本文旨在探究富含天冬氨酸尾1的单通道膜蛋白(Single-pass Membrane Protein With Aspartate Rich Tail1,Smdt1)对C3H10T1/2细胞增殖和成脂分化的调控效应。本研究将Smdt1基因的过表达和干扰载体转染至C3H10T1/2细胞模型,采用qPCR方法...本文旨在探究富含天冬氨酸尾1的单通道膜蛋白(Single-pass Membrane Protein With Aspartate Rich Tail1,Smdt1)对C3H10T1/2细胞增殖和成脂分化的调控效应。本研究将Smdt1基因的过表达和干扰载体转染至C3H10T1/2细胞模型,采用qPCR方法量化了增殖和成脂分化关键基因的表达水平变化,利用EdU染色检测细胞增殖活力,油红O染色方法鉴定脂滴积累的状态;进一步通过String database、Bio GRID、Int Act、GeneMANIA、DAVID和Genecard数据库构建Smdt1蛋白互作网络图。结果显示,在C3H10T1/2细胞中过表达Smdt1,极显著提升了增殖标志基因Pcna、Ki67、Cdk1及Cdk4的表达,EdU阳性细胞比例反映了细胞增殖速率加快;Smdt1极显著促进成脂分化关键基因Pparγ、Fabp4、-Adipoq的表达量,显著促进了Cebpα、Cebpβ的表达量,脂滴数量变多。在C3H10T1/2细胞体系中,干扰Smdt1,与增殖紧密相关的标志基因,包括Ki67、Pcna及Cdk1,其表达水平极显著降低,Cdk4的表达也呈现显著降低的趋势,反映在EdU增殖检测中,阳性细胞数量明显减少,细胞增殖活性受到抑制。进一步干扰Smdt1后,成脂分化途径的关键调控基因Cebpα、Pparγ、Cebpβ、Fabp4、Adipoq的表达均极显著降低,细胞内脂滴的数量也显著减少,细胞成脂分化能力削弱。蛋白功能预测发现,Smdt1能够与Mcu相互作用,参与线粒体钙离子转运、摄取和稳态。本研究发现Smdt1可以促进C3H10T1/2细胞增殖和成脂分化,为脂肪沉积的研究提供了新的方向。展开更多
目的:探讨小豆蔻明抑制C3H10T1/2细胞成脂分化的作用机制。方法:观察C3H10T1/2细胞成脂过程形态学变化,采用MTS法、油红O染色法、GAP-PAP酶法检测小豆蔻明对C3H10T1/2细胞增殖、成脂分化以及胞内甘油三酯含量的影响,采用RT-PCR与Western...目的:探讨小豆蔻明抑制C3H10T1/2细胞成脂分化的作用机制。方法:观察C3H10T1/2细胞成脂过程形态学变化,采用MTS法、油红O染色法、GAP-PAP酶法检测小豆蔻明对C3H10T1/2细胞增殖、成脂分化以及胞内甘油三酯含量的影响,采用RT-PCR与Western Blot技术检测小豆蔻明对C3H10T1/2细胞PPARγ、C/EBPα和FABP4 m RNA以及蛋白表达的影响。结果:60、80、100μmol/L小豆蔻明能够显著抑制C3H10T1/2细胞存活率(P<0.01);5、10、30μmol/L小豆蔻明能够抑制C3H10T1/2细胞脂滴的形成,从而抑制成脂分化;5、10、30μmol/L小豆蔻明能够显著降低细胞中甘油三酯的含量(P<0.05,P<0.01);10、30μmol/L小豆蔻明能够显著下调PPARγ、C/EBPα和FABP4 m RNA的表达(P<0.05,P<0.01);5、10、30μmol/L小豆蔻明能够显著降低成脂关键转录因子PPARγ、C/EBPα和成脂分化标志因子FABP4蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。结论:小豆蔻明通过下调PPARγ、C/EBPα、FABP4 m RNA以及蛋白表达抑制细胞成脂分化并降低胞内甘油三酯含量。展开更多
该文研究了在诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化过程中miR-155的作用及其是否是通过调控BMP9/Smad(bonemorphogenetic protein 9/drosophila mothers against de-capentaplegic)信号通路发挥作用。在诱导C3H10T1/2细胞成骨分...该文研究了在诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化过程中miR-155的作用及其是否是通过调控BMP9/Smad(bonemorphogenetic protein 9/drosophila mothers against de-capentaplegic)信号通路发挥作用。在诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程中,采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)检测miR-155水平的变化。转染miR-155模拟剂(miR-155)至C3H10T1/2细胞后,miR-155水平显著增高(P<0.001),而转染其抑制剂(anti-miR-155)至C3H10T1/2细胞后,miR-155水平显著降低(P<0.001)。