面的适应性调整,生成功能有别的两级“三端”适应机制;该适应机制彰显出超大城市治理体系所具备的多层级、动态演化的复杂适应特性。基于CAS优化视角,超大城市治理需从构建城市治理闭环、强化数字赋能、推动治理主体跨层级学习适应等入手,整体提升超大城市的治理韧性与发展能力。 展开更多
关键词 超大城市治理 cas 接诉即办 治理回应 体系适应
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《口腔颌面修复学杂志》被化学文摘社(CAS)数据库收录
10
作者 《口腔颌面修复学杂志》编辑部 《口腔颌面修复学杂志》 2026年第1期16-16,共1页
《口腔颌面修复学杂志》为中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊)。近日,本刊收到来自化学文摘社(Chemical Abstracts Srvicee,CAS)数据库的通知,经过严格评审,《口腔颌面修复学杂志》已被CAS数据库正式收录!本刊作为国内目前唯一... 《口腔颌面修复学杂志》为中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊)。近日,本刊收到来自化学文摘社(Chemical Abstracts Srvicee,CAS)数据库的通知,经过严格评审,《口腔颌面修复学杂志》已被CAS数据库正式收录!本刊作为国内目前唯一关于口腔修复学的专业杂志,学术质量和传播价值得到了国际上的高度认可。CAS是美国化学会旗下分支机构,建立了全球权威的人工标引科学数据合集。 展开更多
关键词 口腔颌面修复学杂志 化学文摘社 cas
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CRISPR/Cas系统在寄生虫病诊断领域的研究进展 被引量：1
11
作者 刘浩 张昊 +2 位作者 张艳敏 张丽丽 王文龙 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第6期2809-2817,共9页
多年来动物寄生虫病主要依靠传统镜检与PCR技术结合的方式进行诊断,在临床中确实起到了明显的防治效果,也控制了一些寄生虫病的流行。但寄生虫病多是慢性消耗性疾病,早期诊断尤为重要,而传统方法的灵敏度、简便性不能满足彻底控制寄生... 多年来动物寄生虫病主要依靠传统镜检与PCR技术结合的方式进行诊断,在临床中确实起到了明显的防治效果,也控制了一些寄生虫病的流行。但寄生虫病多是慢性消耗性疾病,早期诊断尤为重要,而传统方法的灵敏度、简便性不能满足彻底控制寄生虫病的需求。因此,亟需灵敏度更高、便捷性更强的检测方法。近年来,CRISPR/Cas系统不断发展,已发现了多种Cas蛋白的功能,并广泛应用于寄生虫病原的核酸检测。研究人员针对第2类CRISPR/Cas系统中的Cas13与Cas12蛋白与重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)或PCR联用,筛选特异性靶标序列并设计crRNA,之后与Cas12、Cas13蛋白和荧光报告基团组成CRISPR/Cas核酸检测系统,可用于多种寄生虫病的诊断,具有快速、精准、便捷和廉价等特点,适用于现场检测,具有巨大的市场应用潜力。笔者就CRISPR/Cas系统的作用机制和分类,以及近年来其在寄生虫病核酸检测领域的研究进展进行综述,以期为寄生虫病的早期诊断提供参考依据。 展开更多
关键词 CRISPR/cas系统 cas13 cas12 crRNA 核酸检测
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新质生产力发展视阈下的会计盈余披露改进研究——基于CAS盈余与Non-CAS盈余功用的实证检验
12
作者 王霞 李泰珉 吴佳琪 《上海财经大学学报(哲学社会科学版)》 北大核心 2025年第2期50-63,共14页
新质生产力是当下我国经济高质量发展的重要动力。会计盈余信息作为利益相关者进行判断和决策的依据,是促进要素有序流动、引导资源高效配置的重要手段,充分有效的会计盈余信息披露对于发展新质生产力至关重要。但是,随着企业在科技创... 新质生产力是当下我国经济高质量发展的重要动力。会计盈余信息作为利益相关者进行判断和决策的依据,是促进要素有序流动、引导资源高效配置的重要手段,充分有效的会计盈余信息披露对于发展新质生产力至关重要。但是,随着企业在科技创新推动下不断发展新业态、新产业,传统的会计准则已经滞后于复杂的经济形势。文章通过实证研究发现,现行会计准则下的盈余(CAS盈余)无法包含新质生产力发展程度高的企业未来业绩改善的信息增量,其持续性和预测性下降。文章在CAS盈余的基础上,对企业发展新质生产力投入的临时性项目进行调整,设计了Non-CAS盈余。检验发现,对于新质生产力发展水平较高的企业,Non-CAS盈余具有更好的持续性和预测性。上述影响对创业板、科创板等非主板市场企业更为明显。在股票定价方面,Non-CAS盈余同样发挥了定价作用。因此,有必要改进现行的会计盈余披露制度,允许上市企业自愿披露Non-CAS盈余,以满足会计信息更好地服务大力发展新质生产力的时代要求。 展开更多
关键词 新质生产力 cas盈余 Non-cas盈余 盈余持续性 盈余预测性
原文传递
Cas9和PE介导湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因敲除的研究 被引量：5
13
作者 周磊 李东旭 +3 位作者 冒魏佳 刘孜斐 高雪 万永杰 《南京农业大学学报》 北大核心 2025年第2期419-426,共8页
[目的]本文利用CRISPR/Cas9系统和先导编辑(prime editor, PE)对湖羊骨骼肌卫星细胞中的肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因外显子进行敲除,旨在比较2种技术敲除MSTN基因的效率,以验证新型基因编辑工具PE用于湖羊骨骼肌卫星细胞上的可... [目的]本文利用CRISPR/Cas9系统和先导编辑(prime editor, PE)对湖羊骨骼肌卫星细胞中的肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因外显子进行敲除,旨在比较2种技术敲除MSTN基因的效率,以验证新型基因编辑工具PE用于湖羊骨骼肌卫星细胞上的可行性。[方法]针对湖羊MSTN基因的3个外显子分别设计向导RNA(single guide RNA,sgRNA)以及引导RNA(prime editing guide RNA,pegRNA),构建相应的质粒后将含有Cas9/sgRNA或PE/pegRNA的质粒共同转染湖羊骨骼肌卫星细胞。24 h后观察细胞荧光,48 h后再将细胞消化,使用流式细胞分选仪根据荧光强度筛选出转染成功的强阳性细胞,收集细胞,获得基因组DNA后进行桑格测序,检测2种基因编辑工具对MSTN基因的打靶效率。[结果]成功构建了分别针对湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因3个外显子敲除的基因编辑工具,质粒测序结果显示序列插入正确;CRISPR/Cas9的编辑效率(65%、88%、91%)显著高于PE的编辑效率(57%、29%、33%),而PE的插入缺失率显著低于CRISPR/Cas9。[结论]在转染效率相近的情况下,CRISPR/Cas9相比于PE对于湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因的敲除有更高的编辑效率。 展开更多
关键词 基因编辑 CRISPR/cas9 先导编辑(PE) MSTN 湖羊 骨骼肌卫星细胞
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基于RPA-CRISPR/Cas12a的沙氏弧菌可视化检测方法的建立 被引量：1
14
作者 葛辉 巫旗生 +8 位作者 宁岳 冯君雅 陈昊翔 李慧耀 叶军 吴丽云 温凭 徐春燕 任磊 《水产学报》 北大核心 2025年第11期203-215,共13页
【目的】建立基于RPA-CRISPR/Cas12a的沙氏弧菌实时荧光检测法和试纸条检测法,满足牡蛎新发病原沙氏弧菌的快速检测需求。【方法】实验针对沙氏弧菌toxR基因设计特异性片段,优选RPA引物和crRNA序列,确保基因标志物的准确扩增与识别;当CR... 【目的】建立基于RPA-CRISPR/Cas12a的沙氏弧菌实时荧光检测法和试纸条检测法,满足牡蛎新发病原沙氏弧菌的快速检测需求。【方法】实验针对沙氏弧菌toxR基因设计特异性片段,优选RPA引物和crRNA序列,确保基因标志物的准确扩增与识别;当CRISPR/Cas12a系统识别到RPA扩增的病原靶标基因并激活其反式切割活性后,生物素修饰的单链DNA荧光探针作为报告分子被切割,分别依据蓝光下的荧光强度和试纸条的显色情况判定检测结果;实验采用多种弧菌验证检测方法的特异性,并通过不同浓度沙氏弧菌菌液评估2种检测方法的灵敏度;最终将2种检测方法与PCR方法进行真实样本检测对比。【结果】本研究成功建立了RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测法和试纸检测法,且均表现出优异的特异性,可准确识别沙氏弧菌,整个检测流程可在1 h内完成;2种方法的检测限均达到100 CFU/mL,检测结果与PCR高度一致(符合率100%)。【结论】本研究开发的基于RPA-CRISPR/Cas12a的荧光检测法和试纸检测法,突破了传统方法的局限,显著缩短检测时间,且无需复杂仪器,操作简便,为沙氏弧菌的现场快速检测提供了可靠的技术支持。本研究为沙氏弧菌的快速检测提供了高效、便捷的新方法,对水产养殖病害防控和食品安全保障具有重要意义。 展开更多
关键词 沙氏弧菌 重组酶聚合酶扩增(RPA) CRISPR/cas12a 荧光检测 试纸检测
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利用CRISPR/Cas9编辑草莓FvPDS基因的研究
15
作者 刘丽锋 宋艳红 +2 位作者 赵霞 李刚 周厚成 《园艺学报》 北大核心 2025年第7期1687-1695,共9页