转染后成骨诱导培养基诱导成骨7 d,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及染色结果显示,miR-155能显著降低C3H10T1/2细胞成骨分化过程中的ALP活性(P<0.01)、减弱ALP染色,而anti-miR-155则能逆转其作用。成骨诱导14 d茜素红S染色结果显示,miR-155组钙盐结节较对照组少,下调miR-155的水平后,钙盐沉积结节增多。q RT-RCR检测结果显示,miR-155显著降低BMP9 m RNA水平(P<0.001),且miR-155组成骨基因Runx2和ALP表达均显著低于对照NC组(P<0.05、P<0.01)。Western blot检测BMP9、Runx2和p-Smad1/5/8蛋白质水平,结果显示,miR-155组蛋白质水平均显著降低(P<0.01、P<0.05、P<0.001)。该研究结果提示,miR-155对C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制BMP9/Smad信号通路发挥作用的。展开更多
以骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)作为诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2定向成骨分化的细胞因子,观察过表达S100A6对成骨分化的影响。用重组腺病毒AdBMP9与AdS100A6共感染C3H10T1/2细胞,随后检测成骨分化标志物,包括...以骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)作为诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2定向成骨分化的细胞因子,观察过表达S100A6对成骨分化的影响。用重组腺病毒AdBMP9与AdS100A6共感染C3H10T1/2细胞,随后检测成骨分化标志物,包括Runx2、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨桥素(osteopontin,OPN)和钙盐沉积;检测方法包括免疫细胞化学、ALP染色、活性分析以及茜素红S染色;同时,用Western blot检测β-catenin的表达。过表达S100A6对所诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的早期指标Runx2的蛋白水平无明显影响(P>0.05;ICC法),对第7天的ALP和第18天钙盐的沉积也无明显影响(P>0.05);但是,能够引起第12天的OPN升高(P<0.05);同时,S100A6对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中的β-catenin水平的影响在第3、7天不明显(P>0.05),但在第12天时可致β-catenin水平下调(P<0.05)。过表达S100A6可促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中OPN的表达,但对最终的成骨分化无明显影响。展开更多
背景:诱导骨髓基质干细胞成骨条件的优化与探讨是再生医学研究的热点。前期实验发现Wnt7b在骨发育中的作用,此次实验是前期工作的延续。目的:构建Wnt7b重组反转录病毒载体,观察其在C3H10T1/2中的表达。设计、时间及地点:细胞学体外观察,...背景:诱导骨髓基质干细胞成骨条件的优化与探讨是再生医学研究的热点。前期实验发现Wnt7b在骨发育中的作用,此次实验是前期工作的延续。目的:构建Wnt7b重组反转录病毒载体,观察其在C3H10T1/2中的表达。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-01/2008-08在华盛顿大学医学院和同济大学附属第十人民医院中心实验室完成。材料:pXy-Wnt7b购于ATCC公司,载体pCIG-IRES-EGFP,pLef-Luciferase,pCMV-Rennilla,反转录病毒载体pSFG和包装细胞GP293由华盛顿大学医学院提供。方法:用多步亚克隆技术构建目的基因Wnt7b和标记基因加强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)双表达重组反转录病毒载体pSFG-Wnt7b-IRES-EGFP,在条件培养液中经GP293包装,并在常规培养液中释放出假病毒并将其转染C3H10T1/2细胞,检测成骨活性诱导中的作用和荧光素酶报告基因检测信号转导通路。主要观察指标:①Wnt7b重组反转录病毒转染C3H10T1/2细胞的表达。②Wnt7b诱导C3H10T1/2碱性磷酸酶生成分析。③Wnt7b信号转导分析。结果:构建目的基因的Wnt7b和标记基因EGFP双表达重组反转录病毒载体能够高效地表达,转染C3H10T1/2细胞后能诱导碱性磷酸酶的生成。Wnt7b信号转导分析可见Wnt7b成骨作用通过Noncanonical途径。结论:Wnt7b在C3H10T1/2中能高效表达,能显著诱导骨发育的重要标志--碱性磷酸酶的生成,Noncanonical途径在其中起重要作用。展开更多