八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素生物合成的关键酶,其编码的PDS基因参与并调控植物类胡萝卜素的累积,PDS基因突变会使植物产生肉眼可见的白化表型,常用来作为检测基因编辑成功与否的标记基因。选取森林草莓Fv... 八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素生物合成的关键酶,其编码的PDS基因参与并调控植物类胡萝卜素的累积,PDS基因突变会使植物产生肉眼可见的白化表型,常用来作为检测基因编辑成功与否的标记基因。选取森林草莓FvPDS基因作为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建双靶点基因编辑载体,农杆菌介导法稳定遗传转化森林草莓种质HLJ-005(红果)、HLJ-004(白果),通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。遗传转化HLJ-005约2250块叶片外植体,筛选到具有卡那霉素抗性的植株147株,通过PCR鉴定,24株为阳性材料,阳性率为16.32%,最后测序获得了5株具有编辑的材料,编辑效率为20.83%;遗传转化HLJ-004约2305块叶片外植体,获得具有卡那霉素抗性的植株234株,PCR检测为6株阳性材料,阳性率为2.56%,测序只有3株为具有编辑的材料,编辑效率为50%。两个编辑位点都产生了突变,分别是单碱基或多个碱基的缺失,但是这两份种质的突变类型不尽相同。结果表明,利用CRISPR/Cas9系统可以通过稳定表达,HLJ-004、HLJ-005两个森林草莓实现双靶点同时敲除,HLJ-004、HLJ-005可作为草莓基因编辑的遗传转化材料,并验证了适合草莓基因编辑的CRISPR/Cas9系统。 展开更多
关键词 草莓 CRISPR/cas9 FvPDS 基因编辑
原文传递
EuCAD基因CRISPR/Cas9敲除载体构建及基因编辑效果验证
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作者 陈博雯 肖玉菲 +4 位作者 李军集 钟连香 魏秋兰 覃子海 刘海龙 《分子植物育种》 北大核心 2025年第7期2226-2231,共6页
为了对尾叶桉(Eucalyptus urophylla)木质素合成关键基因开展基因编辑研究,本研究构建了Eu-CAD基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。对EuCAD基因序列进行分析,设计两条位于外显子的靶位点序列,使... 为了对尾叶桉(Eucalyptus urophylla)木质素合成关键基因开展基因编辑研究,本研究构建了Eu-CAD基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。对EuCAD基因序列进行分析,设计两条位于外显子的靶位点序列,使用Golden Gate技术构建得到基因编辑载体pRGEB35-CAD。以尾叶桉继代苗茎尖为材料建立原生质体转化体系,用pGFP质粒进行转化,依据GFP荧光激发结果统计体系的转化率为2.47%。将pRGEB35-CAD转化至原生质体,PCR鉴定显示在原生质体中EuCAD发生了预期的基因编辑,pRGEB35-CAD取得了预期基因编辑效果。本研究构建的EuCAD基因CRISPR/Cas9敲除载体可对目标基因进行基因编辑,为进一步创制EuCAD敲除突变体奠定了研究基础。 展开更多
关键词 CRISPR/cas9敲除载体 原生质体转化 CAD基因 尾叶桉
原文传递
应用CRISPR/Cas9技术对五指山猪GHRHR基因的编辑
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作者 王文涛 张思佳 +9 位作者 何鑫淼 陈诗怡 吴赛辉 张冬杰 陈瑶生 丛佩清 亓美玉 田明 刘娣 何祖勇 《东北农业大学学报》 北大核心 2025年第2期44-52,共9页
生长激素释放激素受体(GHRHR)表达于垂体细胞表面,调节垂体生长激素合成与分泌,对动物生长发育发挥重要调控作用。为深入了解GHRHR对五指山猪生长发育的影响,通过CRISPR-ctRNP体外酶切试验,筛选出切割效率达27.3%的1条gRNA用于构建CRISP... 生长激素释放激素受体(GHRHR)表达于垂体细胞表面,调节垂体生长激素合成与分泌,对动物生长发育发挥重要调控作用。为深入了解GHRHR对五指山猪生长发育的影响,通过CRISPR-ctRNP体外酶切试验,筛选出切割效率达27.3%的1条gRNA用于构建CRISPR/Cas9表达载体。转染五指山猪肾细胞后,经流式分选富集到编辑效率高达100%的细胞群体作为供体细胞,进行体细胞核移植;再将250枚克隆胚胎转移至5头代孕母猪输卵管中,最终1头代孕母猪成功妊娠,分娩3头克隆仔猪均为GHRHR双等位基因编辑个体;编辑均导致GHRHR基因产生移码突变,可导致蛋白翻译提前终止,丧失生物学功能。最终仅有1头GHRHR编辑五指山猪存活,该个体60日龄时,体质量较野生型个体平均体质量下降23.4%。研究结果在五指山猪中实现GHRHR基因高效编辑,为培养微型宠物猪及解析GHRHR的调控功能提供理论依据。 展开更多
关键词 五指山猪 生长激素释放激素受体 基因编辑猪 CRISPR/cas9
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基于RTCPA-CRISPR/Cas12a的牛病毒性腹泻病毒检测方法的建立及应用
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作者 蒙琦 常亮 +2 位作者 杨明 曹映辉 贺泂杰 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期80-88,共9页
本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,... 本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a方法。选取BVDV的E0蛋白基因序列为基础,设计CPA特异性引物。同时,依据CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物,并优化了RT-CPA-CRISPR/Cas12a反应体系,此外,借助建立的该方法,开展了临床样品的检测。结果显示:所建立的检测方法对BVDV的最低检出限为8.0 copies/μL,并具有高度特异性,对42份临床样品检测显示,该方法与传统PCR方法的一致性好,符合率能达到92.86%。该研究建立了牛病毒性腹泻病毒的RT-CPA-CRISPR/Cas12a检测方法,为该病的诊断提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 交叉引物恒温扩增技术 CRISPR/cas12a 灵敏度 特异性
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CRISPR/Cas9系统在家畜生殖细胞中的研究进展 被引量：1
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作者 解雅茹 金昊延 +2 位作者 孔辰 蔡蓓 张令锴 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期479-491,共13页
生殖细胞是生命体遗传物质传递的主要载体,在家畜育种过程中发挥重要作用。人们对畜产品需求的不断增加促进了精确育种技术的发展。基因编辑技术显著提升基因强化和疾病治疗成效,这一进展凸显了将该技术应用于家畜生殖细胞研究的重要性... 生殖细胞是生命体遗传物质传递的主要载体,在家畜育种过程中发挥重要作用。人们对畜产品需求的不断增加促进了精确育种技术的发展。基因编辑技术显著提升基因强化和疾病治疗成效,这一进展凸显了将该技术应用于家畜生殖细胞研究的重要性。与其他基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12系统的研究较为深入。CRISPR/Cas技术已在多项研究中取得突破性进展,被视为一种极有潜力的育种改良手段。本文主要针对两种CRISPR/Cas系统及CRISPR/Cas9系统在家畜生殖细胞中的应用进行综述,对家畜生殖细胞形成过程进行简要概括,阐述CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12系统的原理、构成和衍生技术,介绍CRISPR/Cas9系统在家畜生殖细胞中的应用,对基因编辑技术广泛应用于家畜生殖细胞进行展望,旨在为未来畜牧基因编辑领域的研究提供参考。 展开更多
关键词 基因编辑技术 CRISPR/cas9系统 CRISPR/cas12系统 家畜生殖细胞
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基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系
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作者 王楠 杜伟伟 +7 位作者 王婉洁 王悦 袁茂莎 聂雨欣 孙亚茹 刘志国 吴添文 牟玉莲 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期1966-1976,共11页
【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因... 【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因与公猪精液品质性状之间的关系奠定基础。【方法】利用CRISPOR在线网站在猪WIP 1基因g.37536832 C>A位点附近区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX458-GFP载体;通过T7E1酶切试验检测3条sgRNA活性,选择效率较高的sgRNA。构建Donor载体,并将其与sgRNA载体共同转染至ST细胞,采用流式细胞术将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的阳性细胞进行富集和单克隆细胞筛选,并对筛选出的单克隆细胞进行基因型鉴定。【结果】质粒测序结果表明,成功将3条sgRNA连接至pX458-GFP载体上;T7E1酶切结果显示,转染pX458-GFP-sgRNA1和pX458-GFP-sgRNA2质粒组产生了切割,效率分别为24%和27%,而转染pX458-GFP-sgRNA3质粒组未检测到切割,因此选择pX458-GFP-sgRNA2质粒进行试验。成功构建Donor载体,并将pX458-GFP-sgRNA2和Donor载体共转染至ST细胞。基因型鉴定结果显示,获得的269株单克隆中有205株细胞发生了基因编辑,基因编辑效率为76%,其中9株为WIP 1基因g.37536832 C>A位点纯合突变的ST细胞,精确突变效率为3%。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系,为深入研究WIP 1基因对公猪精液品质的影响提供了良好的细胞模型。 展开更多
关键词 CRISPR/cas9 WIP 1基因 ST细胞系
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