文摘本文旨在探究富含天冬氨酸尾1的单通道膜蛋白(Single-pass Membrane Protein With Aspartate Rich Tail1,Smdt1)对C3H10T1/2细胞增殖和成脂分化的调控效应。本研究将Smdt1基因的过表达和干扰载体转染至C3H10T1/2细胞模型,采用qPCR方法量化了增殖和成脂分化关键基因的表达水平变化,利用EdU染色检测细胞增殖活力,油红O染色方法鉴定脂滴积累的状态;进一步通过String database、Bio GRID、Int Act、GeneMANIA、DAVID和Genecard数据库构建Smdt1蛋白互作网络图。结果显示,在C3H10T1/2细胞中过表达Smdt1,极显著提升了增殖标志基因Pcna、Ki67、Cdk1及Cdk4的表达,EdU阳性细胞比例反映了细胞增殖速率加快;Smdt1极显著促进成脂分化关键基因Pparγ、Fabp4、-Adipoq的表达量,显著促进了Cebpα、Cebpβ的表达量,脂滴数量变多。在C3H10T1/2细胞体系中,干扰Smdt1,与增殖紧密相关的标志基因,包括Ki67、Pcna及Cdk1,其表达水平极显著降低,Cdk4的表达也呈现显著降低的趋势,反映在EdU增殖检测中,阳性细胞数量明显减少,细胞增殖活性受到抑制。进一步干扰Smdt1后,成脂分化途径的关键调控基因Cebpα、Pparγ、Cebpβ、Fabp4、Adipoq的表达均极显著降低,细胞内脂滴的数量也显著减少,细胞成脂分化能力削弱。蛋白功能预测发现,Smdt1能够与Mcu相互作用,参与线粒体钙离子转运、摄取和稳态。本研究发现Smdt1可以促进C3H10T1/2细胞增殖和成脂分化,为脂肪沉积的研究提供了新的方向。
文摘目的:探讨小豆蔻明抑制C3H10T1/2细胞成脂分化的作用机制。方法:观察C3H10T1/2细胞成脂过程形态学变化,采用MTS法、油红O染色法、GAP-PAP酶法检测小豆蔻明对C3H10T1/2细胞增殖、成脂分化以及胞内甘油三酯含量的影响,采用RT-PCR与Western Blot技术检测小豆蔻明对C3H10T1/2细胞PPARγ、C/EBPα和FABP4 m RNA以及蛋白表达的影响。结果:60、80、100μmol/L小豆蔻明能够显著抑制C3H10T1/2细胞存活率(P<0.01);5、10、30μmol/L小豆蔻明能够抑制C3H10T1/2细胞脂滴的形成,从而抑制成脂分化;5、10、30μmol/L小豆蔻明能够显著降低细胞中甘油三酯的含量(P<0.05,P<0.01);10、30μmol/L小豆蔻明能够显著下调PPARγ、C/EBPα和FABP4 m RNA的表达(P<0.05,P<0.01);5、10、30μmol/L小豆蔻明能够显著降低成脂关键转录因子PPARγ、C/EBPα和成脂分化标志因子FABP4蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。结论:小豆蔻明通过下调PPARγ、C/EBPα、FABP4 m RNA以及蛋白表达抑制细胞成脂分化并降低胞内甘油三酯含量。
文摘背景:诱导骨髓基质干细胞成骨条件的优化与探讨是再生医学研究的热点。前期实验发现Wnt7b在骨发育中的作用,此次实验是前期工作的延续。目的:构建Wnt7b重组反转录病毒载体,观察其在C3H10T1/2中的表达。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-01/2008-08在华盛顿大学医学院和同济大学附属第十人民医院中心实验室完成。材料:pXy-Wnt7b购于ATCC公司,载体pCIG-IRES-EGFP,pLef-Luciferase,pCMV-Rennilla,反转录病毒载体pSFG和包装细胞GP293由华盛顿大学医学院提供。方法:用多步亚克隆技术构建目的基因Wnt7b和标记基因加强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)双表达重组反转录病毒载体pSFG-Wnt7b-IRES-EGFP,在条件培养液中经GP293包装,并在常规培养液中释放出假病毒并将其转染C3H10T1/2细胞,检测成骨活性诱导中的作用和荧光素酶报告基因检测信号转导通路。主要观察指标:①Wnt7b重组反转录病毒转染C3H10T1/2细胞的表达。②Wnt7b诱导C3H10T1/2碱性磷酸酶生成分析。③Wnt7b信号转导分析。结果:构建目的基因的Wnt7b和标记基因EGFP双表达重组反转录病毒载体能够高效地表达,转染C3H10T1/2细胞后能诱导碱性磷酸酶的生成。Wnt7b信号转导分析可见Wnt7b成骨作用通过Noncanonical途径。结论:Wnt7b在C3H10T1/2中能高效表达,能显著诱导骨发育的重要标志--碱性磷酸酶的生成,Noncanonical途径在其中起重要作用。
